標本離心時間對凝聚胺介質法抗體篩檢試驗的影響

尹紅怡，劉 靜，劉樂霞，張 露，劉井東

（河北省滄州中西醫(yī)結合醫(yī)院，河北 滄州 061001）

不規(guī)則抗體篩查在目前的臨床實踐中已經得到廣泛應用，常用的方法有凝聚胺法、經典抗人球蛋白法和微柱凝膠法。其中凝聚胺技術（MPT）因其快速、靈敏、簡便、準確等特點在臨床檢驗工作中被經常使用。在日常血清學試驗中，加入凝聚胺試劑（Polybrene 溶液）后離心可使紅細胞產生非特異性凝集，此種凝集是可逆的，再加入重懸液（Resuspending 液），若標本存在不規(guī)則抗體時則凝集不散開，則表明不規(guī)則抗體篩查試驗結果為陽性；若標本存在不規(guī)則抗體則凝集散開，則表明不規(guī)則抗體篩查試驗結果為陰性[1]。本研究采用凝聚胺技術，使用EDTA-2K 抗凝采血管采血，按照貝索凝聚胺介質試劑說明書操作，將變量定為離心時間，試驗結果觀察時間為2 min，本研究設計了5 組試驗，結果發(fā)現凝聚胺試驗的陽性檢出率不同，凝集強度也存在差異，詳細報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究采集本院2020 年7 月至2023 年6 月年齡段在16 ～72 歲的患者標本，共計7128 例標本。對所有標本均進行不規(guī)則抗體篩查試驗，使用微柱凝膠法和凝聚胺法檢測，凝聚胺法用顯微鏡復核結果。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器

凝聚胺介質試劑（BASO）、抗體篩選紅細胞試劑盒（上海血液中心）、人不規(guī)則抗體檢測用3%紅細胞試劑盒（奧森多）、血型試劑質控試劑盒（上海血液中心）、一次性使用試管（KANGJIAN）、單道可調移液器（大龍）、醫(yī)用離心機BASO2020-2、醫(yī)用離心機BY-320A（北京白洋）、抗人球蛋白（IgG）檢測卡（奧森多）、全自動血型分析系統VISIONMax（奧森多）、光學顯微鏡（OLYMPUS-CX33）。

1.2.2 檢測方法

獲取血樣后，采用醫(yī)用離心機BY-320A 在室溫下以3000 r/min 轉速離心3 min 待用。凝聚胺法：（1）取試管三支，共5 組，各加入被檢血漿2 滴，分別加入3%～5%篩檢紅細胞各1 滴。（2）用移液器各加LIM 0.65 mL 混勻，再各加Polybrene 溶液2 滴，混勻。（3）用BASO離心機以3400 r/min 轉速（相當于1000 g 離心力）離心，分別離心10 s、20 s、30 s、45 s、120 s，然后倒掉上清液，不瀝干，使管底殘留0.1 mL 液體。（4）輕搖試管，目測紅細胞是否凝集，如無凝集，則需重做。（5）最后加入Resuspending 液2 滴，輕搖試管使紅細胞混合并觀察結果。微柱凝膠法：嚴格按照全自動血液分析系統的檢測說明書，規(guī)范進行上機操作，檢測不規(guī)則抗體。

1.3 判斷標準

凝聚胺法陽性結果：凝集不散開，仍出現顆粒性或塊狀凝集，是紅細胞抗原抗體結合的特異性反應，其中4+為紅細胞凝集成一大塊，背景清晰；3+為紅細胞凝集成數個小塊，背景尚清晰；2+為紅細胞凝塊分散成數個小塊，背景可見游離紅細胞；1+為肉眼可見大顆粒，周圍有較多游離紅細胞。鏡下陽性：凝集散開，滴入玻片用光學顯微鏡觀察是否凝集，鏡下聚集成團狀，是紅細胞抗原抗體結合的特異性反應；陰性結果：凝集散開，滴入玻片用光學顯微鏡觀察是否凝集，鏡下不凝集表示由Polybrene 溶液引起的非特異性凝集。詳見圖1。質控措施：試驗操作的標準化，確保試驗操作步驟的一致性，包括試劑的準備、滴加順序和數量、觀察時間點等。對照試驗：使用已知陽性和陰性樣本進行對照，以驗證試驗過程的有效性和可靠性。重復性：對關鍵樣本進行重復試驗，以確保結果的一致性和可重復性。顯微鏡校準：確保顯微鏡的清晰度和放大倍數準確，以便準確觀察紅細胞的凝集情況。記錄和報告：詳細記錄試驗觀察結果，并在報告中明確指出凝集的程度和評級。微柱凝膠法：以全自動血型分析系統判別，并經人工審核結果。

圖1 凝聚胺法結果判定圖

1.4 觀察指標

檢測后，比較凝聚胺法不同離心時間的陽性檢出率和凝集強度。比較微柱凝膠法與凝聚胺法的檢測結果。

1.5 統計學方法

采用IBM SPSS 22.0 軟件對本文數據進行統計學分析。不規(guī)則抗體靈敏度、結果的陽性率用例數和%表示，采用卡方（χ2）檢驗，計量資料用±s表示，采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 凝聚胺法不同離心時間的檢測結果分析

在5 組不同時間的凝聚胺試驗中，離心時間10 s 時，陽性檢出率77.6%（66/85），20 s 時，陽性檢出率80.0%（68/85），30 s 時，陽性檢出率89.4%（76/85），45 s 時，陽性檢出率84.7%（72/85），120 s 時，陽性檢出率85.9%（73/85），其中χ2值為4.391，P值為0.036。詳見表1。

表1 凝聚胺法不同離心時間陽性率比較[%（例）]

2.2 抗-E 和抗-D 不同離心時間后強度比較

在血型試劑質控試劑盒的抗體凝集強度檢測時，其中抗-D 的凝集強度和20 s 組、30 s 組、45 s 組結果一致，低于120 s 組的結果；而10 s 組抗-E 的凝集強度是-，20 s 組的凝集強度是+（用光學顯微鏡觀察結果），直到30 s 組之后三組的凝集強度可以用肉眼直接觀察到明顯的凝集，強度達到++。詳見表2。由此可見，10 s 的離心時間不能滿足臨床試驗需要。

2.3 血漿微柱凝膠法與凝聚胺法檢測結果對比

檢測后經對比可知，微柱凝膠法陽性例數82 例，凝聚胺法綜合陽性例數76 例，由表3 計算可知，兩種方法的真陽性率（靈敏度）對比差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 血漿微柱凝膠法與凝聚胺法檢測結果對比[%（例）]

3 討論

為保證輸血安全，臨床需要在輸血前進行血型檢測、不規(guī)則抗體篩查、交叉配血試驗，其結果越準確越能減少輸血不良反應的發(fā)生[2]。凝聚胺法操作簡單，靈敏度高，試驗時間短，這是它的優(yōu)點。本研究中120 s 組的陽性檢出率和凝集強度雖然更高，但耗時長，不利于發(fā)揮凝聚胺法的優(yōu)點；30 s 組和45 s 組陽性率也相對較高，一些較弱的凝集亦能檢測出來，不容易漏檢不規(guī)則抗體，耗時短，提高了試驗的特異性和檢出率，能有效提高輸血治療的安全性[3]。微柱凝膠法操作簡單，不易受人工因素影響，陽性檢出率高，結果可以長期保持，易于自動化操作，是較為理想的不規(guī)則抗體檢測方法[4]。我們運用血清學的方法檢測不規(guī)則抗體，實際是對特定抗原抗體的檢測，通常以凝集強度作為判斷的指標，在IgG 類抗體中，除部分抗體如IgG 抗-A、抗-B、抗-D、抗-M等外，大多數的IgG 類抗體不能使紅細胞出現肉眼可見的凝集，這時候就需要在試驗中加入某種介質[5]。通常臨床實驗室使用的方法有凝聚胺法和微柱凝膠法，經典抗人球蛋白法操作繁瑣，易受到實驗者的影響，在這里不做研究。凝聚胺是一種高價陽離子季銨鹽多聚物，它溶解后產生的正電荷可以中和紅細胞膜表面的唾液酸所產生的負電荷，縮短紅細胞間距，使紅細胞產生非特異性凝集[6]。這種非特異性凝集是可逆的，若沒有不規(guī)則抗體存在，則在加入重懸液后凝集消失；若標本中存在不規(guī)則抗體，則凝集不消失。微柱凝膠法是將試驗需要用到的標準稀釋液制作成凝膠，采用微觀柱作為容器灌注，使紅細胞凝膠顆粒分子過濾，這樣凝集的紅細胞便被保留在了微柱中，操作者可通過肉眼讀取凝集結果[7]。

分析凝聚胺法和微柱凝膠法可以發(fā)現，微柱凝膠法陽性檢出率高于凝聚胺法，且靈敏度也高于凝聚胺法，同時這兩種檢測方法都存在假陽性。凝聚胺法容易受到冷凝集素、肝素、試劑存放時間的影響，本次研究均使用EDTA采血管，但如果患者使用了肝素治療，依然可能對試驗結果造成影響[8]。而微柱凝膠法容易受到蛋白凝集和血小板聚集的影響，在交叉配血試驗中血小板聚集會造成假陽性，如果受到蛋白凝集的影響，可以在試驗過程中使用生理鹽水稀釋血漿后再進行檢測，以減少假陽性的出現[9]。

醫(yī)務人員要在臨床工作中做好輸血前的篩查試驗，不同情況下采用不同的檢測方法以保證試驗的安全性和時效性。如對于急診需要緊急輸血的患者，使用微柱凝膠法進行交叉配血和抗體篩查，雖然其陽性檢出率更高，但時間過長。這時簡便快速又有效的凝聚胺法就是更好的選擇。對于通過輸血來改善貧血的患者來說，有充足的時間可以進行臨床檢驗，這時微柱凝膠法和凝聚胺法均可采用。對于需要輸血的兒童，因其ABO 及Lewis 等血型系統未發(fā)育完全，故在使用凝聚胺法檢測時應延長離心時間。一些血液病患者、長期輸血患者、多次妊娠者更易產生不規(guī)則抗體，尤其在抗原或抗體較弱時，這種情況下進行抗體篩查時用微柱凝膠法的檢出陽性率更高，而使用凝聚胺法檢測時應延長離心時間。但對于多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者，使用CD38 單抗進行治療時，生理鹽水稀釋不能消除微柱凝膠法的假陽性結果，需要進行二硫蘇糖醇處理。但此法耗時長，易發(fā)生溶血，臨床實驗室應用效果不佳。凝聚胺法能夠不受MM 治療藥物和本身蛋白凝集的影響，是較為理想的檢測方法[10]。

綜上所述，凝聚胺法在臨床輸血治療中是不可或缺的方法之一，其操作便捷、有較高的靈敏度，臨床工作中應根據實際情況選擇合適的檢測方法[11-12]。而改良試驗反應時的離心時間達到30 s 或45 s，在本次研究的不規(guī)則抗體篩查試驗中，能提高凝聚胺法的陽性檢出率，有利于提高臨床輸血的安全性。至于相關的交叉配血試驗，推測也能提高其陽性檢出率，但缺乏進一步研究試驗。