基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)分析柴胡-白芍藥對(duì)治療肝損傷的作用機(jī)制

陶純立 馮春艷

肝損傷（liver injury, LI）是一種由于酒精刺激、病毒性肝炎、藥物性肝炎、化學(xué)污染等導(dǎo)致肝臟細(xì)胞凋亡、壞死和纖維化損傷的疾病[1]。LI是多種肝病的起始階段，隨著病情進(jìn)展嚴(yán)重者則會(huì)發(fā)生肝臟纖維化、肝硬化、肝衰竭等[2-3]。因此，阻止LI的發(fā)生和發(fā)展具有重要意義。

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的特點(diǎn)，在疾病的治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。柴胡-白芍作為中醫(yī)疏肝氣常用藥對(duì)，在臨床中常用于治療肝臟損傷性疾病[4]。柴胡為傘形科植物柴胡BupleurumchinenseDC.或狹葉柴胡BupleurumscorzonerifoliumWilld.的干燥根，具有和解表里，疏肝升陽(yáng)之功效[5]。白芍本品為毛茛科植物芍藥PaeonialactifloraPall.的干燥根，具有養(yǎng)血柔肝之功效[6]。有研究報(bào)道，柴胡-白芍配伍后可減輕肝臟炎癥反應(yīng)，提高細(xì)胞色素CYP2E1酶活性，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，發(fā)揮治療LI作用[7-9]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可用于創(chuàng)建基于靶分子、生物學(xué)功能和生物活性化合物的復(fù)雜作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)地反映中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)、多途徑的疾病干預(yù)機(jī)制[10]。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，篩選出柴胡-白芍藥對(duì)的活性成分，以及治療LI的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，以探究柴胡-白芍藥對(duì)抗LI的作用機(jī)制，為柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的進(jìn)一步研究，以及中醫(yī)藥治療LI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 柴胡-白芍藥對(duì)活性成分及靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）以口服生物利用度（oral bioavailability, OB）≥0.30且類藥性（drug-likeness, DL）≥0.18為條件篩選得到柴胡-白芍藥對(duì)的活性成分化合物及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，運(yùn)用Pubchem平臺(tái)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取靶點(diǎn)Canonical SMILES號(hào)，通過(guò)SwissTargetPrediction（http://swisstargetprediction.ch/）及TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)（http://targetnet.scbdd.com/）預(yù)測(cè)并獲取有效靶點(diǎn)。

1.2 疾病靶點(diǎn)篩選

運(yùn)用GeneCards（https://www.genecards.org/）及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.omim.org/）以“l(fā)iver injury”為關(guān)鍵詞，篩選獲取LI疾病基因靶點(diǎn)，以相關(guān)性分?jǐn)?shù)＞4為標(biāo)準(zhǔn)，去除重復(fù)基因，整理導(dǎo)入Excle表。運(yùn)用Venn 2.1平臺(tái)，將柴胡-白芍藥對(duì)靶點(diǎn)與LI疾病基因靶點(diǎn)進(jìn)行分析取交集，得到韋恩圖，即柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的潛在靶點(diǎn)。

1.3 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction, PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將柴胡-白芍藥對(duì)抗LI的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://cn.string-db.org/），靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)以PPI閾值0.9為標(biāo)準(zhǔn)，隱藏游離靶點(diǎn)，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)，下載PPI可視化圖和潛在靶點(diǎn).TSV文件。將潛在靶點(diǎn).TSV文件使用Cytoscape 3.9軟件打開(kāi)，進(jìn)行Network analyze分析，根據(jù)Degree值，繪制可視化PPI圖。

1.4 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的活性成分和潛在靶點(diǎn)進(jìn)行整理，運(yùn)用Excel建立“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”表，導(dǎo)入Cytoscape 3.9軟件構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，并進(jìn)行可視化處理。

1.5 基因本體（gene ontology, GO）功能及京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析

運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)將柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能及KEGG富集分析，獲取數(shù)據(jù)，選擇GO功能分析前10的結(jié)果和KEGG富集分析前20的結(jié)果，運(yùn)用微生信數(shù)據(jù)可視化平臺(tái)（https://www.bioinformatics.com.cn/）進(jìn)行可視化處理。

1.6 分子對(duì)接

將活性成分和潛在靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接，使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www1.rcsb.org/）獲取受體蛋白的結(jié)構(gòu)文件。使用PyMOL 2.3.0軟件對(duì)下載的受體蛋白進(jìn)行刪除水分子和原配體等操作。使用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載Inositol小分子結(jié)構(gòu)文件并使用Chem3D軟件對(duì)配體分子進(jìn)行計(jì)算，得到能量最小化的配體分子最優(yōu)結(jié)構(gòu)。使用Auto Dock Vina v.1.2.0軟件將靶點(diǎn)蛋白和小分子進(jìn)行分子模擬對(duì)接，得到對(duì)接結(jié)合能以及對(duì)接結(jié)果文件。結(jié)合能越高，結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定，受體與配體之間結(jié)合的可能性越大。

2 結(jié)果

2.1 柴胡-白芍藥對(duì)活性成分及靶點(diǎn)

共篩選得到柴胡-白芍藥對(duì)的活性成分27個(gè)，包含1個(gè)共有活性成分，為山柰酚（Kaempferol），見(jiàn)圖1。通過(guò)SwissTargetPrediction及TargetNet數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)并獲取有效靶點(diǎn)，去除重復(fù)后，得到480個(gè)藥物靶基因。

圖1 柴胡-白芍藥對(duì)的活性成分

2.2 柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的作用靶點(diǎn)

通過(guò)GeneCards及OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲取LI疾病基因靶點(diǎn)，得到疾病靶點(diǎn)2 692個(gè)。將2 692個(gè)疾病靶點(diǎn)與柴胡-白芍藥對(duì)480個(gè)藥物靶點(diǎn)在Venn 2.1中生成韋恩圖，映射出216個(gè)共有靶點(diǎn)，即柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的作用靶點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

圖2 柴胡-白芍藥對(duì)抗LI的潛在靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)，包括239條邊，216個(gè)節(jié)點(diǎn)。將String數(shù)據(jù)庫(kù)下載的潛在靶點(diǎn).TSV文件使用Cytoscape 3.9軟件打開(kāi)，進(jìn)行Network analyze分析，根據(jù)Degree值，選取排名前30的靶點(diǎn)繪制可視化PPI圖，其中靶點(diǎn)Degree值越大，則節(jié)點(diǎn)越大，顏色越深。排名前5的靶點(diǎn)分別為蛋白激酶B1（AKT1）、腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素6（IL6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）。見(jiàn)圖3。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

將柴胡-白芍藥對(duì)、活性成分、交集靶點(diǎn)建立“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”Excel表，導(dǎo)入Cytoscape 3.9軟件構(gòu)建關(guān)系網(wǎng)絡(luò)，獲得“藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。其中紅色V字形代表藥物，紫色圓形代表活性成分，綠色方形代表靶點(diǎn)。見(jiàn)圖4。

圖4 “藥物-活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.5 GO功能分析

DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)將柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能分析，富集結(jié)果按照P值排序，將前10條結(jié)果在微生信數(shù)據(jù)可視化平臺(tái)進(jìn)行可視化。其中，生物過(guò)程（biological process, BP），包括對(duì)細(xì)菌來(lái)源的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、藥物反應(yīng)、節(jié)律反應(yīng)、肽基酪氨酸修飾等。細(xì)胞組分（cellular components, CC），包括細(xì)胞膜、膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜、質(zhì)膜凹腔等。分子功能（molecular function, MF），包括核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、藥物結(jié)合等。見(jiàn)圖5。

圖5 GO功能分析

2.6 KEGG富集分析

分析柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的KEGG富集分析，結(jié)果按照P值排序，將前20條結(jié)果在微生信數(shù)據(jù)可視化平臺(tái)進(jìn)行可視化。通過(guò)分析氣泡圖結(jié)果并結(jié)合LI相關(guān)通路可知，柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的信號(hào)通路主要有PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等，見(jiàn)圖6。

圖6 KEGG富集分析

2.7 分子對(duì)接

根據(jù)PPI分析結(jié)果，運(yùn)用Auto Dock Vina v.1.2.0軟件將度值排名前5的核心作用靶點(diǎn)AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR與柴胡-白芍藥對(duì)的7個(gè)核心活性成分進(jìn)行分子對(duì)接，獲得蛋白結(jié)合能熱圖。結(jié)果顯示，柴胡-白芍藥對(duì)中活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)均對(duì)接穩(wěn)定，其中β-谷甾醇與TNF結(jié)合能力最強(qiáng)，結(jié)合能為-11.4 kcal/mol；山柰酚與TNF結(jié)合能力較強(qiáng)，結(jié)合能為-10.2 kcal/mol，見(jiàn)圖7。將結(jié)合能最強(qiáng)的以上兩個(gè)結(jié)果用PyMOL和Discovery Studio 2019進(jìn)行可視化作圖。見(jiàn)圖8～9。

圖7 活性成分與核心靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)合能

圖8 山柰酚與TNF對(duì)接

圖9 β-谷甾醇與TNF對(duì)接

3 討論

肝臟作為重要的代謝和解毒器官，尤其是受到炎癥、酒精、病毒、藥物、化學(xué)污染等刺激，肝臟對(duì)有害化學(xué)物質(zhì)解毒的能力將超負(fù)荷，易導(dǎo)致肝臟細(xì)胞及功能損傷[11]。研究發(fā)現(xiàn)，LI作為急重癥肝病的前驅(qū)階段，是臨床上危重病癥的第五大常見(jiàn)誘因，因此，及時(shí)阻止LI的發(fā)生與發(fā)展具有重要意義[12]。LI在中醫(yī)認(rèn)為其病位在肝，多因肝氣郁結(jié)、肝絡(luò)失養(yǎng)所致。葉天士《臨證指南》提到“七情之郁居多，并大都是悒郁傷肝”，《素問(wèn)·六元正紀(jì)大論》提到“郁之甚者，治之奈何？木郁達(dá)之……然調(diào)其氣”，在治療上多用疏肝理氣，解郁和絡(luò)之法。故臨床常用柴胡、白芍等疏肝類中藥治療。

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路，研究其潛在機(jī)制，篩選得到柴胡-白芍藥對(duì)活性成分27個(gè)，包括山柰酚、β-谷甾醇、異鼠李素、槲皮素等；PPI分析得到柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的核心靶點(diǎn)216個(gè)，其中排名前5的靶點(diǎn)分為AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR。其中Akt是治療LI的高頻分子，AKT1作為Akt的同源基因，與LI關(guān)系密切[13]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)Akt蛋白能夠改善肝細(xì)胞損傷[14]。TNF、IL6作為炎癥因子，在LI的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，當(dāng)肝臟受到炎癥因子刺激，可導(dǎo)致肝細(xì)胞受損，招募肝臟中NK等巨噬細(xì)胞來(lái)分泌炎癥因子，以起到調(diào)節(jié)免疫功能作用。而炎癥因子過(guò)量分泌會(huì)加重LI，從而產(chǎn)生一系列聯(lián)級(jí)反應(yīng)[15-16]。大量研究表明，抑制TNF、IL6能夠有效改善LI情況[17-18]。VEGFA、EGFR與細(xì)胞的增殖、血管生成、炎癥及細(xì)胞凋亡的抑制有關(guān)[19-20]，研究表明，調(diào)節(jié)VEGFA、EGFR能夠有效改善肝臟纖維化損傷[21-23]。

GO功能分析結(jié)果顯示，BP涉及對(duì)細(xì)菌來(lái)源的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、藥物反應(yīng)、節(jié)律反應(yīng)、肽基酪氨酸修飾等，CC涉及細(xì)胞膜、膜筏、膜微區(qū)、質(zhì)膜、質(zhì)膜凹腔等，MF涉及核受體活性、配體活化轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白酪氨酸激酶活性、血紅素結(jié)合、藥物結(jié)合等。KEGG富集分析結(jié)果顯示，柴胡-白芍藥對(duì)治療LI主要涉及PI3K/AKT信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。其中，磷脂酰肌醇激酶PI3K激活，通過(guò)質(zhì)膜的第二信與細(xì)胞內(nèi)含有PH結(jié)構(gòu)域的Akt結(jié)合，發(fā)揮改變細(xì)胞膜構(gòu)象作用[24]。MAPK信號(hào)通路是信號(hào)從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞核內(nèi)部的重要傳遞通路，調(diào)節(jié)著細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、對(duì)環(huán)境的應(yīng)激適應(yīng)、炎癥反應(yīng)等多種重要的細(xì)胞生理/病理過(guò)程[25]。研究表明，通過(guò)下調(diào)PI3K/AKT信號(hào)通路與MAPK信號(hào)通路，能夠減輕肝臟炎癥反應(yīng)，起到防治LI的作用[26-28]。

運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)，將柴胡-白芍藥對(duì)活性成分與治療LI的核心靶點(diǎn)AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR進(jìn)行對(duì)接，發(fā)現(xiàn)分子對(duì)接結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定。其中山柰酚、β-谷甾醇與TNF結(jié)合能力最強(qiáng)，結(jié)合能分別為-11.4 kcal/mol、-10.2 kcal/mol。研究發(fā)現(xiàn)，山柰酚能用于多種LI類疾病的防治，通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，下調(diào)炎癥因子TNF、白細(xì)胞介素的表達(dá)水平來(lái)防治LI[29-30]。β-谷甾醇能夠通過(guò)下調(diào)炎癥因子TNF的表達(dá)，改善肝功能水平來(lái)減輕肝纖維化損傷[31-33]。以上提示山柰酚、β-谷甾醇等成分與AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR核心靶點(diǎn)，可能為柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的關(guān)鍵成分和靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接技術(shù)證明了柴胡-白芍藥對(duì)能夠通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)治療LI，其機(jī)制可能通過(guò)作用于AKT1、TNF、IL6、VEGFA、EGFR等核心靶點(diǎn)，調(diào)控PI3K/AKT、MAPK等信號(hào)通路有關(guān)。柴胡-白芍藥對(duì)治療LI的機(jī)制復(fù)雜，本研究缺少一定的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以進(jìn)一步確定網(wǎng)絡(luò)藥理分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。后期將運(yùn)用體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探究柴胡-白芍治療LI的機(jī)制，以期為中醫(yī)藥臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)和新的方向。