肝癌患者血清IGFBP1的表達及其臨床意義

高瑞環 楊 桂 黎安玲 劉松梅

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)占原發性肝癌病例的75%～85%,是全球第6位最常見的惡性腫瘤和第四大主要死因[1]。由于肝癌早期表現為無癥狀進展,大多數患者在首次就診時就已經進展為肝硬化甚至肝癌[2]。現已明確肝細胞癌的危險因素主要包括乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染、丙型肝炎病毒感染、非酒精性脂肪肝、代謝綜合征、煙草、酗酒、環境毒素等[3]。

IGFBP1(insulin growth factor binding protein 1, IGFBP1)是胰島素樣生長因子結合蛋白超家族的成員,作為主要由肝臟產生的一種分泌性蛋白,廣泛存在于體液和組織細胞中,可以調控胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors,IGFs)的半衰期和生物利用度,IGFBP1與IGF的高親和力可通過抑制IGF與其受體結合,進而抑制胰島素受體信號轉導[4,5]。腫瘤細胞常表現為信號轉導和代謝失調,導致糖攝取增多、線粒體功能紊亂以及抗增殖信號逃逸[6]。研究發現,IGFBP1在腫瘤中的作用具有雙面性,既發揮抑癌作用,又被認為是癌基因[7]。作為一種肝臟分泌的血清蛋白,IGFBP1被證實在多種實體瘤中有著一定的臨床價值,例如食管癌、前列腺癌、胃癌等[8～10]。

近年來有研究指出,慢性丙型肝炎患者血清IGFBP1升高,并且在纖維化階段明顯增加[11]。血清IGFBP1可作為非酒精性脂肪肝患者晚期纖維化的生物學標志物,然而肝癌患者血清IGFBP1的臨床意義尚不明確[12]。此外,慢性乙型肝炎是肝癌最常見的危險因素,雖有研究指出HBV感染抑制HepG2細胞分泌IGFBP1,但尚未見HBV感染與血清IGFBP1關系的研究報道[13]。本研究通過檢測體檢正常對照、慢性乙型肝炎患者、肝癌患者血清IGFBP1的水平,探究肝癌血清IGFBP1變化特征、診斷價值、風險預測等臨床意義以及血清IGFBP1與HBV感染的關系。

資料與方法

1.研究對象:本研究為回顧性研究,采用-80℃凍存的血清標本128份,來源于在武漢大學中南醫院就診的體檢正常對照個體(CTL組,n=32)、慢性乙型肝炎患者(CHB組,n=32)和肝癌患者(HCC組,n=64),并收集相對應的臨床信息和實驗室檢查結果。納入標準:①CHB組臨床診斷標準符合《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》,HCC組臨床診斷標準符合《原發性肝癌診療規范(2019年版)》,CTL組無乙型肝炎感染史且實驗室檢測查結果正常[14,15];②有完善的臨床信息和實驗室檢查結果,至少包括血常規、血清肝腎功能和腫瘤標志物, HBV-DNA或乙型肝炎病毒表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)。排除標準:罹患或合并其他惡性腫瘤。本研究方案經由中南醫院醫學倫理學委員會審批 (倫理學審批號:2017058),患者均簽署知情同意書。

2.儀器試劑: 采用貝克曼AU5800全自動生化分析儀檢測肝功能,貝克曼DX1800全自動化學發光儀測定甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)。血清IGFBP1的檢測采用ELISA試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司),并在PE Enspire多功能酶標分析儀上測定結果, ABI7300型熒光定量PCR分析儀檢測血清HBV-DNA。

3.檢測方法:按照試劑盒的說明書要求,經預實驗確定,使用樣品稀釋液將血清稀釋40倍后,每孔加入100μl稀釋樣品,同時設立標準品孔和空白對照孔。利用酶標儀在450nm讀取吸光度A值。所有的標準品和待測樣品的A值減去空白對照孔的A值后,以吸光值作為縱坐標,以濃度作為橫坐標,制訂標準曲線。待測樣品IGFBP1濃度由標準曲線計算得到。

結 果

1.一般資料和臨床資料:共納入32例正常對照(平均年齡為56.28±12.97歲,男性占81.25%),32例CHB患者(平均年齡為53.06±10.23歲,男性占81.25%),64例HCC患者平均年齡為55.95±11.07歲,其中男性占89.06%。如表1所示,3組間年齡和性別比較,差異均無統計學意義,肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase, AST)、AST/ALT、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、總蛋白、白蛋白(albumin,A)、球蛋白(globulin,G)、A/G、γ-谷氨酰轉肽酶、堿性磷酸酶比較,差異均無統計學意義。

表1 納入研究對象的一般資料和臨床資料

2.組間血清IGFBP1水平的比較:3組間(CTL組、CHB組和HCC組)的血清IGFBP1水平存在差異(H=29.427,P<0.001,圖1A),其中HCC組的IGFBP1水平明顯高于CTL組和CHB組(P<0.05)。然而,CTL組和CHB組的IGFBP1水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。根據HBV-DNA和HBsAg將HCC患者分為HBV陽性患者(HBV-HCC)和HBV陰性患者(HBV+HCC)兩組,HBV-DNA≥20 IU/ml或HBsAg≥0.05IU/ml被認為是HBV陽性,否則為HBV陰性,兩組HCC患者的血清IGFBP1水平比較,差異無統計學意義(P>0.05圖1B),提示HBV感染可能不影響肝癌患者血清IGFBP1的水平。

圖1 組間血清IGFBP1水平的比較

3.血清IGFBP1與AFP的相關性:經典指標AFP由于其較好的肝癌診斷效能,常被用于評價肝癌。經檢驗,3組間(CTL組、CHB組和HCC組)的血清AFP水平比較,差異有統計學意義(H=61.758,P<0.001,圖2A),其中HCC組的AFP水平明顯高于CTL組和CHB組(P<0.001)。然而,CTL組和CHB組的AFP水平比較,差異無統計學意義(P>0.05)。Spearman分析顯示,血清IGFBP1與AFP呈正相關(r=0.484,P<0.001,圖2B)。這些結果說明血清IGFBP1與血清AFP有較好的一致性,可能與肝癌有關。

圖2 血清IGFBP1與AFP的相關性

圖3 血清IGFBP1的ROC曲線

4.血清IGFBP1與肝功能指標的相關性:為了進一步探究血清IGFBP1是否與肝功能有關,使用Spearman分析IGFBP1與肝功能指標的相關性。如表2所示,血清與肝功能指標ALT、AST、AST/ALT、總膽紅素、直接膽紅素、間接膽紅素、γ-谷氨酰轉肽酶、堿性磷酸酶呈正相關,與總蛋白、白蛋白、A/G呈負相關,提示高水平的血清IGFBP1的水平與較差的肝功能相關。

表2 血清IGFBP1與肝功能指標的相關性

5.血清IGFBP1的診斷效能:為了進一步探究IGFBP1是否對肝癌具有診斷價值,進行ROC曲線的分析與繪制,由于CTL組和CHB組的血清IGFBP1水平并無差異,因此將其合并為非HCC組,結果顯示, ROC曲線的曲線下面積為0.773,差異有統計學意義(AUC=0.773, 95%CI: 0.693～0.852,P<0.001)。血清IGFBP1的診斷正確率為77.3%,最佳診斷界值為39.71,此時的敏感度為56.3%,特異性為85.9%。說明血清IGFBP1具有較好的診斷價值。

6.血清IGFBP1對肝癌的風險評估:為了探究血清IGFBP1是否是肝癌發生的風險因子,將CTL組和CHB組合并為非HCC組,使用二元Logistic回歸分析后,發現在排除了年齡、性別和AFP影響后,血清IGFBP1仍是肝癌的風險因子(OR=1.049,95%CI:1.014～1.084,P=0.005),詳見表3。

表3 血清IGFBP1影響肝癌的二元Logistic回歸分析

討 論

肝癌糖過度消耗、代謝異常以及惡性改變的狀態,部分原因可能是IGF-1、胰島素和葡萄糖的減少,以及IGFBP1表達上升和酮體增加[6]。IGFBP1主要來源于肝臟,因此其與肝臟疾病也密切相關,研究證實,肝癌組織IGFBP1低于正常人和肝硬化患者,IGFBP1可以作為肝癌選擇性治療的反應標志物[16～18]。HMGA2可驅動IGFBP1/Akt途徑從而抑制肝癌細胞的惡性表現[19]。這些研究提示IGFBP1在肝癌中發揮作用。本研究發現,肝癌患者血清IGFBP1的水平較高,并且與較差的肝功能相關,同時血清IGFBP1對肝癌有較好的診斷效能。此外,血清IGFBP1還是肝癌的風險因子,提示血清IGFBP1或許可以作為肝癌患者的血清生物學標志物。值得注意的是,IGFBP1的變化趨勢在肝癌患者血清與肝癌組織中是不一致的,這種現象還出現于肝癌和胰腺癌組織和血清中klotho蛋白的表達,這或許與IGFBP1的分泌過程和腫瘤微環境有關,其中的原因還需要進一步研究[20,21]。

AFP是早期肝癌診斷的主要血清標志物,AFP的診斷敏感度、特異性分別為61.54%和81.73%,此時的診斷正確率為75.00%[22],然而AFP在多種實體腫瘤中均有高表達,敏感度和特異性受到臨床需求的挑戰[23]。目前臨床上已經將血清甲胎蛋白異質體、異常凝血酶原、和血漿游離微小核糖核酸等指標作為肝癌早期診斷的補充指標[15]。本研究發現,血清IGFBP1對肝癌有較好的診斷效能,特異性達到85.9%,而診斷正確率為77.3%,或許可以作為原發性肝癌的補充診斷指標。

眾所周知,HBV感染是肝細胞癌變的重要危險因素,有研究指出,HBV感染患者AFP水平與HBV DNA濃度之間呈正相關,乙肝相關性肝癌患者的血清AFP和PIVKA-Ⅱ升高,并且具有診斷價值,表明AFP和PIVKA-Ⅱ與HBV感染所致肝癌有關[24,25]。而本研究發現,慢性乙肝感染者血清IGFBP1未改變,而且HBV相關肝癌患者的血清IGFBP1的水平與單純肝癌相當,因此HBV感染似乎不影響血清IGFBP1的水平,但仍需更大的樣本量進行驗證。本研究結果有待于擴大樣本量做進一步臨床數據分析或進行深入性實驗研究探究機制。此外,由于本研究主要是為了探究IGFBP1在肝癌中的臨床意義,所以并沒有設置肝硬化組,但這并不影響本研究結論。

綜上所述,IGFBP1在肝癌中的作用及機制可能是復雜的,但對于血清IGFBP1來說,肝癌患者血清中 IGFBP1水平升高對于肝癌的診斷和預測是有重要的臨床意義的。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。