匹莫齊特對脂多糖誘導RAW264.7細胞誘導型一氧化氮合成酶表達的調控及其作用機制

劉佳

(鄭州大學第五附屬醫院 輸血科,河南 鄭州 450052)

一氧化氮是機體細胞中參與心血管系統和神經系統信號傳導的重要物質[1-3],但是高濃度的一氧化氮能對機體功能造成損傷,也能對線粒體功能損壞并促進細胞凋亡[4-5]。亦有研究表明在嚴重敗血癥中,高濃度的一氧化氮會引起機體細胞受損[6]。機體一氧化氮由誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)合成產生,其可引起過氧化亞硝基陰離子水平升高,從而引起了許多炎癥疾病的發生[7],因此,抑制機體一氧化氮水平對減輕一氧化氮毒性影響具有重要作用。匹莫齊特(Pimozide)是用于治療精神分裂癥的一種藥物,亦是一種常用的多巴胺受體拮抗劑。Nelson等[8]指出Pimozide可抑制信號傳導及轉錄激活因子通路-5信號通路,且同時具有抗白血病的藥理作用。鑒于此,本研究人員推測信號傳導及轉錄激活因子通路-5信號通路的拮抗劑對巨噬細胞RAW264.7細胞株誘導型一氧化氮合成酶水平表達也可能具有抑制作用,本實驗用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株建立炎癥模型[9],以Pimozide作為工具藥,探討信號傳導及轉錄激活因子通路-5信號通路對iNOS水平表達潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞來源

小鼠巨噬細胞RAW264.7細胞株來源于鄭州大學醫學科學院動物實驗室。

1.2 藥品與試劑

Pimozide對照品(中國維克奇公司,標準品:HPLC≥98%)LPS(日本三荔公司,批號:AC11974);四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑盒(上海貝萬塔生物科技有限公司);蛋白質裂解液試劑盒(上海貝博生物科技公司)、BCA蛋白水平檢測試劑盒(北京拜爾迪生物技術有限公司);Griess法試劑盒(中國上海通蔚賽默飛世爾科技公司);巨噬細胞RAW264.7細胞株總RNA提取試劑Trizol、逆轉錄聚合酶鏈反應試劑盒(上海通蔚生物有限公司)、DMEM培養基(Cell Signaling Technology,美國);雙抗、胎牛血清(南京森貝伽生物科技有限公司)以及SYBR Green實時定量聚合酶鏈反應試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司);總信號傳導及轉錄激活因子通路-5單抗和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)單抗、磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子通路-5單抗(Bioworld,美國);iNOS單抗(Cell Signaling Technology,美國)。

1.3 主要儀器

酶聯免疫細胞儀(Bio-Rad,美國),ABI 7500型實時定量熒光聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)儀(Applied Biosystems,美國)。

1.4 細胞培養

用含10%胎牛血清、100 U·mL-1的青鏈霉素DMEM培養基培養巨噬細胞RAW264.7細胞株,培養條件為37 ℃、5% CO2。

1.5 MTT法檢測細胞活性

在96孔板上,收集對數期巨噬細胞RAW264.7細胞株,密度為以1×104每孔。貼壁過夜后,將給予不同濃度(0、2.5、5、10 μmol·L-1)的Pimozide,孵育24 h后,每孔給予濃度為5 g·L-1的MTT溶液,再進行孵育,孵育時間為4 h,去除含胎牛血清的培養液后,給予150 μL的二甲基亞砜(dimethyl surfoxide,DMSO)溶液,用混勻器混勻10 min,然后于紫外分光光度計490 nm波長測定吸光度(optical density,OD)值。

1.6 Griess法檢測細胞中一氧化氮水平

參照文獻[9-10]以巨噬細胞RAW264.7細胞株濃度為每孔2×105個鋪板于24孔微量板中。細胞貼壁過夜,按實驗目的分組。即空白對照組、Pimozide對照(10 μmol·L-1)組、脂多糖誘導(1 mg·L-1LPS)組。脂多糖誘導組分為1 mg·L-1LPS、1 mg·L-1LPS+2.5 μmol·L-1的Pimozide、1 mg·L-1LPS+5 μmol·L-1的Pimozide、1 mg·L-1LPS+10 μmol·L-1的Pimozide(在脂多糖誘導前25 min給予Pimozide進行處理)亞組,每組重復3次。孵育24 h后測定不同組巨噬細胞RAW264.7細胞株培養上清液中一氧化氮的水平。一氧化氮的抑制率按如下公式計算:R=100%-(N1-N2)/(N3-N2)×100%,其中R為一氧化氮抑制率,N1為受試組一氧化氮水平,N2為空白對照組一氧化氮水平,N3為脂多糖誘導組一氧化氮水平。

1.7 RT-PCR檢測細胞中iNOS mRNA表達

收集巨噬細胞RAW264.7細胞株對數生長期的細胞,以密度為每孔1×106個鋪于6孔微量板中,細胞貼壁過夜。按實驗要求分組和給藥,參見“1.6”方法處理。孵育時間為6 h,參照Trizol法對巨噬細胞RAW264.7細胞總RNA進行獲取。獲取的RNA在紫外分光光度計下檢測后,于RT-PCR分析儀上完成反轉錄,獲取cDNA。合成引物序列如下表[愛必信(上海)生物科技有限公司]。作用條件如下:50 ℃ 2 min;95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,40個循環。獲得的數據采用相對定量的ΔΔCt法進行表示,用iNOS mRNA/GAPDH比值進行評價,并計算iNOS mRNA的抑制率。序列如下:引物序列上游下游iNOS為5’-TCCATGACTCCCAGCACA-3’,5’-CCATCTCCTG-CATTTCTTCC-3’;GAPDH為5’-GGTGAAGGTCG-GTGTGAACG-3’,5’-CTCGCTCCTGGAAGATG-GTG-3’。

1.8 免疫蛋白印跡測定細胞中iNOS、信號傳導及轉錄激活因子通路-5和磷酸化信號傳導及轉錄激活因子通路-5蛋白表達

巨噬細胞RAW264.7細胞株接種同“1.7”,同方法“1.6”給藥和分組。利用蛋白質裂解液試劑盒進行細胞內蛋白提取,提取后的蛋白用BCA法進行定量分析。取蛋白25～45 μg加上樣緩沖液進行混勻煮沸后,用十二烷基硫酸鈉-聚丙酰胺凝膠進行電泳分析。然后轉膜,使用5%脫脂奶粉混雜液進行室溫封閉1 h,放入相應一抗混合液(iNOS、GAPDH、信號傳導及轉錄激活因子通路-5和磷酸化信號傳導及轉錄激活因子通路-5單抗)進行孵育1 h。洗膜后加入二抗反應1 h。洗去多余抗體及稀釋液后開始用試劑盒顯影曝光。Quantify One軟件用于剖析電泳條帶的灰度值。

1.9 統計學方法

2 結果

2.1 Pimozide對巨噬細胞RAW264.7細胞株活性的作用

用0、2.5、5、10 μmol·L-1的Pimozide和/或1 mg·L-1LPS對巨噬細胞RAW264.7細胞進行處理,發現Pimozide和/或LPS均不影響巨噬細胞RAW264.7細胞活性(P>0.05),表明Pimozide和/或LPS對巨噬細胞RAW264.7細胞無顯著細胞毒影響(如圖1)。所以,本研究以下使用的Pimozide對照濃度為10 μmol·L-1,LPS濃度為1 mg·L-1。

A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

2.2 Pimozide對巨噬細胞RAW264.7細胞中一氧化氮釋放的作用

巨噬細胞RAW264.7細胞培養24 h后,空白對照組、Pimozide對照組、LPS誘導組和Pimozide不同濃度組細胞中一氧化氮水平差異有統計學意義(F=25.69,P<0.05);不同濃度Pimozide對巨噬細胞RAW264.7細胞中一氧化氮釋放的抑制率相對比值差異有統計學意義(F=132.49,P<0.05)。而與空白對照組相比,LPS誘導組RAW264.7細胞中一氧化氮水平是升高的,差異有統計學意義(P<0.05)。而與LPS誘導組相比,Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)濃度組巨噬細胞RAW264.7細胞中一氧化氮水平下降,差異有統計學意義(P<0.05),見表1和圖2。

表1 Pimozide對細胞中一氧化氮釋放的影響

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

2.3 Pimozide對巨噬細胞RAW264.7細胞中iNOS mRNA和蛋白表達的影響

巨噬細胞RAW264.7細胞培養24 h后,空白對照組、Pimozide對照組、LPS誘導組和Pimozide各濃度組細胞中iNOS mRNA(F=123.59,P<0.05)和蛋白表達差異(F=23.37,P<0.05)有統計學意義。LPS誘導組RAW264.7細胞中iNOSmRNA和蛋白,與空白對照組比較表達升高,差異具有統計學意義(P<0.05)。Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)濃度組細胞中iNOS mRNA和蛋白與LPS誘導組比較,表達降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2和圖3、4。

表2 各組巨噬細胞RAW264.7細胞中iNOS mRNA和蛋白表達

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

2.4 Pimozide對巨噬細胞RAW264.7細胞磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子通路-5/信號傳導及轉錄激活因子通路-5比值的影響

巨噬細胞RAW264.7細胞對數期培養24 h后,空白對照組、Pimozide對照組、LPS誘導組和Pimozide各濃度組細胞中磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子通路-5/信號傳導及轉錄激活因子通路-5表達水平,差異有統計學意義(F=12.07,P<0.05)(如圖5)。LPS誘導組細胞與空白對照組相較磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子通路-5/信號傳導及轉錄激活因子通路-5比值數增大,而與LPS誘導組相比較,Pimozide中(5 μmol·L-1)、高(10 μmol·L-1)濃度組細胞中磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子通路-5/信號傳導及轉錄激活因子通路-5比值數減少,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3和圖5。

表3 Pimozide對磷酸化的信號傳導及轉錄激活因子通路-5/信號傳導及轉錄激活因子通路-5比值

#與空白對照組比較,P<0.05;A為空白對照組;B為Pimozide對照組;C為1 mg·L-1 LPS誘導組;D為1 mg·L-1 LPS+2.5 μmol·L-1 Pimozide組;E為1 mg·L-1 LPS+5 μmol·L-1 Pimozide組;F為1 mg·L-1 LPS+10 μmol·L-1 Pimozide組。

3 討論

炎癥是機體面對損傷的自我保護機制。巨噬細胞是炎癥反應中的明星成員,巨噬細胞屬免疫細胞,有多種功能:可參與抗原識別和抗原呈遞,有效激活免疫細胞應答,分泌炎癥遞質,形成級聯反應。一氧化氮亦是炎癥中的關鍵角色。有研究表明,通過藥物干預或者基因敲除等技術能夠阻滯一氧化氮的生成,可有效緩解患者或實驗動物的炎癥反應[11-12]。轉錄因子活化進程中1個或數個信號轉導分子被阻斷將導致細胞基因轉錄受抑[13-14]。為了研究信號傳導及轉錄激活因子通路-5信號通路是否對iNOS的表達具有調節作用,需探索信號傳導及轉錄激活因子通路-5阻滯劑Pimozide對iNOS表達以及一氧化氮合成過程中發揮的具體作用。本實驗結果表明,于2.5～10 μmol·L-1之間內的Pimozide,可有效阻滯脂多糖誘導的iNOS蛋白、iNOS mRNA表達以及一氧化氮的釋放。

本實驗也探討了Pimozide對磷酸化信號傳導及轉錄激活因子通路-5蛋白表達水平的影響。有資料結果顯示,磷酸化信號傳導及轉錄激活因子通路-5蛋白在脂多糖誘導3 h后到達峰值[15],本實驗中Pimozide對LPS誘導的磷酸化信號傳導及轉錄激活因子通路-5蛋白水平表達具有阻滯效果。MTT實驗結果顯示,這種阻滯作用與藥物自身的活性相關,而不是通過對巨噬細胞RAW264.7細胞的毒性作用。鑒于氟哌啶醇和利培酮等其他多巴胺受體阻滯劑對iNOS的表達無影響[16],故推測Pimozide對信號傳導及轉錄激活因子通路-5通路的阻滯作用的機制,可能是減少一氧化氮釋放。

4 結論

STAT5抑制劑Pimozide可從蛋白和mRNA層面抑制巨噬細胞RAW264.7細胞中脂多糖誘導的iNOS表達,從而減少一氧化氮的釋放。阻滯磷酸化信號傳導及轉錄激活因子通路-5蛋白水平的表達,有望成為治療一氧化氮引起的炎癥疾病的新手段,因此為更深入的分子生物學研究,還需要做大量工作。