硒化甘草多糖、甘草多糖及其聯合抗生素對無乳鏈球菌體外抗菌活性及機制分析

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.02.024

摘" 要：【目的】分析硒化烏拉爾甘草多糖（selenium glycyrrhiza polysaccharide，SeGUP）、烏拉爾甘草多糖（glycymhiza polyacchiade，GUP）對無乳鏈球菌體外抗菌活性及機制，研究其聯合的抗菌效果。

【方法】通過藥敏紙片篩選出對無乳鏈球菌敏感抗生素，采用最小二倍稀釋法和棋盤法測得最小抑菌濃度（minimal inhibit concentration，MIC）、最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）和聯合抑菌指數（FICI index，FICI）；將無乳鏈球菌與120、60、30 mg/mL的SeGUP、GUP及抗生素分別等量混合后繪制細菌生長速率圖；通過ELISA法檢測細菌培養液中堿性磷酸酶、β-半乳糖苷酶活性、蛋白質含量及胞內DNA濃度，研究SeGUP、GUP及聯合抗生素對細菌細胞膜、細胞壁及DNA的影響；采用結晶紫染色法檢測SeGUP、GUP及聯合抗生素對無乳鏈球菌生物被膜形成的影響。

【結果】無乳鏈球菌對SeGUP 480 mg/mL、GUP 480 mg/mL均呈現中度敏感，抑菌圈直徑為14.0、11.0 mm；無乳鏈球菌對鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考極敏；SeGUP和GUP分別對肺炎鏈球菌的MIC、MBC為120、240 mg/mL和240、480 mg/mL；SeGUP與鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考的FICI為1.5、0.75、1、0.5，SeGUP與鹽酸卡那霉素之間關系為無關，與鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉之間為相加關系，與氟苯尼考間為協同關系，GUP與鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考的FICI為1.5、1、1.5、0.75，GUP與鹽酸卡那霉素、頭孢曲松鈉之間關系為無關，與鹽酸多西環素、氟苯尼考間為相加關系；SeGUP、GUP明顯抑制細菌的生長，其中SeGUP 120 mg/mL效果最強，SeGUP、GUP與鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考聯合使用后增強了抑制效；SeGUP、GUP及聯合抗生素使用后均能顯著升高培養液中堿性磷酸酶（AKP）、β-半乳糖苷酶（β-gal）、蛋白質含量（P＜0.05），顯著降低胞內DNA含量（P＜0.05），顯著抑制無乳鏈球菌生物被膜的形成（P＜0.05）。

【結論】SeGUP能夠通過損傷細菌細胞壁、細胞膜完整性，影響DNA含量對無乳鏈球菌產生明顯的抑制作用，且其抗菌活性優于GUP。SeGUP與抗生素聯合使用后能夠增強抗生素的抗菌活性，并且其作用效果強于單獨使用SeGUP、GUP和抗生素。

關鍵詞：烏拉爾甘草多糖；硒化烏拉爾甘草多糖；聯合抗菌；無乳鏈球菌；生物膜

中圖分類號：S188""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）02-0469-10

收稿日期（Received）：

2023-06-18

基金項目：

國家自然科學基金項目（32060814）

作者簡介：

張夢圓（1996-），女，安徽阜陽人，碩士研究生，研究方向為中藥免疫藥理學， （E-mail）330941027@qq.com

通訊作者：

朱曉慶（1981-），女，甘肅金塔人，講師，博士，研究方向為中藥免疫藥理學，（E-mail）zxhqqmy@126.com

谷新利（1963-），男，河南許昌人，教授，博士，碩士生/博士生導師，研究方向為中獸藥開發與應用，（E-mail）xlgu@shzu.edu.cn

0" 引 言

【研究意義】中草藥制劑具有抗炎、抗病毒、抗氧化及增強免疫力等作用。甘草活性成分甘草多糖已被證明具有抗炎、抗氧化、抑菌及免疫調節作用［1］。硒是人體所必需微量元素，具有抗氧化、提高免疫力的功能［2］，但無機硒毒性大、利用率較小通過化學合成的方法可以將硒與多糖結合，硒化與多糖具有良好的穩定性、低毒性和高生物利用度的優點，人工合成的硒多糖在抗腫瘤、免疫調節和抗氧化方面的活性均優于多糖或無機硒［3］。無乳鏈球菌是一種革蘭氏陽性菌，最早在患乳腺炎牛中分離出，不僅可以定植在泌乳期的奶牛乳腺內，還可以入侵乳腺上皮細胞，造成奶牛的持續性感染［4］，探究SeGUP、GUP及聯合抗生素對無乳鏈球菌抗菌活性及機制，對新疆藥用植物有效的抗菌制劑運用有實際意義。【前人研究進展】周連玉等［5］在黃綠蜜環硒多糖藥敏紙片試驗中表明，不同濃度的硒多糖對大腸桿菌均有抑制作用，且高濃度效果最優；李志洲等［6］研究結果表明，豬苓硒多糖 對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和啤酒酵母菌均有明顯抑制作用且效果強于茯苓多糖；顯齒蛇葡萄硒多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌均有一定的抗菌活性；提取了含糖量為86%的烏拉爾甘草多糖（glycymhiza polyacchiade，GUP），并通過硒化修飾成功合成了含硒量為494.1 μg/g的硒化烏拉爾甘草多糖（selenium glycyrrhiza polysaccharide， SeGUP）［7］，發現SeGUP對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有良好的抗菌活性［8］。【本研究切入點】SeGUP對前兩種病原菌有良好抗菌活性，并且抑制效果優于GUP，但SeGUP對無乳鏈球菌的抗菌作用及機制還是未有文獻報道。【擬解決的關鍵問題】通過體外抗菌試驗和聯合抗生素后的抗菌效果，研究SeGUP的抗菌活性和是否能加強抗生素的抗菌效果，分析SeGUP的抗菌機制，為研發新疆綠色、低毒、有效的抗菌制劑提供新思路。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

中藥煎藥包裝一體機（型號為ZG-280），購自吉首市中城制藥機械廠；玻璃層析柱（型號為DEAE-52），購自上海宸橋生物科技公司；低速離心機（型號為 TD5A-WS）購自湖南可成儀器設備有限公司；電動攪拌器電熱恒溫箱（型號為JJ-4A），購自金壇市友聯儀器研究所；真空冷凍干燥機（型號LGJ-18S），購自北京松源科技發展有限公司；超凈工作臺，購自長春博迅生物技術有限責任公司；多功能酶標儀（型號1510），購自美國伯騰儀器有限公司；微量紫外分光光度計（UV-2600），購自日本津島公司；電熱恒溫水槽（HHW21-600AIL）、pH酸度計（型號ORION STAR A111），均購自上海賽默飛儀器有限公司。

無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae 編號 185941）標準株凍干粉購于河南北納生物有限公司；腦心浸出液肉湯（BHI）購自青島高科技工業園海博生物技術有限公司；定性濾紙、瓊脂粉，購自上海生工生物工程股份有限公司；三氯乙酸、過氧化氫、亞硒酸鈉購自上海國藥集團化學試劑有限公司；頭孢曲松鈉、鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、氟苯尼考，購自北京索萊寶科技有限公司；抗生素藥敏紙片均來自于杭州微生物試劑有限公司；透析袋、葡聚糖凝膠G100、亞硒酸鈉均購自北京博奧拓達科技有限公司。

微生物堿性磷酸酶活性（AKP）、β-半乳糖苷酶活性（β-gal）、BCA法蛋白含量測定試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2" 方 法

1.2.1" SeGUP和GUP溶液的制備

根據連科迅［9］的制備方法，將新疆烏拉爾甘草用無水乙醇浸泡去除脂質小分子，再用熱水回流，將藥液與無水乙醇混合醇沉，沉淀物經過冷凍干燥制得新疆烏拉爾甘草粗多糖。

將新疆烏拉爾粗多糖與純化水混合為10 mg/mL溶液，在使用氫氧化鈉調節pH值為7.0，再加入過氧化氫水浴加熱后透析，透析結束后使用柱層析法除雜，隨后冷凍干燥制得GUP。

將GUP 500 mg與濃硝酸混合后加熱攪拌30 min，加入亞硒酸鈉水浴8 h，飽和無水碳酸鈉調節pH為7.0，低速離心后將上清液置于層析柱中除雜，冷凍干燥后得到SeGUP。將SeGUP、GUP用純化水制備成濃度為480、240、120 mg/mL溶液。

1.2.2" 無乳鏈球菌的活化與處理

準備1支含有10 mLBHI液體培養基試管和2個固體培養基；在安全柜中打開，用砂輪打磨安瓿瓶后用鑷子將頂部敲碎；吸取0.5 mL液體培養基打入凍干管中混勻；吸取0.2 mL菌懸液打入平板中，涂布均勻；剩余菌懸液打入液體培養基中；將試管和平板置于37℃恒溫培養箱中24 h；菌種活化結束后，將平板中單一菌落置于液體培養基中37℃恒溫搖床中培養18 h，用無菌水將菌液濃度稀釋為1×106 cfu/mL備用。

1.2.3" SeGUP和GUP藥敏紙片的制備

參照由鳳鳴等［10］的抗菌紙片制作方法，將直徑為0.6 cm的圓形定量濾紙高壓滅菌后烘干無菌儲存備用。取20 μL準備好的各濃度SeGUP、GUP溶液滴入圓形濾紙片上，置于37℃烘箱烘干后置于無菌青霉素瓶中備用。

1.2.4" 體外抗菌活性試驗

1.2.4.1" 藥敏試驗

取100 μL準備好的菌液均勻涂布在固體培養基表面，將準備好的抗生素及各濃度SeGUP、GUP藥敏紙片緊貼培養基表面，37℃恒溫培養箱中培養24 h，試驗結束后測量抑菌圈的直徑（判定標準：抑菌圈直徑≥20.0 mm為極度敏感，20.0 mm＞d≥15.0 mm為高度敏感，15.0 mm＞d≥10.0 mm為中度敏感，10.0 mm＞d為低度敏感，d=0.0 mm為不敏感）［11］。

1.2.4.2" 抗菌藥物對無乳鏈球菌的MIC和MBC的測定

采用改良后的二倍稀釋法，用純化水將SeGUP、GUP配置成濃度為480、240、120、60、30、15和7.5 mg/mL溶液，根據1.2.4試驗結果篩選出的抗生素配成濃度為500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.813和3.906 μg/mL溶液。吸取上述各溶液100 μL置于無菌96孔板中，再加入100 μL菌液，空白對照組僅加入200 μL菌液，37℃恒溫培養箱中培養24 h后取出，SeGUP、GUP、抗生素各孔與空白對照組相比，清澈透明孔所對應最小濃度為MIC，取清澈透明孔液體100 μL均勻涂布在平板表面隨后置于37℃培養箱中24 h，無細菌生長孔所對應的最小濃度即為MBC。

1.2.4.3" SeGUP、GUP與抗生素的聯合抗菌試驗

采用棋盤法測定聯合抑菌指數（FICI index，FICI）。將試驗結果中的抗生素、SeGUP、GUP分別配成濃度為2 MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC的溶液，將抗生素與SeGUP、GUP各濃度兩兩組合；在無菌96孔板中加入抗生素50 μL和SeGUP或GUP 50 μL ，再加入菌液100 μL，將96孔板置于37℃恒溫培養箱中培養24 h。聯合抗菌效果判定根據如下公式：

FICI=抗菌藥物A聯合MIC抗菌藥A單獨使用時MIC

+抗菌藥物B聯合時MIC抗菌藥物B單獨使用時MIC。

藥物聯合關系判定結果為，FICI≤0.5時，兩者為協同關系。0.5lt;FICI≤1時，兩者為相加關系，1lt;FICI≤2時，兩者為無關，FICI＞2時，兩者為拮抗關系［12］。

1.2.4.4" SeGUP、GUP及聯合抗生素對無乳鏈球菌生長速率的影響

將1×106 cfu/mL菌液與等量SeGUP、GUP 分別混合成10 mL溶液置于試管中，使SeGUP、GUP終濃度分別為120、60、30 mg/mL，根據1.2.4.2抗生素MIC結果，將抗生素與等量菌液混合為終濃度為1/2MIC，將SeGUP 1/2MIC、GUP 1/2MIC分別與1/2抗生素混合后再與等量菌液混合，空白對照組僅加等量菌液。試管置于37℃水平搖床中培養24 h，每2 h取樣1次，在OD600 nm處檢測菌液吸光度值，觀察SeGUP、GUP及聯合抗生素對肺炎鏈球菌生長速率的影響。

1.2.5" 體外抗菌機制試驗

1.2.5.1" SeGUP、GUP聯合抗生素對培養液中AKP、β-al活性及蛋白質含量的影響

將準備好的菌液與等量SeGUP、GUP 分別混合成10 mL溶液置于試管中使SeGUP、GUP終濃度分別120、60、30 mg/mL；抗生素與菌液等量混合為終濃度為1/2MIC；將SeGUP、GUP分別與等量抗生素混合為濃度為1/2（SeGUP MIC+抗生素MIC）、1/2（GUP MIC+抗生素MIC）；空白對照組僅加10 mL菌液；37℃震蕩培養4 h，培養結束后取出1 mL菌懸液，4 500 r/min離心10 min，用相應的檢測試劑盒測定AKP、β-gal活性和蛋白質總含量。

1.2.5.2" SeGUP、GUP聯合抗生素對胞內DNA含量的影響

樣品分組，孵育4 h后取出1 mL菌懸液，4 500 r/min離心10 min，用PBS洗滌并離心，然后向沉淀中加入500 μL（10 mg/mL）溶菌酶和500 μLTE緩沖液，樣品置于電熱恒溫水槽37℃水浴30 min，使用細菌基因中DNA提取試劑盒提取各組細菌DNA，用微量紫外分光光度計確定260 nm處光密度，計算DNA濃度。

1.2.5.3" SeGUP、GUP聯合抗生素對細菌生物被膜形成的影響

采用廖成水等［13］生物被膜染色步驟，分組同1.2.4.4，將無乳鏈球菌培養至生長對數期，稀釋菌液至OD600nm≈0.2，將SeGUP、GUP、抗生素各100 μL與菌液等量混合置于96孔細胞培養板中，每個濃度重復3個孔，另設不加藥物孔為空白對照組，37℃恒溫培養箱中培養24 h后，棄培養液，用去離子水沖洗、晾干，進行結晶紫染色45 min；棄液體，用95%乙醇200 μL懸浮細胞，檢測OD575nm值。

1.3" 數據處理

試驗結果均進行3次求得平均數，數據用“平均數±標準差”表示，采用 SPSS 22.0 軟件對試驗數據進行單因素方差分析、Duncan's檢驗法進行多重比較，Plt;0.05為差異顯著，表示差別具有統計學意義，采用Graphpad prism繪圖。

2" 結果與分析

2.1" 體外抗菌活性

2.1.1" 藥敏試驗

研究表明，無乳鏈球菌對SeGUP 480、240 mg/mL和GUP 480 mg/mL均呈現中度敏感，抑菌圈直徑為14.0、12.0和11.0 mm，對SeGUP 120 mg/mL和GUP 240、120 mg/mL呈現低敏感度，抑菌圈直徑為9.0和9.0、6.0 mm；抗生素組中頭孢曲松鈉、鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、氟苯尼考達到極度敏感（d＞20.0 mm）。表1

2.1.2" 單用藥對無乳鏈球菌MIC、MBC及聯合抗菌FICI的測定

研究表明，鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考、SeGUP、GUP對無乳鏈球菌作用產生的MIC為31.25 μg/mL、15.63 μg/mL、62.5 μg/mL、31.3 μg/mL、120 mg/mL、240 mg/mL，MBC為62.5 μg/mL、31.25 μg/mL、125 μg/mL、62.5 μg/mL、120 mg/mL、480 mg/mL；SeGUP、GUP分別與鹽酸卡那霉素聯合使用后，鹽酸卡那霉素MIC由31.25 μg/mL均下降到15.63 μg/mL，SeGUP、GU PMIC無變化，FICI為1.5，SeGUP、GUP與鹽酸卡那霉素聯合使用關系為無關關系；SeGUP、GUP與鹽酸多西環素聯合用藥后，鹽酸多西環素MIC用原來15.63 μg/mL分別下降到3.91、7.8 1 μg/mL，SeGUP MIC由120 mg/mL下降到60 mg/mL、GUP由240 mg/mL下降到120 mg/mL，FICI分別為0.75和1，SeGUP、GUP均與鹽酸多西環素呈現相加關系；SeGUP、GUP與頭孢曲松鈉聯合用藥后，頭孢曲松鈉由62.5 μg/mL均下降到31.25 μg/mL，SeGUP由120 mg/mL下降到60 mg/mL，但GUP MIC無變化，FICI為1和1.5，SeGUP與頭孢曲松鈉之間為相加關系，GUP與頭孢曲松鈉為無關關系；SeGUP、GUP與氟苯尼考聯用后，氟苯尼考MIC由31.25 μg/mL均下降到7.81 μg/mL，SeGUP MIC由120 mg/mL降低到30 mg/mL，GUP由240 mg/mL下降到120 mg/mL，SeGUP與氟苯尼考聯合使用關系為協同關系，GUP與其為相加關系。

SeGUP與鹽酸多西環素、頭孢曲松、氟苯尼考的聯用效果強于鹽酸卡那霉素作用效果，其中與氟苯尼考聯用效果最好；GUP與鹽酸多西環素、氟苯尼考聯用效果優于鹽酸卡那霉素、頭孢曲松鈉聯合使用；SeGUP鹽酸多西環素、頭孢曲松、氟苯尼考與SeGUP的聯用效果強于GUP聯合使用效果。表2

2.1.3" SeGUP、GUP及聯合抗生素對無乳鏈球菌生長速率的影響

研究表明，無乳鏈球菌在6 h進入生長對數期，16 h達到穩定期，SeGUP、GUP的干預下，均能抑制細菌生長，SeGUP 120 mg/mL抑制效果強于GUP 120 mg/mL。圖1

1/2（SeGUP MIC+鹽酸多西環素MIC）、1/2（SeGUP MIC+頭孢曲松鈉MIC）、1/2（SeGUP MIC+氟苯尼考MIC）、1/2（GUP MIC+鹽酸多西環素MIC）、1/2（GUP MIC+氟苯尼考MIC）組對無乳鏈球菌的抑制作用強于SeGUP、GUP各抗生素單獨使用；1/2（SeGUP MIC+鹽酸卡那霉素MIC）、1/2（GUP MIC+鹽酸卡那霉素MIC）、1/2（GUP MIC+頭孢曲松鈉MIC）抑制作用與鹽酸卡那霉素、頭孢曲松鈉單用效果無明顯差異。圖2

2.2" 抗菌機制

2.2.1" SeGUP、GUP及聯合抗生素對細菌AKP、β-gal、蛋白質及胞內DNA影響

研究表明，與空白組相比較，SeGUP、GUP及抗生素各組培養液中AKP、β-gal、蛋白質含量均顯著升高（P＜0.05），胞內DNA含量顯著升高（P＜0.05）；SeGUP 120 mg/mL培養液中AKP、β-gal、蛋白質含量與GUP 120 mg/mL組相比較顯著升高（P＜0.05），DNA含量顯著降低（P＜0.05）；1/2（鹽酸卡那霉素MIC+SeGUP MIC）組與鹽酸卡那霉素1/2 MIC組相比，AKP含量無顯著差異（P＞0.05），β-gal含量、蛋白質含量顯著升高（P＜0.05），DNA含量顯著降低（P＜0.05）；1/2（鹽酸多西環素MIC+SeGUP MIC）組與鹽酸多西環素1/2 MIC組相比、1/2（頭孢曲松鈉MIC+SeGUP MIC）與頭孢曲松鈉1/2 MIC組相比，培養液中AKP、β-gal含量、蛋白質含量均顯著升高（P＜0.05），DNA含量顯著降低（P＜0.05）；1/2（鹽酸卡那霉素MIC+GUP MIC）與鹽酸卡那霉素1/2 MIC相比，AKP含量顯著升高（P＜0.05），β-gal含量、蛋白質含量無明顯變化（P＞0.05），DNA含量顯著降低（P＜0.05）；1/2（鹽酸多西環素MIC+GUP MIC）與鹽酸多西環素1/2 MIC組相比，1/2（頭孢曲松鈉MIC+GUP MIC）與頭孢曲松鈉1/2 MIC組相比、1/2（氟苯尼考MIC+GUP MIC）與氟苯尼考1/2 MIC組相比，培養液中AKP、β-ga含量l、蛋白質含量與GUP 120 mg/mL組均顯著升高（P＜0.05），DNA含量顯著降低（P＜0.05）。表3

2.2.2" SeGUP、GUP聯合抗生素對細菌生物被膜形成的影響

研究表明，與空白對照組相比，SeGUP、GUP均能顯著抑制無乳鏈球菌生物被膜的形成（P＜0.05），其中SeGUP 120 mg/mL抑制效果顯著強于GUP 120 mg/mL、60 mg/mL、30 mg/mL組（P＜0.05）。圖3

1/2（鹽酸卡那霉素MIC+SeGUP MIC）、1/2（鹽酸多西環素MIC+SeGUP MIC）、1/2（頭孢曲松鈉MIC+SeGUP MIC）、1/2（氟苯尼考MIC+SeGUP MIC）、1/2（鹽酸卡那霉素MIC+GUP MIC）、1/2（鹽酸多西環素MIC+GUP MIC）、1/2（頭孢曲松鈉MIC+GUP MIC）、1/2（氟苯尼考MIC+GUP MIC）組抑制效果顯著強于鹽酸卡那霉素1/2 MIC、鹽酸多西環素1/2 MIC、頭孢曲松鈉1/2 MIC、氟苯尼考1/2 MIC、SeGUP 60 mg/mL、GUP 120 mg/mL組（P＜0.05）。圖4

3" 討 論

3.1" SeGUP、GUP對無乳鏈球菌的抗菌活性

SeGUP、GUP對無乳鏈球菌有明顯的抑制作用，同濃度下SeGUP產生的抑菌圈直徑大于GUP，MIC、MBC均小于GUP，對無乳鏈球菌生長速率的抑制作用強于GUP。有許多研究亦表明硒化多糖的抗菌作用強于多糖，周連玉等［5］在黃綠蜜環硒多糖藥敏紙片試驗中發現不同濃度的硒多糖對大腸桿菌均有抑制作用，且高濃度效果最優；李志洲等［6］研究結果表明，豬苓硒多糖對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉和啤酒酵母菌均有明顯抑制作用且效果強于茯苓多糖；顯齒蛇葡萄硒多糖對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠假單胞菌均有一定的抗菌活性［14］；高玉杰等［15］研究也發現經過亞硒酸鈉硒化的滸苔多糖對大腸桿菌的生長抑制作用明顯強于滸苔多糖。其原因可能是硒多糖是一種新型的有機硒化合物，是多糖的硒化產物，而且動物體內硒主要以有機硒的形式存在，分為硒蛋白和硒-tRNA等，目前對硒蛋白研究比較透徹，對硒代半胱氨酸研究結果表明，硒在半胱氨酸的特殊結合位點能夠改變蛋白質結構，顯著提高相關酶活性［16］，植物多糖與硒結合不僅將無機硒轉化為無毒的有機硒，還形成了特殊硒氧鍵（O=Se=O）［17， 18］，顯著提高機體對硒的吸收與利用，既可有效避免補充無機硒所引起的毒性，又保留了多糖的藥理活性，同時兼具硒與多糖二者的活性，因此硒多糖生物活性要遠高于多糖。

3.2" SeGUP、GUP對無乳鏈球菌的抗菌機制

植物多糖可以通過疏水作用、靜電吸附或者細菌表面多糖受體與細胞膜產生相互作用，其中主要的方式是植物多糖吸附在細菌細胞膜表面，其中的作用機制是增加細胞膜的通透性，降低細菌與宿主細胞的吸附機率和阻礙細菌營養和能量物質的跨膜運輸，其主要機制可能是多糖吸附在細菌表面形成一個屏障，阻礙營養物質的進入［19］。AKP是一種結合在細菌細胞膜上的酶，能夠水解有機磷提供自生生長所需的無機磷［20］，β-gal是微生物生長發育過程中不可缺少的酶，它能夠將乳糖水解為葡萄糖和半乳糖，這個過程可以生成能量和提供碳骨架，蛋白質一般只存細胞內，只有當細菌細胞膜損傷后外滲，所以以上3種物種外滲量可以用來評價細胞膜的完整性。SeGUP、GUP對細菌培養液AKP、β-gal、蛋白質結果表明，經過SeGUP、GUP干預后，培養液中3種物質的含量隨濃度的升高而增加，證明SeGUP、GUP能夠損壞無乳鏈球菌細胞壁、細胞膜的完整性導致胞內大分子物質外泄，SeGUP作用效果強于GUP。

SeGUP、GUP對無乳鏈球菌胞內DNA含量影響結果表明，SeGUP、GUP能夠顯著降低胞內DNA含量，同濃度下SeGUP的抑制效果顯著優于GUP。王海濤等［21］通過研究大豆異黃酮的抑菌機制發現大豆異黃酮能夠改變金黃色葡萄球菌胞內拓撲異構酶活性，阻礙DNA的復制導致DNA表達量下降；云寶儀等［22］結果表明，黃芩素能夠通過抑制DNA拓撲異構酶的活性阻礙DNA的合成。SeGUP與DNA具體作用方式還需進一步研究。

細菌生物被膜（BF），是指細菌接觸物體表面分泌多糖基質、脂質蛋白和纖維蛋白等，將自己包裹其中從而形成大量細菌聚集在一起形成的膜樣物，在此狀態下的細菌集合體比游走狀態更難對付，是抗菌治療最大的困難［23］。通過SeGUP、GUP對無乳鏈球菌生物被膜形成影響結果表明，SeGUP、GUP均能顯著抑制細菌生物被膜的形成且成劑量依賴性，等同濃度下SeGUP抑制效果強于GUP。Wang等［24］采用結晶紫染色法測定黃原膠多糖對金黃色葡萄球菌生物被膜形成影響結果表明，添加低濃度多糖時金黃色葡萄球菌生物被膜形成明顯受到了抑制；廖成水等［13］研究結果表明，高濃度甘草多糖能夠抑制單核細胞增生性李斯特菌生物被膜的形成。

3.3" SeGUP、GUP聯合抗生素抗菌活性

近些年來中草藥聯合抗生素的聯合法能夠有效的減緩細菌耐藥，減少抗菌藥劑量及其殘留帶來的毒副作用［12］。試驗中，通過體外抗菌活性試驗、抗菌機制試驗結果表明，SeGUP、GUP分別與鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考聯合用藥后能夠顯著增強對無乳鏈球菌的抑制作用，且效果優于SeGUP、GUP、抗生素單獨使用，SeGUP聯合鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考抗菌作用強于SeGUP與鹽酸卡那霉素聯用；GUP與鹽酸多西環素、氟苯尼考組合效果優與GUP與鹽酸卡那霉素、頭孢曲松鈉組合，SeGUP與抗生素的聯用效果強于GUP。Dhara L等［25］研究表明，肉桂醛與頭孢噻肟和環丙沙星聯用時提高了大腸桿菌和acr-B肺炎鏈球菌對兩種抗生素的敏感性，降低了抗生素MIC值，同時改變基因表達量。

4" 結 論

SeGUP、GUP對無乳鏈球菌有明顯抑制作用，SeGUP 480 mg/mL產生的抑菌圈直徑最大，為14.0 mm；SeGUP、GUP各濃度均能明顯抑制無乳鏈球菌生長，顯著促進AKP、β-半乳糖苷酶、蛋白質的外泄，減少細菌細胞內DNA含量從，抑制生物被膜的形成，從而破壞細菌細胞壁、細胞膜通透性和干擾DNA合成，且SeGUP 120 mg/mL抗菌效果最強；SeGUP與鹽酸卡那霉素、鹽酸多西環素、頭孢曲松鈉、氟苯尼考呈現無關、相加、相加和協同作用，GUP與以上4種抗生素呈現無關、相加、無關和相加關系；等同濃度下SeGUP MIC、MBC值小于GUP，對細菌生長速率、生物被膜抑制程度和AKP、β-半乳糖苷酶外泄作用更強，SeGUP與抗生素聯合效果優于GUP。SeGUP與鹽酸多西環素的聯合效果更好，不僅增強藥物的抗菌活性，又明顯減少抗生素的使用量。

參考文獻（References）

［1］

于霖淼.甘草多糖提取動力學、理化特性及生物活性研究［D］. 蘭州：蘭州理工大學， 2021.

YU Linmiao.Study on extraction kinetics， physicochemical properties and biological activity of glycyrrhiza polysaccharide ［D］. Lanzhou：Lanzhou University of Technology， 2021.

［2］黃峙，鄭文杰，郭寶江.含硒生物大分子化合物研究進展［J］. 海南大學學報（自然科學版）， 2001，19（2）：169-175.

HUANG Zhi， ZHENG Wenjie， GUO Baojiang， et al.Research progress in selenium-containing biomacromolecule compounds ［J］. Journal of Hainan University（Natural Science" Edition）， 2001，19（2）：169-175.

［3］周凝.螺旋藻硒多糖的結構表征及其抑制鎘毒性作用的研究［D］.南寧： 廣西大學， 2021.

ZHOU Ning.Study on the structural characterization of selenium polysaccharide from Spirulina platensis and its inhibition of cadmium toxicity ［D］.Nanning：Guangxi University， 2021.

［4］王寶屯， 郭晗， 王夢雅， 等.76味中草藥對無乳鏈球菌體外抑菌作用［J］. 揚州大學學報（農業與生命科學版）， 2021，42（5）：67-71.

WANG Baotun， GUO Han， WANG Mengya， et al.Antimicrobial effect of 76 Chinese herbal medicines on Streptococcus lactis in vitro ［J］. Journal of Yangzhou University（Agricultural and Life Science Edition）， 2021，42（5）：67-71.

［5］周連玉， 鐘睿， 焦璐， 等.黃綠蜜環菌硒多糖抗氧化活性及抑菌活性研究［J］. 食品研究與開發， 2020，41（15）：6-10.

ZHOU Lianyu， ZHONG Rui， JIAO Lu， et al.Antioxidant activity and antibacterial activity of selenium polysaccharide from Armillaria mellea ［J］. Food Research and Development， 2020， 41（15）：6-10.

［6］李志洲， 劉軍海， 王俊宏， 等.豬苓硒多糖連續合成工藝及抑菌性能研究［J］. 食品與機械， 2013，29（1）：31-35.

LI Zhizhou， LIU Junhai， WANG Junhong， et al. Study on the continuous synthesis process and bacteriostasis of polyporus umbellatus selenium polysaccharide ［J］. Food and Machinery， 2013， 29（1）：31-35.

［7］Lian K X， Zhu X Q， Chen J， et al.Selenylation modificiation：enhancement of the antioxidant activity of a Glycyrrhiza uralensis polysaccharide［J］.Glycoconjugate Journal 2018，35（2）：243-253.

［8］王丹陽.硒化甘草多糖聯合抗菌藥的抗菌活性及其免疫調節作用研究［D］. 石河子：石河子大學， 2021.

WANG Danyang.Study on antibacterial activity and immunomodulatory effect of selenium glycyrrhiza polysaccharide combined with antibacterial drugs ［D］. Shihezi：Shihezi University， 2021.

［9］連科迅.硒化新疆烏拉爾甘草多糖抗炎免疫調節作用研究［D］. 石河子：石河子大學， 2018.

LIAN Kexun.Study on the anti-inflammatory and immunomodulatory effects of glycyrrhiza uralensis polysaccharide selenified in Xinjiang ［D］. Shihezi：Shihezi University， 2018.

［10］由鳳鳴， 胡榮， 肖沖， 等.麻黃附子細辛湯聯合抗生素的體外抗肺炎鏈球菌作用研究［J］. 世界中醫藥， 2015，10（6）：891-894.

YOU Fengming， HU Rong， XIAO Chong， et al.Study on the anti-Streptococcus pneumoniae effect of Mahuang Fuzi Xixin Decoction combined with antibiotics in vitro ［J］. World Chinese Medicine， 2015， 10（6）：891-894.

［11］唐毅，張浩然，劉琴琴，等.不同單味中草藥與其復配組方對鯽魚源嗜水氣單胞菌的抑菌效果［J］. 貴州農業科學， 2022，50（3）：74-82.

TANG Yi， ZHANG Haoran， LIU Qinqin， et al.Bacteriostatic effect of different single Chinese herbal medicine and its compound prescription on Aeromonas hydrophila from crucian carp ［J］. Guizhou Agricultural Sciences， 2022， 50（3）：74-82

［12］陳金玉， 劉單陽， 藍蔚青， 等.3種天然產物聯合抗生素對肺炎克雷伯氏菌的協同抗菌作用［J］. 上海海洋大學學報， 2022，31（2）：586-593.

CHEN Jinyu， LIU Danyang， LAN Weiqing， et al.Synergistic antibacterial effect of three natural products combined with antibiotics on Klebsiella pneumoniae ［J］. Journal of Shanghai Ocean University， 2022， 31（2）：586-593.

［13］廖成水，李亮偉，賈艷艷，等.甘草多糖對單核細胞增生性李斯特菌體內外生長的影響［J］. 食品科學， 2016，37（17）：213-218.

LIAO Chengshui， LI Liangwei， JIA Yanyan， et al.Effect of Glycyrrhiza polysaccharide on the growth of Listeria monocytogenes in vitro and in vivo ［J］. Food Science， 2016， 37（17）：213-218

［14］梁歡， 黃進， 王麗， 等.藥用植物硒多糖的研究進展［J］. 中國中藥雜志， 2018，43（15）：3080-3092.

LIANG Huan， HUANG Jin， WANG Li， et al.Recent research progress of selenium polysaccharides from medicinal plants ［J］. China Journal of Chinese Materia Media， 2018， 43（15）：3080-3092.

［15］高玉杰， 呂海濤.滸苔多糖和硒化滸苔多糖抑菌作用研究［J］. 食品科技， 2013，38（1）：195-198.

GAO Yujie， LYU Haitao.Study on the bacteriostasis of Enteromorpha prolifera polysaccharides and selenified Enteromorpha prolifera polysaccharides ［J］. Food Science and Technology， 2013， 38（1）：195-198

［16］Mousa R，Notis D，Metanis N， et al.Selenium and Selenocysteine in Protein Chemistry［J］. Angewandte Chemie， 2017， 56（50）：15818-15827.

［17］金賀偉， 閆如霞， 年芳， 等.硒多糖的來源、提取及其生物學功能研究進展［J］. 中國飼料， 2021，（9）：12-16，21.

JIN Hewei， YAN Ruxia， NIAN Fang， et al.Research progress in the source， extraction and biological function of selenium polysaccharides ［J］. China Feed， 2021，（9）：12-16，21.

［18］Andrade E D， Dupont S， Beney L， et al.Osmoporation is a versatile technique to encapsulate fisetin using the probiotic bacteria Lactobacillus acidophilus［J］. Applied Microbiology and Biotechnology， 2022， 106（3）：1031-1044.

［19］宋憲銳， 宋暉， 王丹， 等.海洋中堿性磷酸酶及其活性的研究進展［J］. 海洋開發與管理， 2022，39（8）：50-59.

SONG Xianrui， SONG Hui， WANG Dan， et al.Research progress of alkaline phosphatase and its activity in the sea ［J］. Marine Development and Management， 2022， 39（8）：50-59.

［20］王海濤.大豆異黃酮的抑菌活性及其機制的研究［D］. 大連：遼寧師范大學， 2009.

WANG Haitao.Study on the antibacterial activity and mechanism of soybean isoflavones ［D］. Dalian：Liaoning Normal University， 2009.

［21］云寶儀， 周磊， 謝鯤鵬， 等.黃芩素抑菌活性及其機制的初步研究［J］. 藥學學報， 2012，47（12）：1587-1592.

YUN Baoyi， ZHOU Lei， XIE Kunpeng， et al.A preliminary study on the antibacterial activity and mechanism of baicalin ［J］. Journal of Pharmacy， 2012， 47（12）：1587-1592.

［22］崔海英，張雪婧，趙呈婷，等.細菌生物膜的研究進展［J］. 江蘇農業科學， 2015，43（8）：11-14.

CUI Haiying， ZHANG Xuejing， ZHAO Chengting， et al.Research progress of bacterial biofilm ［J］. Jiangsu Agricultural Sciences， 2015， 43（8）：11-14.

［23］Wang Z C，Yang Q Q，Wang X Q， et al.Antibacterial activity of xanthan-oligosaccharide against Staphylococcus aureus via targeting biofilm and cell membrane［J］. International Journal of Biological Macromolecules， 2020， 153：539-544.

［24］Dhara L， Tripathi A .Cinnamaldehyde：a compound with antimicrobial and synergistic activity against ESBL-producing quinolone-resistant pathogenic Enterobacteriaceae［J］. European Journal of Clinical Microbiology amp; Infectious Diseases， 2020， 39（1）：65-73.

［25］吳盤紅.香蓮方對咪康唑抗念珠菌增效作用的臨床和實驗研究［D］. 廣州：廣州中醫藥大學， 2013.

WU Panhong.Clinical and Experimental Study on Synergistic Effect of Xianglian Formula on Miconazole against Candida ［D］. Guangzhou：Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， 2013.

Study on antibacterial activity and mechanism of selenium glycyrrhiza polysaccharide， glycyrrhiza polysaccharide and their combined antibiotics against Streptococcus agalactiae in vitro

ZHANG Mengyuan1，ZHU Xiaoqing1， GU Xinli1， WANG Yan1， YANG Huiying1， LIU Yuran1， WANG Mengmeng1， SUN Guojie1， LIAN Kexun 1， LI Xiaozhen 2

（1. College of Animal Science and Techoology， Shihezi University， Shihezi Xinjiang 832003， China; 2. Urumqi Customs Technical Center， Urumqi 830000， China）

Abstract：【Objective】 To study the antibacterial activity and mechanism of selenium glycyrrhiza polysaccharide（SeGUP）and glycyrrhiza polysaccharide（GUP）against Streptococcus agalactiae in vitro， and determine whether the combination of them can enhance the antibacterial effect of antibiotics.

【Methods】"" Antibiotics sensitive to Streptococcus agalactis were screened by drug sensitive paper.The minimum inhibitory concentration（MIC）， minimum bactericidal concentration（MBC）and joint inhibitory index（FICI）were measured by the minimum double dilution method and chessboard method; Mixed Streptococcus agalactis with 120， 60， 30 mg/mL SeGUP， GUP and antibiotics in equal amounts respectively were used to draw the bacterial growth rate diagram; Meanwhile， detection of alkaline phosphatase β-Galactosidase activity， protein content and intracellular DNA concentration were studied to find the effects of SeGUP， GUP and combined antibiotics on bacterial cell membrane， cell wall and DNA; Finally， the effect of SeGUP， GUP and combined antibiotics on the biofilm formation of Streptococcus agalactis was detected by crystal violet staining.

【Results】 Streptococcus agalactis was moderately sensitive to SeGUP 480 mg/mL and GUP 480 mg/mL， and the diameter of the inhibition zone was 14.0 mm and 11.0 mm; Streptococcus agalactis is extremely sensitive to kanamycin hydrochloride， doxycycline hydrochloride， ceftriaxone sodium and florfenicol; MIC and MBC of SeGUP and GUP against Streptococcus pneumoniae were 120， 240 mg/mL and 240， 480 mg/mL respectively; The FICIs of SeGUP with kanamycin hydrochloride， doxycycline hydrochloride， ceftriaxone sodium， and florfenicol were 1.5， 0.75， 1， 0.5， indicating that the relationship between SeGUP and kanamycin hydrochloride was irrelevant， the relationship between SeGUP and doxycycline hydrochloride， ceftriaxone sodium was additive， and the relationship between SeGUP and florfenicol was synergistic.The FICIs of GUP with kanamycin hydrochloride， doxycycline hydrochloride， ceftriaxone sodium， and florfenicol were 1.5， 1， 1.5， 0.75， The results showed that GUP had no relationship with kanamycin hydrochloride and ceftriaxone sodium， but additive relationship with doxycycline hydrochloride and florfenicol; SeGUP and GUP significantly inhibited the growth of bacteria， of which SeGUP 120 mg/mL had the strongest effect.The combination of SeGUP and GUP with doxycycline hydrochloride， ceftriaxone sodium and florfenicol has enhanced the inhibition effect; SeGUP， GUP and combination of antibiotics could significantly increase alkaline phosphatase（AKP）β-Galactosidase（β-gal）， protein content（P＜0.05）， significantly reduced the content of intracellular DNA（P ＜ 0.05）， significantly inhibited the formation of biofilm of Streptococcus agalactis（P ＜ 0.05）

【Conclusion】 SeGUP can significantly inhibit Streptococcus agalactis by damaging the integrity of bacterial cell wall and cell membrane and affect DNA content， and its antibacterial activity is superior to that of GUP.The combination of SeGUP and antibiotics can enhance the antibacterial activity of antibiotics， and its effect is stronger than those of SeGUP， GUP and antibiotics used alone.

Key words：glycymhiza polyacchiade;selenium glycyrrhiza polysaccharide; combined antibacterial; Streptococcus agalactiae; biofilm

Fund project：National Natural Science Foundation of China（32060814）

Correspondence author：ZHU Xiaoqing（1981-）， female， from Jinta， Gansu， Ph.D.，

Lecturer， research interests in Chinese medicine immunopharmacology，（E-mail）zxhqqmy@126.com

GU Xinli（1963-）， male， from Xuchang， Henan， professor， PhD supervisor， research interests in the development and application of Chinese veterinary medicine，（E-mail）xlgu@shzu.edu.cn