新疆茄子絨菌斑病原菌的分離及鑒定

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.02.022

摘" 要：【目的】分離與鑒定設施茄子上新發現的1種病害，為該病害的精準防治提供科學依據。

【方法】試驗設在新疆巴音郭楞蒙古自治州和碩縣采用隨機取樣法，調查設施茄子上新發現病害的田間發生危害情況，采用組織分離法、柯赫氏法則、形態學觀察和分子生物學方法鑒定該病害。

【結果】菌株HR-1是該病害的病原菌。菌株HR-1與已報道的灰毛茄釘孢（Passalora nattrassii）同源性高達99.0%以上，菌株HR-1（MW362742.1）與P.nattrassii處于同一分支。

【結論】菌株HR-1為灰毛茄釘孢（P.nattrassii），新疆設施茄子葉部新發現的病害為茄子絨菌斑病。

關鍵詞：茄子；致病性；病原菌鑒定；灰毛茄釘孢

中圖分類號：S436.41""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）02-0455-06

收稿日期（Received）：

2023-06-21

基金項目：

新疆維吾爾自治區重大科技專項（2022A02005-3）；新疆現代農業產業技術體系（XJARS-07）

作者簡介：

羅文芳（1990-），女，河南人，助理研究員，研究方向為蔬菜病蟲害防治，（E-mail）576263465@qq.com

通訊作者：

許建軍（1972-），男，河南人，研究員，研究方向為蔬菜病蟲害防治，（E-mail）xjj72@163.com

何偉（1980-），男，安徽人，副研究員，研究方向為蔬菜病蟲害防治技術，（E-mail）181113882@qq.com

0" 引 言

【研究意義】茄子（Solanum melongena Linn.）是我國主要的蔬菜作物之一，隨著我國設施茄子栽培面積的不斷擴大，茄子絨菌斑病在北方保護地茄子產區有加重的趨勢，某些地區減產達30%～40%［1］。新疆和碩縣設施茄子上新發現1種病害，疑是茄子絨菌斑病，但該病害在新疆尚未被報道，因此需要通過形態學和分子生物學的方法，鑒定該病害的種類，為該病害的精準防治提供依據。【前人研究進展】1932年在我國廣東發現茄子葉霉病之后，四川、山西、遼寧、內蒙古等省（區）也相繼報道了該病的危害情況［2-3］。已有多個文獻報道將該病病原菌鑒定為黃褐孢［Fulvia fulva（Cook）Cif.］，即番茄葉霉病病菌［4-6］。李龍生等［7］將我國發生的茄子葉霉病稱為茄子絨斑病，訂正其病原菌為灰毛茄菌絨孢（Mycovellosiella nattrassii），而劉志恒等［8］將茄子絨菌斑病病原菌鑒定為灰毛茄釘孢（Passalora nattrassii）。【本研究切入點】新疆巴音郭楞蒙古自治州（簡稱巴州）和碩縣設施茄子新發生的一種葉部病害，嚴重危害當地茄子生產，因此需研究該病害的種類?！緮M解決的關鍵問題】鑒定新疆巴州和碩縣設施茄子新發現的病害種類，研究其致病菌，為該病害的精準防治提供科學依據。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

2021年5月在新疆巴州和碩縣曲惠鄉東臺村（42°13′14″N，87°12′9″ E）設施茄子上新發現一種葉部病害，且100個大棚均有絨菌斑病的發生。隨機選取5座溫室調查該病害發病情況。采用5點取樣法調查該病害。每點隨機選取5株，每株上中下調查5片葉。根據田間茄子葉部發病程度進行病害分級，列出分級標準［9］，計算發病率和病情指數。表1

發病率（%）=病葉數調查總葉片數×100；

病情指數=（各級病葉數×相對級數值）調查總葉數×最高級代表值×100。

采集典型發病葉片為標樣，病害標樣在病菌分離前4℃保存。

1.2" 方 法

1.2.1" 病樣分離與純化

采用組織分離法［10］進行病原菌分離，采集病葉經清水沖洗，用眼科剪刀剪取茄子葉片病健交界處，75%乙醇消毒30 s，1%的次氯酸鈉溶液消毒1 min，無菌水沖洗3次，用滅菌濾紙吸干表面水分。置于PDA培養基上，每皿4塊，重復3次，28℃恒溫黑暗培養。待分離菌株HR-1菌落長出后進行單孢純化，4℃保存備用。

1.2.2" 柯赫氏法則驗證

將純化的菌株接種于PDA平板上，25℃黑暗培養30 d，加無菌水制成1×107個/mL孢子懸浮液進行噴施，以無菌水為對照。每處理3次重復，每次重復4個葉片。套袋保濕48 h，觀察并記錄接菌葉片的發病情況，待葉片發病后取發病組織再次進行組織分離，確認接種后致使茄子葉片發病的菌株是否與所接種的菌株一致。

1.2.3" 病原菌鑒定

通過形態學特性和分子生物學方法進行菌株鑒定，記載成熟菌落形態特點、菌絲和分生孢子大小、形態和顏色等特征，分生孢子梗的形態特征，參考《中國真菌志》［11］和《The genera of hyphomycetes》［12］進行菌株分類鑒定。采用天根生化科技（北京）有限公司的真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，采用真菌通用引物ITS 1（5′-TCCGT AGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS 4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對菌株核糖體（rDNA）ITS片段進行PCR擴增，PCR擴增體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL，加dd H2O至總體積50 μL。反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸50 s，共35個循環；72℃延伸10 min。

所得PCR產物由上海生物工程股份有限公司進行序列測定，測得的序列經NCBI進行BLAST比對后，用MEGA5軟件進行序列分析，構建系統發育樹。

1.3" 數據處理

試驗數據采用WPS和SPSS 22.0軟件進行處理分析，調查數據為5次重復。

2" 結果與分析

2.1" 茄子絨菌斑病害發病率及病情指數

研究表明，茄子絨菌斑病主要侵染茄子葉片，發病初期，葉片上出現黃色褪綠斑點，后逐漸擴展形成黃色、近圓形至不規則型病斑，病斑直徑一般為3～6 mm；在茄子生長旺盛期，棚內高濕高溫的條件下，病斑背面產生白色至灰白色霉狀物，其后霉層顏色逐漸加深，變成黃褐色，最后成棕褐色至深褐色，葉片正面也可產生霉層。嚴重時病葉逐漸變黃脫落，導致整個大棚中連片發生，直致植株枯萎死亡。100個大棚均有絨菌斑病的發生，隨機調查的5個大棚內均有不同程度的茄子絨菌斑病發生，其發病率為100%，病情指數為58.16～65.13。圖1，表2

2.2" 柯赫氏法則驗證

研究表明，經分離純化獲得菌株HR-1，經噴霧接種后可引致了茄子葉片發病，接種5 d后葉片出現褪綠斑點，后逐漸擴展形成黃色、不規則形病斑，癥狀表現與田間癥狀一致。取接種發病葉片再次分離、純化，獲得了與原接種菌株菌落形態及孢子形態一致的致病菌。菌株HR-1是茄子新發病害的病原菌。圖2

2.3" 菌株鑒定

2.3.1" 形態學特性

研究表明，菌株HR-1在PDA培養基上28℃單孢培養30 d，菌落圓形直徑25.00 mm，菌落生長緩慢，菌落菌絲體埋生，菌落中心隆起，邊緣窄而完整；分生孢子鏈生，長橢圓形，表面光滑，1～5個隔膜，（18～72）μm×（8～13）μm；該病菌孢子易于在皿中散播形成多個小菌落。圖3

2.3.2" 分子生物學鑒定

研究表明，使用天根生化科技（北京）有限公司的真菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株HR-1的DNA，進行PCR擴增，其擴增片段大小為518 bp。HR-1（MW362742.1）與P.nattrassii（KF863691.1）的相似度最高，達到100%，將其鑒定為灰毛茄釘孢（Passalora nattrassii）。圖4，圖5

3" 討 論

3.1

茄子常見的病害有真菌性病害、細菌性病害、病毒病、線蟲病及生理性病害等［13］。我國自1932年即有茄子絨菌斑病的記載，雖在多地發生，但危害較輕。直至20世紀90年代以來，隨著茄子栽培面積的不斷擴大，該病害在北方茄子種植地損失較大［1］。2021年在新疆和碩縣新發現1種病害，該病害主要侵染茄子葉片，早期葉片出現黃色不規則型病斑；后期病斑背面產生白色至深褐色霉狀物；嚴重時造成大批茄子葉片脫落，植株枯萎死亡，嚴重影響設施茄子的產量和品質，由于該病害在新疆區域尚未見報道，采用組織分離法、柯赫氏法則、形態學觀察和分子生物學方法對茄子新發病害進行鑒定，經鑒定新疆設施茄子葉部新發病害為茄子絨菌斑病，病原菌為灰毛茄釘孢（P.nattrassii）。

3.2

關于茄子絨菌斑病病原菌的分類地位曾有過一定變動，Saito等［14］對茄子葉霉病病原菌做出鑒定，認為是由菌絨孢屬（Mycovellosiella）引起的病害。而李明遠等［2］認為該病病菌為黃褐孢（F.fulva），與番茄葉霉病病菌相同。直至李龍生等［7］對茄子葉霉病菌分類地位作出訂正，認為該病原菌應屬灰毛茄菌絨孢（M.nattrassii）而非黃褐孢。在形態學觀察中菌株HR-1菌落生長緩慢，經單孢移植培養，菌絲生長速度僅為1 mm/d左右，與報道的飛機草菌絨孢菌［15］及番茄葉霉病菌［16］菌絲生長速度較為相似，但是灰毛茄釘孢分生孢子多為1～3個隔膜，最多可達5個，分隔較為明顯，與劉志恒［3］報道的灰毛茄釘孢與葉霉病菌對比研究中結果較為一致，形態相似。且菌株HR-1（MW362742.1）與P.nattrassii（KF863691.1）的序列相似度達100%。結合形態學和分子生物學最終將該致病菌HR-1鑒定為灰毛茄釘孢（P.nattrassii）。該病害在北方一些茄子產區有逐年加重的風險［1］。下一步將對該病害的發生規律及病原菌的致病力進行研究，篩選有效的防治藥劑。

4" 結 論

隨機調查的5個大棚內均有不同程度的茄子絨菌斑病發生，其發病率為100%，病情指數為58.16～65.13，HR-1（MW362742.1）與P.nattrassii（KF863691.1）的相似度最高，達到100%，將其鑒定為灰毛茄釘孢（Passalora nattrassii）。

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Isolation and identification of the Passalora nattrassii HR-1 from aubergine in Xinjiang

LUO Wenfang， Zhou Junhui， HE Wei， XU Jianjun

（Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northwestern Oasis/Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Xinjiang Key Laboratory of Agricultural Bio-safety， Institute of Plant Protection/Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi Xinjiang 830091， China）

Abstract：【Objective】 The authors identified one new disease on aubergine in facility eggplant in Heshuo County， Mongolian Autonomous Prefecture of Bayingolin， Xinjiang， and identified the species of the disease， hoping to provide a scientific basis for accurate control of the disease.

【Methods】" Random sampling was used to investigate and clarify the damage caused by the disease in the field， and the new disease of aubergine was identified using tissue isolation， Koch's rule， morphological observations and molecular biology to determine the taxonomic status of the pathogen.

【Results】 The Koch's Law results indicated that strain HR-1 was the causal agent of the disease.Strain HR-1 was more than 99.0% homologous with the reported Passalora nattrassii.Strain HR-1（MW362742.1）was in the same branch as P.nattrassii.

【Conclusion】 The strain HR-1 was identified as P.nattrassii， a newly discovered disease of eggplant foliage in Xinjiang.

Key words：aubergine；pathogenicity；identification of pathogenic bacteria；Passalora nattrassii

Fund projects：Major Ramp;D Program Project of Xinjiang Uygur Autonomous Region（2022A02005-3）；XinJiang Agriculture Research System（XJARS-07）

Correspondence author： XU Jianjun（1972-）， male， from Henan， research fellow，research area：control of vegetables diseases and insect pests，（E-mail）xjj72@163.com

HE Wei（1980-）， male， from Anhui，research associate， research area： Vegetable diseases and insect pests prevention and control technology，（E-mail）181113882@qq.com