化橘紅微生物限度檢查方法適用性研究

葉寶玉 黃妹齊 陳日檬* 紀小莉 李 蔚

化橘紅又名“化州橘紅”，系廣東道地藥材。其中蕓香科植物化州柚Citrusgrandis‘Tomentosa’習稱“毛橘紅”；柚Citrusgrandis(L.) Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮習稱“光七爪”“光五爪”[1]。化橘紅性溫，味辛、苦，含有多糖、黃酮、香豆素、揮發油等成分[2-3]，具有散寒、燥濕、利氣、消痰功效，用于風寒咳嗽、喉癢痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶等[4-5]。其富含多種活性成分，動物實驗證明具有顯著的抗炎、抗氧化、免疫調節等作用，可用于防治糖尿病、心肌損傷[6-7]。

化橘紅為名貴中藥，目前有針對其本草學[8]、化學成分[9]、藥理作用[10]和臨床試驗[11]等的研究，但缺少對化橘紅微生物限度的相關研究。本研究通過對化橘紅微生物限度檢查法進行方法學驗證，并對其進行微生物安全風險評估，制定有針對性的質量控制標準，規范生產的各個環節，使微生物負荷降低，減少化橘紅的用藥安全風險，促進其作為廣東道地藥材的健康發展。

1 儀器與樣品

1.1 儀器

潔凈工作臺（SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術有限公司），電子天平（MP500B，上海恒平科學儀器有限公司），熱空氣消毒箱（GR-246，上海博迅實業有限公司），高壓滅菌器（GF88DX，致微廈門儀器有限公司），電熱恒溫培養箱（DHP-9082B，上海一恒溫培養箱），霉菌培養箱（HMJ-Ⅲ-250，上海躍進醫療器械有限公司），生化培養箱（HPX-Ⅱ-250，上海躍進醫療器械有限公司），移液器（Thermo Scientific）。

1.2 菌種

本研究所用菌株均為第3代。銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]、金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、乙型副傷寒沙門氏菌[CMCC(B)50094]、大腸埃希菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]均購自廣東環凱微生物科技有限公司。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）（批號200909），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）（批號191112），胰酪大豆胨液體培養基（批號210617），pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（稀釋液）（批號220113），麥康凱液體培養基（批號200308），麥康凱瓊脂培養基（批號200815），木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養基（XLD）（批號200904），RV沙門菌增菌液體培養基（批號200116），腸道菌增菌液體培養基（批號191231），紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基（批號211125），均來自北京陸橋技術股份有限公司。

1.4 樣品

化橘紅，來自江西樟樹成方中藥飲片有限公司，批號20120101。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

根據2020版《中華人民共和國藥典》四部通則1105及1006要求，將各試驗菌制成菌懸液，終濃度為50～100 cfu/ml。

2.2 供試液的制備

稱取一批75 g化橘紅，利用GF88DX高壓滅菌器進行常規滅菌處理，其中用于沙門菌檢查的20 g化橘紅未做滅菌處理。

取已滅菌處理的化橘紅25 g，加稀釋液至250 ml，充分振搖15 min，制得1∶10供試液。取已滅菌處理的化橘紅25 g，加稀釋液至500 ml，充分振搖15 min，制得1∶20供試液。1∶10供試液20 ml，加稀釋液至100 ml，混勻，制得1∶50供試液。取1∶10供試液、1∶20供試液、1∶50供試液各20 ml于沸水浴中加熱30 min，冷卻后分別作為1∶10、1∶20、1∶50耐熱菌檢查用供試液。

2.3 微生物計數方法適用性試驗

2.3.1第一次微生物計數方法適用性試驗

2.3.1.1需氧菌總數試驗試驗組取1∶10的供試液9.9 ml，5份，分別加入5種試驗菌（0.1 ml）混勻，各取1 ml注入培養皿中，傾注TSA，平行制備2皿。供試品對照組：用稀釋液替代菌液，其他操作同試驗組。菌液對照組：取5份9.9 ml的稀釋液，分別加入0.1 ml各菌液，其他操作同試驗組。

2.3.1.2霉菌和酵母菌總數試驗 取9.9 ml 1∶10的供試液各2份，分別加入0.1 ml的白色念珠菌、黑曲霉菌菌液，混勻后取1 ml注入培養皿，傾注SDA，其他操作同需氧菌總數試驗。

2.3.1.3耐熱菌總數試驗取1∶10耐熱菌檢查供試液9.9 ml 5支，其他操作同需氧菌總數試驗。

2.3.1.4結果依據《中華人民共和國藥典》2020版四部通則1108，回收率=（試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數）/菌液對照組平均菌落數×100%，平皿傾注法中各試驗菌的回收率應在50%～200%標準范圍內。由表1可得知，需氧菌、耐熱菌總數回收率試驗中金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的回收率值小于50%，不符合標準要求，故該常規法（1∶10）不適用于檢測化橘紅需氧菌、耐熱菌總數。可采用增加稀釋液的方法，進行方法適用性試驗[12]。霉菌和酵母菌所對應的兩種試驗菌回收率在77%～89%，符合《中華人民共和國藥典》要求。

表1 1∶10供試液需氧菌/耐熱菌總數、霉菌和酵母菌總數方法適用性試驗結果

2.3.2第2次微生物計數方法適用性試驗需氧菌總數試驗：取9.9 ml的1∶20供試液5份，其他操作與“2.3.1”需氧菌總數試驗相同。耐熱菌總數試驗：分別取1∶20耐熱菌總數檢查供試液9.9 ml 5份，其他操作與需氧菌總數相同。由表2可知，金黃色葡萄球菌的回收率在50%～200%范圍內，但枯草芽孢桿菌的回收率小于50%，不符合《中華人民共和國藥典》要求，說明化橘紅對枯草芽孢桿菌具有一定抑制作用，因此將供試品進一步稀釋，進行回收率試驗。

表2 1∶20供試液需氧菌/耐熱菌總數方法適用性試驗結果

2.3.3第3次微生物計數方法適用性試驗需氧菌總數試驗：取9.9 ml的1∶50供試液5份，其他操作同“2.3.1”需氧菌總數試驗。耐熱菌總數試驗：取9.9 ml的1∶50耐熱菌總數檢查供試液5份，其他操作與需氧菌總數試驗相同。由表3可知，5種計數菌的回收率均在50%～200%范圍內，符合《中華人民共和國藥典》要求，即采用該微生物計數方法進行需氧菌、耐熱菌總數回收率試驗。

表3 1∶50供試液需氧菌總數、酵母菌總數方法適用性試驗結果

2.4 控制菌方法適用性試驗

2.4.1試驗組大腸埃希菌：取1∶10供試液10 ml加入100 ml TSB混勻，再加入大腸埃希菌液（不大于100 cfu/ml）1 ml，搖勻后置于30～35 ℃培養24 h。取1 ml上述培養物接種于100 ml麥康凱液體培養基中培養后，劃線接種于麥康凱瓊脂培養基，觀察是否有菌落生長并鑒定。

沙門菌試驗：取制備好的供試品10 g各2份，分別加入100、200 ml TSB混勻，各加入沙門菌液1 ml，30～35 ℃培養24 h。取0.1 ml上述培養物，加入9.9 ml RV沙門增菌液體培養基中培養后，劃線接種于XLD平板，觀察是否有菌落生長并鑒定。

耐膽鹽革蘭陰性菌：取20 ml在23 ℃培養2 h的0.1 g供試液，用TSB稀釋制成0.01 g、0.001 g供試液。取培養后的0.1 g供試液2 ml，分別加入到兩管10 ml腸道菌增菌液體培養基中，每管1 ml，接著兩管分別加入大腸埃希菌液和銅綠假單胞菌液（均不大于100 cfu/ml）。0.01 g、0.001 g供試液同法操作。將以上6支試管置于33 ℃培養48 h后，劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養基平板上培養后，觀察是否有菌落生長并鑒定。

2.4.2對照組供試品對照組用稀釋液替代菌液，其他操作同2.4.1試驗組。陰性對照組用10 ml稀釋液替代供試品，不加菌液，其他操作同2.4.1試驗組。陽性對照組不加入供試品，其他操作同2.4.1試驗組。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗結果

2.5.1大腸埃希菌由表4的結果可知，試驗組和陽性對照組有大腸埃希菌生長，而供試品對照組、陰性對照組無大腸埃希菌生長。

表4 大腸埃希菌微生物檢查方法適用性試驗結果

2.5.2沙門菌化橘紅沙門菌檢查采用直接接種法，TSB體積為100 ml的試驗組未檢出沙門菌，說明化橘紅對沙門菌有一定的抑制作用。當TSB體積為200 ml時，由表5的指示結果可知，試驗組和陽性對照組有沙門菌生長，而供試品對照組、陰性對照組無沙門菌生長。

表5 沙門菌微生物檢查方法適用性試驗結果

由表6結果可知，化橘紅耐膽鹽革蘭陰性菌檢查試驗中腸道菌增菌液體培養基體積為10 ml，試驗組和陽性對照組中各稀釋級（0.1 g、0.01 g、0.001 g）均檢出大腸埃希菌和銅綠假單胞菌，供試品對照組、陰性對照組無目標菌落生長。試驗結果表明耐膽鹽革蘭陰性菌檢查可采用直接接種法。

表6 耐膽鹽革蘭陰性菌微生物檢查方法適用性試驗結果

3 討論

作為中醫藥重要特色和優勢之一的中藥飲片，其質量控制在中藥質量控制中處于薄弱環節[12-13]。患者常需煎煮或泡服中藥飲片，而經過高溫處理后某些污染微生物可能依然能夠存活，會對患者的用藥安全性造成威脅[14]。本研究通過對化橘紅進行微生物限度適用性試驗，可為藥品檢驗機構及藥品生產企業進行該飲片的質量檢查提供檢查方法參考，中藥飲片的用藥安全及微生物質量控制提供支持。

本研究發現采用常規方法將化橘紅制成1∶10稀釋度的供試液進行需氧菌、耐熱菌總數回收試驗時，金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌回收比值不達50%，表明化橘紅含有對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有明顯抑菌作用的成分；采用溶液稀釋法，將化橘紅制成1∶50的供試液后進行試驗，各菌株回收率均符合《中華人民共和國藥典》要求，最終確認用1∶50稀釋度進行化橘紅的需氧菌、耐熱菌總數試驗。采用常規法進行霉菌和酵母菌總數試驗，各菌株回收率均符合《中華人民共和國藥典》要求。采用直接接種法開展控制菌試驗，試驗組均能檢出試驗菌，最終亦確認以直接接種法進行化橘紅控制菌檢查。