血清學檢測和基因分型在ABO疑難血型鑒定中的性能評價

關茵,張國平,劉文超,裴垚昶,郭超群

(1.焦作市中心血站 a.血型室;b.業務科,河南 焦作 454000;2.焦作市第二人民醫院 輸血科,河南 焦作 454000;3.焦作市人民醫院 輸血科,河南 焦作 454000)

ABO血型系統是一種廣泛存在于人類中的遺傳現象,常常被用于獻血、輸血、器官移植等臨床操作中[1]。ABO血型系統是判斷獻血和輸血相容性最基本的指標之一[2]。根據ABO血型系統的分類,人群被分為A、B、AB和O型,不同類型之間應該采取不同的獻血和輸血策略,以避免引起輸血反應等不良后果[3]。在基因測序技術出現后,它成為了ABO血型系統分型鑒定的 “金標準”,因為基因測序能夠非常準確地揭示ABO基因的遺傳信息。同時,利用基因測序技術可以檢測到常規檢測方法無法檢測到的罕見ABO亞型,從而提高檢測的準確性[4]。然而,基因測序技術的成本較高,操作難度大,需要專業人員進行操作和解讀結果,因此在臨床實踐中并不是所有情況下都會使用基因測序技術進行ABO血型鑒定[5]。基因分型檢測和血清學檢測都是常用的血型鑒定方法,不過兩種方法的機理不同,因此在某些方面會存在一些差異[6]。為了比較兩種檢測方法在ABO疑難血型鑒定的差異,本研究通過對106例ABO疑難血型分別進行血清學檢測、基因分型檢測和基因測序,現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2021年10月至2022年10月焦作市中心血站進行血型鑒定的106例疑難血型標本(血清格局反應定型表現為弱抗體標本)。血清學格局見表1。(1)納入標準:①年齡在18周歲以上;②進行血型評估;③入組前6個月內無輸血、獻血史;④了解研究相關內容及利弊,簽署知情同意書。(2)排除標準:①入組前6個月有相關抗血小板等藥物使用史;②存在自身凝血功能障礙;③不愿參與研究;④妊娠期婦女。其中,男52例、女54例;年齡23～75歲;平均(48.64±10.85)歲。

表1 血型血清學格局

1.2 檢測方法

1.2.1基因測序鑒定ABO疑難血型

采集患者口腔黏膜拭子,從樣本中提取出DNA,并進行純化處理,以消除影響測序結果的雜質和污染物。通過PCR技術特異性擴增ABO基因序列,以獲取DNA片段。對PCR擴增所得DNA片段進行高通量測序,可以使用二代測序儀、三代測序儀等設備進行測序。將測序得到的數據與數據庫比對,對比對結果進行分析,判斷樣本中的ABO基因型。抗-H、抗-AB、人ABO反定型用紅細胞購自上海血液生物醫藥有限責任公司;抗-A抗-B試劑購自長春博德生物技術有限責任公司。儀器及試劑盒包括全自動血型分析儀(奧森多公司,型號為AutoVueInnova)、血液基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物技術有限公司)、TaKaRa La Tap酶(日本TaKaRa公司)、DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒(北京TianGen公司)、pMD18-T載體(日本TaKaRa公司))、PCR儀(美國ABI公司)、DNA測序儀(美國ABI公司,型號為PRISM377)、離心機(日本久保田公司,型號為KA-2200)。

1.2.2吸收放散試驗

利用抗-A抗-B抗AB血型定型試劑(人血清)進行吸收放散試驗,采集被檢測者的全血樣本,并將其離心分離出紅細胞。準備吸收劑:將抗A、抗B、抗AB吸附在已知ABO血型的紅細胞上,將其離心沉淀,去除懸浮液。用紅細胞洗滌緩沖液對被檢測者分離出的紅細胞進行洗滌處理。在洗滌后的紅細胞中加入吸附劑,反應一定時間后,離心分離,去除上清液。然后,分別用抗A、抗B、抗AB 3種試劑進行血型的鑒定,根據細胞凝集情況判斷血型。對于吸收實驗結果為疑難血型的樣本,可以進行放散實驗來進一步確定血型。在吸收放散試驗中,通過加入適量的滲透劑,使細胞凝集消失或放散,觀察細胞凝集情況,判斷血型。

1.2.3實時熒光定量PCR試驗

利用人類紅細胞ABO血型基因分型試劑盒檢測A、A205、B、O261del、01、01、02等位基因,采集被檢測者的全血樣本,并將其離心分離出紅細胞。將紅細胞中的DNA提取出來。PCR反應體系準備:準備PCR反應體系,包括PCR引物、熒光標記探針、Taq聚合酶、dNTPs等。將提取出的DNA加入PCR反應體系中進行反應。PCR條件根據具體實驗室的設備和引物可適當調整,常見的反應條件為預變性5 min,95 ℃ 10 min,40個循環(94 ℃ 30 s,60 ℃ 60 s,72 ℃ 30 s),終止延伸72 ℃ 10 min。利用熒光定量PCR設備,檢測反應產生的熒光信號。檢測結果會顯示出被檢測樣本的基因型信息。根據熒光信號檢測結果,將被檢測者的基因型信息轉化為表型信息,比對參考文獻,判斷被檢測者的ABO血型。

1.3 統計學處理

采用SPSS 22.0統計軟件進行數據分析,計數資料用頻數和百分數(%)表示,進行χ2檢驗;檢測方式與金標準結果的差異比較采用配對χ2檢驗。檢測方式與金標準結果的一致性采用Kappa配對檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方式檢測結果分析

106例疑難血型標本基因測序結果顯示,陽性有46例,陰性有60例。吸收放散試驗檢測結果中,陽性有48例,陰性有58例;實時熒光定量PCR檢測結果中,陽性有47例,陰性有59例。吸收放散試驗檢測結果、實施熒光定量PCR結果與基因測序檢測結果對應,吸收放散試驗結果與基因測序結果比較差異無統計學意義(P=0.845>0.05),實時熒光定量PCR結果與基因測序結果比較差異無統計學意義(P>0.999)。見表2。

表2 兩種檢測方式與基因測序的比較

2.2 兩種檢測方式與金標準檢測結果一致性分析

根據兩種檢測方式與基因測序(金標準)檢測結果的對應情況,進行一致性分析。吸收放散試驗結果與基因測序結果呈中度一致性(Kappa=0.503,P<0.001),實時熒光定量PCR結果與基因測序結果的一致性很好(Kappa=0.904,P<0.001)。Kappa值與符合度的關系見表3。

表3 Kappa值的范圍與符合度的關系

2.3 兩種檢測方式診斷效能比較

實時熒光定量PCR方式的診斷準確率、靈敏度、特異度均高于吸收放散試驗,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 兩種檢測方式的診斷效能比較(%)

3 討論

ABO血型系統是判斷獻血和輸血相容性最基本的指標之一[7]。根據ABO血型系統的分類,人群被分為A、B、AB和O型,不同類型之間應該采取不同的獻血和輸血策略,以避免引起輸血反應等不良后果。然而,ABO血型系統的分型鑒定檢查率低可能會導致誤診和漏診等問題[8-9]。例如,在輸血操作中,如果沒有正確地區分供者和接受者的ABO血型,就有可能引起輸血反應,嚴重時可能會導致死亡[10]。因此,在臨床操作中,對于ABO血型的檢查和判定應該嚴格把關,以確保操作的準確性和安全性。而ABO血型的檢查方式便成了其關鍵。

本研究中,通過對106例ABO疑難血型實施血清學檢測(吸收放散實驗)等,同時對其實施基因分型檢測(熒光定量PCR試驗),以基因測序結果為金標準,結果發現血清學檢測所得結果與基因測序結果一致性為重度,基因分型檢測所得結果與基因測序結果一致性較好。這說明二者都能夠提供準確的鑒定結果,這與陳萍等[11]的研究結果相符。這是由于基因分型檢測是通過對樣本DNA進行PCR擴增,然后使用特異性探針或特異性引物擴增位點來確定基因的亞型[12]。在ABO血型系統中,人體有A、B、O 3種亞型,其中A和 B亞型均由一種轉移酶的表達控制,而O亞型則沒有轉移酶的表達。因此,基因分型檢測可以通過擴增ABO基因的關鍵位點來判斷患者所屬的血型[13]。血清學檢測則是通過將患者的血清和已知血型的紅細胞混合反應,觀察是否出現凝集或溶解等現象來確定其所屬的血型。這種方法利用患者體內產生的抗體與被試血液中表面抗原的結合反應來完成[14]。在ABO血型系統中,如果患者血清中存在對應于紅細胞表面A抗原或B抗原的抗體,則當這些抗體分別與被試血液中的A抗原或B抗原相遇時會出現凝集現象,從而確定其血型。因此,二者均可以提供準確的鑒定結果。

通過比較血清學檢測和基因分型靈敏度、特異度可知,兩種檢查方式所得特異度、靈敏度存在較大差異,基因分型靈敏度、特異度更高。這是由于基因分型檢測技術對于一些罕見的ABO亞型和變異型的檢測能力更強。這些亞型和變異型一般無法通過血清學方法檢測出來,但是熒光定量PCR試驗可以檢測出其特定基因序列,從而進行精確定位和鑒定。

基因分型檢測和血清學檢測是兩種常用的血型鑒定方法,各自具有一些優點和缺點。首先,基因分型檢測技術具有高度的準確性和可重復性。基因分型檢測是直接檢測基因序列來確定血型的,結果不受樣本中抗體的影響,并且能夠準確地檢測出一些罕見的ABO亞型和變異型[15-16]。此外,基因分型檢測技術還具有較高的標準化和自動化程度,能夠大大降低人為因素和實驗誤差的干擾。其次,基因分型檢測技術更加快速、高效和節約成本。相對于血清學檢測需要多次反應和操作,基因分型檢測只需要進行1次PCR反應即可獲得鑒定結果[17]。并且,基因分型檢測的樣本準備簡單,不需要進行特別處理,相對更加快捷和節省成本。與此相比,血清學檢測也有一些優點。例如,在某些情況下,血清學檢測能夠提供更詳細的信息,例如同時檢測多種抗體、檢測Rh因子等[18-19]。此外,部分醫院和實驗室可能沒有配備基因分型檢測設備,而血清學檢測設備則普及度更高,更加便于使用。但對于一些疑難血型,由于基因變異、突變等原因,可能導致血清學檢測無法準確鑒定血型,此時需要進行基因分型檢測。相比于血清學檢測,基因分型檢測有更高的準確性和可靠性,可以檢測出較為罕見的ABO亞型和變異型,并且能夠避免人為誤差的干擾。

4 結論

雖然基因分型檢測和血清學檢測有各自的優缺點,但總體上來說,基因分型檢測具有更高的準確性和可靠性,更快速、高效且更加節約成本,因此在臨床診斷和疾病預防控制中具有廣泛的應用前景。