DHCR7基因在胃癌中的表達及其與免疫相關基因的關系

王業忠,楊明華,曹少鋒,梅璐

(鄭州大學第五附屬醫院 消化內科,河南 鄭州 450052)

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一,在全世界所有腫瘤中發病率位于第5位,病死率位居第4位[1]。胃癌的主要治療方式為手術、放療、化療和靶向治療。但胃癌患者多數就診時已為中晚期,治療效果欠佳[2]。近年來,免疫治療在胃癌中取得了重要進展,與常規治療相比,免疫治療通過增強腫瘤細胞的免疫功能,產生抗腫瘤作用。免疫檢查點抑制劑治療是一種最主要的免疫療法。然而,免疫治療并不是對所有患者都有效果,對一部分人療效甚微,甚至完全沒有作用[3-4],因此需要進一步提高免疫治療的效果。另外,胃癌具有高度的異質性,在臨床上表現出不同的組織病理學類型[5],目前仍缺少有助于選擇個性化治療方案的生物標志物。

7-脫氫膽固醇還原酶(7-dehydrocholesterol reductase,DHCR7)是膽固醇合成中的關鍵代謝基因,參與體內膽固醇合成途徑中的前體物質合成,將7-脫氫膽固醇轉化為膽固醇[6]。近年來發現DHCR7在多種腫瘤中呈現異常表達[7-8],但關于胃癌的研究相對較少,因此,本研究通過分析多種數據庫中胃癌的測序數據集,探究DHCR7基因在胃癌中的表達與免疫相關基因的關系,為胃癌的免疫治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 數據庫分析

通過Ualcan(http://ualcan.path.uab.edu/analysis.html)、TIMER(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)數據庫分析DHCR7在不同類型腫瘤中的表達情況。通過GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數據庫[9]、TCGA (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga)數據庫以及GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)數據庫分析胃癌組織和正常組織中DHCR7的表達差異。通過Kaplan-Meier Plotter(www.kmplot.com)數據庫分析DHCR7表達與胃癌患者生存相關性。利用cBioPortal(http://www.cbioportal.org/)數據庫[10]找出與DHCR7共表達的基因,并通過R(Pheatmap)軟件包展示與DHCR7正負相關的基因。

1.2 GEO數據庫數據來源

從GEO數據庫中下載GSE79973基因表達數據,測序平臺為GPL570(HG-U133_Plus_2)Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array;共有10例胃癌組織與配對的癌旁組織。

1.3 基因功能及通路分析

利用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)基因功能注釋分析工具,對與DHCR7基因正負相關基因進行基因本體分析(geneontology,GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)通路富集分析。

1.4 DHCR7表達水平與CD8+T細胞浸潤相關性分析

基于TIMER(http://cistrome.dfci.harvard.edu/TIMER/)數據庫分析DHCR7在胃癌組織中與CD8+T免疫細胞浸潤關系,TIMER數據庫綜合TIMER、XCELL、MCPCOUNTER、 CIBERSORT等算法對TCGA數據庫中的樣本進行免疫細胞浸潤分析,并提供了可視化線上工具[11]。

1.5 統計分析

TCGA數據庫中DHCR7表達值采用兩獨立樣本校正t檢驗。GEO數據庫使用GEO2R在線分析功能,差異有統計學意義的標準為adj.P<0.05且|log2FC|>2,adj.P為調整后的P值,FC為差異倍數。生存分析在Kaplan-Meier Plotter數據庫中采用log-rank檢驗進行。從TCGA數據庫下載DHCR7與免疫相關基因表達數據,并利用GraphPad 8.0軟件中分析繪制相關性統計圖,P<0.05代表差異有統計學意義。TCGA數據庫中DHCR7表達與臨床病理學參數相關性使用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析,采取χ2檢驗或連續校正χ2檢驗。

2 結果

2.1 DHCR7在多種類型腫瘤中高表達

通過分析ULCAN(圖1A)、TIMER(圖1B)數據庫的數據,DHCR7在胃癌、膀胱癌、乳腺癌、結腸腺癌、食管癌、頭頸部癌、肺部鱗狀細胞癌等大多數腫瘤類型中的表達均高于各自的癌旁組織。

A為ULCAN數據庫;B為TIMER數據庫。

2.2 DHCR7基因在胃癌的表達以及與胃癌患者預后相關性分析

通過不同的數據庫分析DHCR7在胃癌患者中的表達情況。首先分析GEPIA數據庫408例胃癌患者和211例正常人的基因表達數據,發現DHCR7的表達高于正常組織,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2A)。TCGA數據庫中384例胃癌患者和37例健康人DHCR7的表達數據也顯示DHCR7在胃癌患者中高表達,差異有統計學意義(P<0.05)(圖2B)。GSE79973芯片數據集的10例胃癌患者和10例健康人DHCR7基因表達數據同樣提示DHCR7在胃癌患者中高表達(P<0.05)(圖2C)。其次分析DHCR7在胃癌患者中高表達是否會影響患者預后,Kaplan-Meier Plotter數據庫基因芯片數據(Affy ID:201790-s-at)顯示DHCR7高表達組患者遠期生存率下降(P<0.05)(圖2D)。以上結果說明DHCR7在胃癌患者中高表達,并且高表達DHCR7與胃癌患者不良預后相關。

A為GEPIA數據庫(*P<0.05)、B為TCGA數據庫、C為GEO數據庫,3種數據庫分析DHCR7基因在胃癌組織與正常組織的表達情況;D為DHCR7基因的高低表達與胃癌患者預后的生存曲線。

2.3 在胃癌中與DHCR7共表達基因分析

進一步分析胃癌中與DHCR7表達相關的基因,使用cBioPortal數據庫得出與DHCR7表達正負相關的基因,并通過R軟件包對相關系數高的基因進行聚類圖分析,在熱圖中可視化了前25個正相關基因(圖3A)和前25個負相關基因(圖3B)。

A為與DHCR7正相關基因聚類分析;B為與DHCR7負相關基因聚類分析。

2.4 DHCR7功能富集分析

為了探究DHCR7在胃癌發生發展過程中發揮的功能,對胃癌中與DHCR7共表達基因中正負相關基因進行功能富集分析,正相關基因的GO分析主要富集在類固醇生物合成過程、線粒體膜、有機磷酸代謝、線粒體組織等相關功能上(圖4A);正相關基因的KEGG通路富集分析主要富集在類固醇生物合成、萜類骨架的生物合成、碳代謝、脂肪酸代謝、氨基酸的生物合成等通路(圖4B),負相關基因的GO分析富集在白細胞激活、免疫應答調節、調控細胞因子、T細胞激活等免疫功能上(圖5A);負相關基因的KEGG通路富集分析富集在參與調節IgA產生的腸道免疫網絡、Toll樣受體信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用等免疫相關信號通路(圖5B)。

A為GO分析;B為KEGG分析。

A為GO分析;B為KEGG分析。

2.5 DHCR7與CD8+T細胞以及招募CD8+T細胞相關趨化因子的相關性分析

上述功能富集分析結果提示,DHCR7基因表達可能在胃癌免疫微環境發揮免疫抑制作用,進一步分析DHCR7與免疫系統中重要的抗腫瘤免疫細胞CD8+T細胞之間的相關性, XCELL(圖6A,r=-0.346,P<0.05)、CIBERSORT(圖6B,r=-0.195,P<0.05)、 MCPCOUNTER(圖6C,r=-0.113,P<0.05)、TIMER(圖6D,r=-0.241,P<0.05)4種分析方法均顯示DHCR7基因與CD8+T細胞具有較高的負相關性,并且DHCR7基因與招募CD8+T細胞相關的趨化因子CCL5(圖6E,r=-0.42,P<0.05)、CXCL9(圖6F,r=-0.20,P<0.05)、CXCL10(圖6G,r=-0.13,P<0.05)、CXCL13(圖6H,r=-0.41,P<0.05)也具有很高的負相關性,提示DHCR7可能是通過調控CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13的表達進而影響CD8+T細胞的浸潤。

A為XCELL;B為CIBERSORT;C為MCPCOUNTER;D為TIMER。4種算法進行免疫浸潤評估,分析DHCR7基因與CD8+T細胞浸潤關系;DHCR7與招募CD8+T細胞相關趨化因子(E為CCL5;F為CXCL9;G為CXCL10;H為CXCL13)的相關性分析。

2.6 DHCR7與免疫激活相關基因的相關性分析

為了進一步探討DHCR7是否參與免疫相關調節機制,本研究分析了DHCR7與免疫激活相關基因(IFN-γ、GZMB、GZMH、GZMK、PRF1、IL2)的相關性(圖7A～F),結果發現DHCR7與這些免疫分子均呈負相關性,其中IFN-γ(r=-0.20,P<0.05);GZMB(r=-0.16,P<0.05);GZMH(r=-0.28,P<0.05);GZMK(r=-0.49,P<0.05);PRF1(r=-0.21,P<0.05);IL2(r=-0.27,P<0.05)。

分析TCGA數據庫胃癌中DHCR7與免疫激活相關基因(A為IFN-γ;B為GZMB;C為GZMH;D為GZMK;E為PRF1;F為IL2)的相關性。

2.7 胃癌組織中DHCR7的表達與患者臨床病理學特征的關系

最后,本研究對TCGA數據庫中DHCR7表達與胃癌患者臨床特征進行了分析(表1),結果發現DHCR7表達與胃癌患者年齡呈正相關(P<0.001),而與患者性別(P=0.068)、腫瘤浸潤深度(P=0.333)、淋巴結轉移(P=0.912)、遠端轉移(P=0.655)以及分期(P=0.462)無相關性。

表1 TCGA數據分析DHCR7表達與胃癌患者臨床 病理學特征的關聯(n)

3 討論

腫瘤的代謝重編程是維持腫瘤惡性生物學行為的重要方式,腫瘤的代謝異常能夠使腫瘤在缺氧和營養缺乏的環境中獲得生存,并且代謝產物更能夠抑制免疫反應,有助于腫瘤逃避宿主的免疫殺傷[12]。例如,磷酸甘油酸脫氫酶(phosphoglycerate dehydrogenase,PHGDH)是絲氨酸代謝的關鍵基因,該基因能夠調控巨噬細胞的極化,抑制PHGDH基因表達,可以增強干擾素-β(interferon-β,IFN-β)介導的抗病毒先天免疫[13]。在腫瘤微環境中吲哚胺2,3-雙加氧酶可以催化色氨酸分解代謝為犬尿氨酸,進而激活CD4+T細胞中的芳烴受體,使其分化為免疫抑制調節T細胞(Treg細胞)[14]。一些免疫抑制細胞如Treg細胞、M2型巨噬細胞表達的精氨酸酶1通過降解精氨酸抑制免疫反應,在腫瘤微環境中通過補充精氨酸或抑制其降解,同時聯合細胞程序性死亡-配體1免疫檢查點抑制劑治療,可以顯著提高免疫療效[14]。因此,研究腫瘤微環境中能夠產生免疫抑制性的關鍵代謝基因以及如何調控腫瘤微環境是提高腫瘤免疫治療的有效策略。

DHCR7作為膽固醇合成的關鍵代謝基因,可以將7-脫氫膽固醇轉化為膽固醇,參與調控膽固醇與維生素D3的動態平衡[15]。研究結果顯示,DHCR7在宮頸癌中高表達,高表達DHCR7可能是宮頸癌預后不良的生物標志物[7]。在膀胱癌中,DHCR7可以通過調控PI3K/AKT/mTOR信號通路促進腫瘤發生[8]。另有研究結果顯示,抑制膽固醇代謝通路中的DHCR7能引起7-脫氫膽固醇積累,進而激活絲氨酸/蘇氨酸激酶3和干擾素調節因子3,導致病毒感染后IFN-β的提高和抗病毒反應,為膽固醇代謝重編程調控天然免疫提供了新的研究思路[16]。本研究通過分析多種數據庫中胃癌的測序數據集,探究DHCR7基因在胃癌中的表達及其在胃癌免疫微環境中的作用,GEPIA數據庫、TCGA數據庫以及GEO數據庫3個數據庫的結果均發現DHCR7在胃癌患者中高表達,接下來分析DHCR7在胃癌的高表達是否可作為胃癌預后的潛在生物學分子標志物,結果發現DHCR7高表達胃癌患者遠期生存率低,提示其可作為胃癌患者手術后轉移、復發等不良預后的生物學標志物,為評估胃癌患者的生存期提供基礎。以上結果說明DHCR7在胃癌的發生發展中可能發揮了重要作用,進一步探究DHCR7是通過何種機制影響胃癌進展,從cBioPortal數據庫中獲得了與DHCR7的共表達基因,并在熱圖中可視化了前50個正相關基因和前50個負相關基因。使用Metascape數據庫分析了正負相關基因的GO和KEGG通路。負相關基因的GO分析富集在白細胞激活、免疫應答調節、調控細胞因子、T細胞激活等免疫功能上;負相關基因的KEGG通路富集分析富集在參與調節IgA產生的腸道免疫網絡、Toll樣受體信號通路、病毒蛋白與細胞因子和細胞因子受體的相互作用等免疫相關信號通路。其中Toll樣受體被視為連接固有免疫和先天免疫的橋梁,通過識別相應的模式識別受體,可以上調細胞因子、趨化因子等激活先天性免疫[17]。這些結果提示胃癌中DHCR7基因表達可能對免疫系統產生一定抑制作用,進而影響免疫系統發揮抗腫瘤作用。由于CD8+T細胞是重要的抗腫瘤免疫細胞,若患者缺乏CD8+T細胞的浸潤,則無法響應免疫檢查點抑制劑的治療。因此,進一步分析了DHCR7與CD8+T細胞之間的相關性,多種免疫評估方法得到的結果均顯示DHCR7基因與CD8+T細胞浸潤呈負相關性,并且與招募CD8+T細胞相關的趨化因子CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13也與DHCR7具有負相關性。鑒于CD8+T細胞免疫應答的激活與某些上調的信號有關[18],接下來分析了DHCR7與免疫激活相關基因(IFN-γ、GZMB、GZMH、GZMK、PRF1、IL2)的相關性,同樣發現DHCR7與這些免疫分子均呈負相關性。最后回歸臨床,分析胃癌組織中DHCR7的表達與患者臨床病理學特征的關系,從而為胃癌的臨床治療提供依據。

綜上所述,DHCR7在胃癌組織中高表達,腫瘤中高表達的DHCR7在胃癌患者中表現出較差的生存率。DHCR7在抑制CD8+T細胞介導的免疫中發揮重要作用,其機制可能是通過調控CCL5、CXCL9、CXCL10、CXCL13趨化因子的表達進而抑制CD8+T細胞的浸潤。同時,DHCR7能夠抑制多種胃癌免疫激活相關基因的表達,提示DHCR7可能通過在腫瘤微環境中誘導免疫抑制機制促進胃癌的發生發展。但此研究僅限于生物學信息分析,后續仍需通過大量的實驗進一步驗證,從而明確DHCR7在胃癌中的調控機制。

4 結論

本研究通過多種數據庫的數據挖掘,探討了DHCR7在胃癌中的表達及其在胃癌免疫微環境中的作用,結果表明DHCR7在腫瘤微環境中發揮了免疫抑制作用,并參與了胃癌的進展,后續通過基因沉默或抑制DHCR7的藥物來阻斷DHCR7表達,可能會提高胃癌免疫治療的效果。靶向DHCR7在胃癌免疫治療中具有良好的治療前景。