22種抗生素對梨火疫病菌的室內毒力測定及對花器安全性評價

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.02.023

摘" 要：【目的】篩選出抑制梨火疫病的藥劑，為梨火疫病的綠色安全防控提供技術支持。

【方法】采用抑菌圈法篩選22種抗生素，評價其在庫爾勒香梨花器上的安全性。

【結果】13種抗生素對梨火疫病菌有抑制作用，其中在抑菌圈直徑達到9 mm時，氯霉素①、注射用頭孢噻肟鈉、注射用頭孢曲松鈉和諾氟沙星的藥劑有效濃度由低至高是5.30、7.60、9.88、11.64 mg/L，使用同等劑量下4種藥劑的抑制作用強于其它藥劑；氯霉素①、注射用頭孢噻肟鈉、注射用頭孢曲松鈉、羅紅霉素分散片、諾氟沙星對庫爾勒香梨花器的危害較輕。

【結論】氯霉素①、諾氟沙星、注射用頭孢曲松鈉和注射用頭孢噻肟鈉可在田間防治梨火疫病上應用。

關鍵詞：梨火疫病；抑菌圈法；室內毒力測定；安全評價

中圖分類號：S436.612""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）02-0461-08

收稿日期（Received）：

2023-06-21

基金項目：

新疆生產建設兵團財政科技計劃（重點領域科技攻關計劃項目）“南疆枝枯病動態監測及防控關鍵技術集成研究與示范”（2018AB038）

作者簡介：

劉振亞（1987-），男，河南商丘人，高級實驗師，碩士，研究方向為植物病理學，（E-mail）1319737595@qq.com

通訊作者：

張王斌（1974-）男，陜西澄城人，教授，碩士，碩士生導師，研究方向為植物病理學，（E-mail）zwbzky@163.com

0" 引 言

【研究意義】梨火疫病（Erwinia amylovora）是由解淀粉歐文氏菌所引起的一種危害性極強的細菌性病害 ，可危害蘋果、梨等薔薇科果樹［1-2］ ，嚴重時可引起整個樹體死亡。梨火疫病較早已被發現［3-5］ ，世界上多個國家均相繼發生流行［6］ 。并在新疆多個地（州）發生，該病害2015年6月在我國新疆伊犁哈薩克自治州霍城縣發生，目前甘肅省張掖和武威地區亦有發生［7］。梨火疫病是我國重點檢疫性病害之一［8］ ， 因此對于該病害的毒力測定及科學防控必不可少。【前人研究進展】舒曉玲［9］和吳惠秋［10］等研究表明，農用鏈霉素對梨火疫病有防治效果；梁慧敏［11］等利用春雷霉素、寧南霉素、農用青霉素等對梨火疫病進行室內篩選，表明上述幾類藥劑對梨火疫病沒有明顯抑制效果；王雪等［12］研究表明，藥劑類藥劑對細菌有抑菌作用；Suzanne M.Slack［13］評估了鏈霉素、土霉素和春日霉素對蘋果花柱上火疫病病原體歐文氏菌的影響，結果顯示3種藥劑顯著減少了柱頭種群。【本研究切入點】由于梨火疫病發病原因復雜，有效控制病害的發生較為困難［14］，目前主要采用化學防治作為梨火疫病的主要措施。因此篩選出其他可以代替農用鏈霉素抑菌的藥劑刻不容緩。【擬解決的關鍵問題】采用抑菌圈法 ，對藥劑類等藥劑進行室內毒力測定 ，篩選出對梨火疫病有較強抑制作用的藥劑 ，并在庫爾勒香梨花器上進行安全性評價，為有效防治梨火疫病提供參考依據 。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

供試藥劑22種。表1

培養基：LB培養基［15］：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g， NaCl 10 g，加入到 1 000 mL 蒸餾水中充分溶解，于121℃條件下，0.5 h 滅菌使用（固體培養基加入15 g瓊脂粉）。

1.2" 方 法

1.2.1" 抑菌圈法

抑菌圈實驗分為兩步，第一步對22種藥劑進行高濃度初篩；第二步將篩選出的藥劑設置5個濃度梯度，每個濃度4次重復，以無菌水為對照。第一步和第二步均采用抑菌圈法［16-18］。制備LB培養基平板，在LB 培養基溫度降至40℃左右時，與梨火疫病菌菌懸液以10∶1 的比例混合均勻。將直徑為5 mm的滅菌濾紙片放置于直徑為 90 mm的培養基中央，取2 μL藥劑滴于紙碟上，置于28℃條件下培養，24 h十字交叉測量抑菌圈直徑［19］，以藥劑濃度的對數為橫坐標，平均抑菌圈直徑為縱坐標，計算毒力回歸方程［20］ ，比較抑菌圈直徑達到9 mm時藥劑有效濃度毒力。

1.2.2" 田間試驗

9種藥劑設置5個稀釋梯度，將22種藥劑稀釋20、50、100、200、400倍，設置5個濃度梯度，采用抑菌圈法篩選對梨火疫病有抑制作用的藥劑，并以清水作為對照。在果樹的初花期、盛花期、末花期分別進行噴霧試驗，每種濃度各噴霧30簇花絮。如遇下雨，第2 d需補噴1次。在噴霧后的第1 d、第3 d、第5 d中觀察花器受害情況并記錄。

花器受害程度分級：0級：花器正常；1級：花器邊緣輕微燒傷狀；2級：花器邊緣燒傷狀占整個花器 1/3；3級：花器邊緣燒傷狀占整個花器1/3～2/3；4級：花器邊緣燒傷狀占整個花器2/3 以上。分析各濃度對花器的藥害等級。病情指數計算公式：

病情指數=100×∑ （各級病花序數×各級代表值）/（調查總花序數×最高級代表值）。

1.3" 數據處理

數據處理采用Excel 2019 和 SPSS 17.0，計算藥劑毒力回歸方程和差異顯著性分析。

2" 結果與分析

2.1" 22種藥劑對梨火疫病抑制作用的篩選

研究表明，72%農用硫酸鏈霉素、注射用頭孢曲松鈉、利福平、注射用頭孢噻肟鈉、羅紅霉素分散片、氯霉素①、諾氟沙星、硫酸新霉素、氨芐青霉素、注射用青霉素鈉、氯霉素②、氨芐西林、頭孢拉定等13種藥劑對梨火疫病菌有抑制作用。圖1

2 .2" 13種藥劑對梨火疫病菌的抑制作用

研究表明，篩選出13種藥劑對梨火疫病菌的抑制效果有顯著差異，同一種藥劑的不同藥劑濃度對梨火疫病菌的抑制效果不同，氨芐青霉素、注射用青霉素鈉、氯霉素①、氯霉素②、注射用頭孢噻肟鈉和農用鏈霉素表現為藥劑濃度越高，抑制效果越顯著，而注射用頭孢曲松鈉和利福平在藥劑濃度50 000和20 000 mg/L差異不顯著，羅紅霉素分散片、諾氟沙星和硫酸新霉素在藥劑濃度20 000和10 000 mg/L差異不顯著，氨芐西林和頭孢拉定在藥劑濃度5 000和2 500 mg/L差異不顯著，這幾種藥劑在其他藥劑濃度中的抑制作用均呈現顯著差異。

在同一藥劑濃度下，不同藥劑對梨火疫病菌的抑制效果亦有顯著差異。藥劑濃度50 000 mg/L，利福平與氨芐西林、注射用青霉素鈉與頭孢拉定的抑菌作用差異不顯著；藥劑濃度20 000 mg/L，注射用頭孢曲松鈉與諾氟沙星，諾氟沙星與氨芐西林的抑菌作用差異不顯著；藥劑濃度10 000 mg/L，氯霉素②與氨芐西林的抑菌作用差異不顯著，而其他藥劑之間的抑菌作用均差異顯著。注射用青霉素鈉和氯霉素②在藥劑濃度2 500 mg/L時，氨芐西林和頭孢拉定在藥劑濃度5 000和2 500" mg/L，對梨火疫病沒有抑制作用。圖2

2.3" 9種藥劑對梨火疫病菌的毒力回歸方程

研究表明，9種藥劑對梨火疫病菌的毒力作用中，當抑菌圈直徑達到9 mm時，藥劑濃度從高至低是氯霉素①、注射用頭孢曲松鈉、注射用頭孢噻肟鈉、諾氟沙星、硫酸新霉素、農用硫酸鏈霉素、利福平、氨芐青霉素、羅紅霉素分散片，有效成分濃度分別是7.27、9.36、9.59、13.31、37.75、60.37、102.92、1 094.46和2 220.24 mg/L，在使用同等劑量時，氯霉素①、注射用頭孢曲松鈉、注射用頭孢噻肟鈉和諾氟沙星的抑制作用最大，毒力最強，氨芐青霉素和羅紅霉素分散片對梨火疫病菌均有抑制作用，但達到同等抑制作用時，使用有效成分濃度高，抑制作用最差，毒力最弱。表2

2.4" 9種藥劑對庫爾勒香梨花器安全性評價

研究表明，不同藥劑對花器的損害存在顯著差異。農用硫酸鏈霉素與氨芐青霉素存在顯著差異，與利福平和硫酸新霉素存在極顯著差異，噴灑利福平和硫酸新霉素的花器受害程度重，其余8種藥劑花器受害程度較輕。利福平和硫酸新霉素對花器的危害較大，花器受害程度可達到4級，對花器 2/3 以上造成損害。氨芐青霉素對花器的危害程度為3級；氯霉素①、注射用頭孢曲松鈉、注射用頭孢噻肟鈉、羅紅霉素分散片、諾氟沙星和農用硫酸鏈霉素對花器的危害程度較輕為1級 ，僅對花器邊緣造成輕微損傷 ，并且對花器的損害程度與農用硫酸鏈霉素相比，不存在差異。圖3

3" 討 論

3.1

氯霉素對革蘭氏陽性和陽性細菌、立克次氏體、衣原體均有抑制作用和抗菌作用［21］。氯霉素主要與細菌70 s核蛋白體上的50 s亞基相結合，對合成蛋白質的關鍵酶的活性進行抑制，阻止蛋白質合成，表現出較強的抑菌作用［22］。與研究結果一樣，同一種藥劑的不同藥劑濃度和同一濃度不同藥劑的室內毒力測定，氯霉素對梨火疫病菌的抑制作用的效果都是最好的。盡管氯霉素對細菌有較強的殺菌作用，如何合理地使用氯霉素防治梨火疫病還需要進一步研究。

諾氟沙星是喹諾酮類藥劑，具有抗菌譜廣、殺菌能力強，與其他抗菌藥無交叉耐藥性等特點，諾氟沙星通過作用于細菌內的兩種酶，導致細菌的DNA復制受損而使細菌死亡［23-24］。研究結果表明，諾氟沙星在對梨火疫病菌的抑制作用強于農用硫酸鏈霉素，同時在對梨樹的安全性上也優于農用硫酸鏈霉素。

注射用頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉都為第三代頭孢菌素類藥劑，兩種藥劑對梨火疫病菌有較強的抑制作用，并且在梨樹上使用的安全性也很高，注射用頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉對梨火疫病菌的抑制作用和毒力僅低于氯霉素。頭孢噻肟鈉通過與細菌的受體結合蛋白結合，抑制粘轉肽酶，破壞細胞壁的合成，從而達到快速殺菌的效果［25］，并且生產上使用的安全性高于農用硫酸鏈霉素，因此，注射用頭孢噻肟鈉和頭孢曲松鈉可以作為控制梨火疫病菌的一種藥劑選擇。

3.2

作為主要防治梨火疫病的主要藥劑農用硫酸鏈霉素，由于耐藥性問題［26-27］，即將停止使用［16］，后續研究中需要對篩選出的藥劑進行混合或交替使用試驗，同時也需篩選一些非藥劑類的藥劑，比如氫氧化鋁、尼古丁、枯草芽孢桿菌表面活性劑、銀達因、膠體銀等［28］，與篩選出的藥劑混合或者交替使用。

4" 結 論

從22種供試藥劑中篩選出13種有抑菌效果的藥劑，氯霉素①、注射用頭孢曲松鈉、注射用頭孢噻肟鈉和諾氟沙星的抑制效果顯著優于其它藥劑；氯霉素①、注射用頭孢曲松鈉、注射用頭孢噻肟鈉、諾氟沙星和農用硫酸鏈霉素對花器的危害程度較輕，氯霉素①、諾氟沙星、頭孢曲松鈉和注射用頭孢噻肟鈉可以作為防治梨火疫病的理想藥劑。

參考文獻（References）

［1］

李洪濤，張靜文，盛強，等.我國20個梨品種（種質）對國外梨火疫病菌的抗病性評價［J］.果樹學報，2019，36（5）：629-637.

LI Hongtao， ZHANG Jingwen， SHENG Qiang，et al.Resistance evaluation of 20 pear varieties（germplasms）in China to foreign strains of Erwinia amylovora［J］. Journal of Fruit Science， 2019，36（5）：629-637.

［2］ 朱建裕，廖曉蘭，高必達，等.梨火疫細菌實時熒光PCR和誘捕PCR-ELISA檢測方法的建立［J］.植物檢疫，2003，17（1）：7-10.

ZHU Jianyu， LIAO Xiaolan， GAO Bida， et al.The establishment of detection of real time fluorescent PCR and capture PCR-ELISA for detection of fire blight Erwinia amylovora［J］. Plant Quarantine， 2003，17（1）：7-10.

［3］ 楊金花，徐葉挺，張校立.梨火疫病研究進展［J］.分子植物育種，2022，20（3）：1003-1013.

YANG Jinhua， XU Yeting，ZHANG Xiaoli.Advances of Fire Blight in Pear ［J］. Molecular Plant Breeding， 2022， 20（3）：1003-1013.

［4］ 彭晗，樸美花.梨火疫病檢測技術的研究進展［J］.科學技術創新，2017，（27）：77-78.

PENG Han， PIAO Meihua.Research progress of pear fire blight detection technology ［J］. Scientific and Technological Innovation， 2017，（27）：77-78.

［5］ 李雪松.梨火疫病的發生與防治［J］ .河北農業科技，2008，（18）：26.

LI Xuesong.The occurrence and control of pear fire blight ［J］. Hebei Agricultural Science and Technology，2008，（18）：26.

［6］ 胡白石.梨火疫病菌的風險分析及檢測技術研究［D］.南京：南京農業大學，2000.

HU Baishi.Risk analysis and detection of Phytophthora piricola ［D］. Nanjing：Nanjing Agricultural University， 2000.

［7］ 魯晏宏，郝金輝，羅明，等.梨火疫病拮抗菌篩選及溫室防效測定［J］.微生物學通報， 2021， 48（10）：3690-3699.

LU Yanhong， HAO Jinhui， LUO Ming， et al.Screening of antagonistic bacteria against Erwinia amylovora and its control effect in greenhouse ［J］. Microbiology China， 2021， 48（10）：3690-3699.

［8］ 劉華威.梨火疫病原菌核糖體基因結構序列的特征研究及病菌的分子檢測［D］.烏魯木齊：新疆農業大學碩士論文，2008.

LIU Huawei. Sequence characteristics of ribosomal genetic structure Erwinia amylovory and Molecular Detection of the pathogen［D］. Urumqi：Xinjiang Agricultural University， 2008.

［9］ 舒曉玲，李穎華，張華，等.梨樹枝干病害的發生與防治［J］.現代園藝，2013，（17）：88.

SHU Xiaoling， LI Yinghua， ZHANG Hua， et al.The occurrence and control of branch and trunk diseases of pear trees ［J］. Contemporary Horticulture， 2013，（17）：88.

［10］ 吳惠秋.梨火疫病菌luxI基因的功能分析及群體感應信號分子的鑒定［D］.南京：南京農業大學，2013.

WU Huiqiu.Functional analysis of luxI gene and determination of QS signal molecules of Erwinia Amylovora ［D］. Nanjing：Nanjing Agricultural University， 2013.

［11］ 梁慧敏，劉君，王希東，等.梨火疫病抑菌制劑的室內篩選［J］ .新疆農業科學，2019，56（2）：333-344 .

LIANG Huimin， LIU Jun， WANG Xidong， et al.Indoor screening of antibacterial agents against pear fire blight ［J］. Xinjiang Agricultural Sciences， 2019， 56（2）：333-344.

［12］ 王雪，高潔，張靜，等.63種殺菌劑對西瓜、甜瓜細菌性果斑病菌的室內毒力測定［J］.吉林農業大學學報，2012，34（6）：612-617，623．

WANG Xue， GAO Jie， ZHANG Jing， et al.Virulence Evaluation of63Bactericides to Acidovorax avenae subsp.citrulli on Watermelon and Muskmelon［J］. Journal of Jilin Agricultural University， 2012，34（6）：612-617，623．

［13］ Suzanne M.Slack， Kellie J.Walters， Cory A.Outwater， et al.Effect of kasugamycin， oxytetracycline， and streptomycin on in-orchard population dynamics of Erwinia amylovora on apple flower stigmas ［J］. Plant Disease， 2021，105（6）：1843-1850

［14］ Cabrefiga J， Montesinos E.Analysis of aggres siveness of Erwinia amylovora using disease-dose and time relationships［J］.Phytopathology， 2005， 95（12）：1430-1437．

［15］ 黃露，何芬，秦智慧，等.殺菌劑對獼猴桃潰瘍病菌的室內毒力測定及田間防效［J］.中國南方果樹，2017，46（2）：137-140，143.

HUANG Lu， HE Fen， QIN Zhihui， et al.Indoor virulence determination and field efficacy of fungicides against kiwifruit ulcer fungus［J］. South China Fruits， 2017， 46（2）：137-140，143.

［16］ 姚玉榮，霍建飛，賁海燕，等.7種殺菌劑對大白菜軟腐病菌的室內毒力測定［J］.天津農業科學， 2022，28（S1）：53-56.

YAO Yurong， HUO Jianfei， BEN Haiyan， et al.Toxicity Determination of 7 Bactericides on Chinese Cabbage Soft Rot ［J］. Tianjin Agricultural Sciences， 2022， 28（S1）：53-56.

［17］ 張盧慧，趙志強，趙全新，等.辣椒細菌性果實條斑病菌生物學特性及抑菌藥劑篩選［J］.中國農學通報，2021，37（25）：125-131.

ZHANG Luhui， ZHAO Zhiqiang， ZHAO Quanxin， et al.Biological Characteristics of Pseudomonas argentinensis Causing Fruit Streak Disease on Pepper and Screening of Bactericides［J］. Chinese Agricultural Science Bulletin， 2021， 37（25）：125-131.

［18］ 慕立義.植物化學保護研究方法［M］ .北京：中國農業出版社，1994．

MU Liyi.Phytochemical Protection Research Methods ［M］ .Beijing：China Agriculture Press， 1994.

［19］ 毛雪琴，張慧琴，黃武權，等.9種殺菌劑對藍莓枝枯病菌的室內毒力測定［J］.浙江農業科學，2020，61（2）：275-276，280.

MAO Xueqin， ZHANG Huiqin， HUANG Wuquan， et al.Indoor virulence determination of nine fungicides against blueberry twig blight fungus ［J］. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences， 2020， 61（2）：275-276，280.

［20］ 王璐瑤，仇智靈，姚海峰，等.甘薯莖腐病菌室內藥劑毒力篩選試驗［J］.浙江農業科學，2018，59（2）：300-304，321.

WANG Luyao， QIU Zhiling， YAO Haifeng， et al.Indoor agent virulence screening test of sweet potato stem rot fungus ［J］. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences， 2018， 59（2）：300-304，321.

［21］ 馮 惠，唐一秋.不同前處理方法對魚肉中氯霉素殘留檢測研究［J］.分析檢測，2022，（9）：72-74.

FENG Hui， TANG Yiqiu.Determination of Chloramphenicol Residue in Fish by Different Pretreatment Methods ［J］. Journal of Analysis and Testing， 2022，（9）：72-74

［22］郭晨蕾.一株氯霉素降解細菌的分離鑒定及其降解特性研究［D］. 哈爾濱：哈爾濱工業大學，2021.

GUO Chenlei. Isolation，Identification and Degradation Characteristics of a Chloramphenicol-degrading Bactteria ［D］.Harbin：Harbin Institute of Technology， 2021.

［23］ 鄭云谷.四種氟喹諾酮類抗生素對秀麗隱桿線蟲的多世代效應及機理研究［D］.上海：上海應用技術大學，2022.

ZHENG Yungu.Multi-generational effects of our fluoroquinolones on mechanisms of Caenorhabditis elegans Shanghai ［D］.Shanghai：Shanghai Institute of Technology， 2022.

［24］ 左鑫.OxyR在細菌對氟喹諾酮類抗生素的耐藥性產生過程中的作用［D］.重慶：西南大學，2021.

ZUO Xin.The role of Oxy R in the process of bacterial resistance to fluoroquinolone antibiotics ［D］.Chongqing：Southwest University， 2021.

［25］ 唐達.注射用頭孢噻肟鈉丙磺舒鈉在家兔體內的藥代動力學研究［D］.重慶：西南大學，2014.

TANG Da.Study on pharmacokinetics of Combination of Cefotaxime Sodium and Probenecid Sodium in rabbits ［D］.Chongqing：Southwest University， 2014.

［26］ Tancos K A， Cox K D.Effects of consecutive streptomycin and kasugamycin applications on epiphytic bacteria in the apple phyllosphere ［J］. Plant Disease， 2017， 101（1）：158-164．

［27］ McGhee G C， Guasco J， Bellomo L M， et al .Genetic analysis of streptomycin-resistant（SmR）strains of Erwinia amylovora suggests that dissemination of two genotypes is responsible for the current distribution of SmR E.amylovora in Michigan ［J］. Phytopathology， 2011， 101（2）：182，191.

［28］ Yang C Y， Zhong Y， Powell C A， et al.Antimicrobial Compounds Effective against Candidatus Liberibacter asiaticus Discovered via Graft-based Assay in Citrus［J］. Scientific Reports， 2018， 8（1）：17288.

Toxicity determination of Twenty-two antibiotics against oear fire blight and its safety evaluation on floral organ

LIU Zhenya， SU Xuanle，TANG Li， JIANG Siming， LI Yapeng， DAN Hongxia， ZHANG Wangbin

（National and Local Joint Engineering Laboratory of High Efficiency and Superior Quality Cultivation and Fruit Deep Processing Technology of Characteristic Fruit Trees in Southern Xinjiang/ Key Laboratory of Integrated Pest Management（IPM）of Xinjiang Production and Construction Corps in Southern Xinjiang /Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Aral， MARA，" Tarim University， Aral"" Xinjiang 843300， China）

Abstract：【Objective】 This research aims to screen out antibiotics that can effectively control Erwinia amylovora in the hope of providing technical support for the green safety prevention and control of the disease.

【Methods】 22 kinds of antibacterial agents and preparations were screened in the laboratory using bacteriostatic circle， and then the safety on floral organ of Korla Fragrant Pear was evaluated.

【Results】" 13 kinds of antibiotics had good antibacterial effect on Erwinia amylovora， and when the diameter reached 9 mm， the effective concentration of chloramphenicol①， cefotaxime sodium for injection， ceftriaxone sodium for injection and norfloxacin from low to high in order were 5.30，7.60，9.88，11.64 mg/L， indicating that using the same dosage， the inhibitory effect of four antibiotics were stronger than those of other antibiotics; The floral organ of Korla Fragrant Pear suffered less injury when using the chloramphenicol①， cefotaxime sodium for injection， ceftriaxone sodium for injection， roxithromycin dispersible tablet and norfloxacin.

【Conclusion】" The selected chloramphenicol ①， norfloxacin， ceftriaxone sodium for injection and cefotaxime sodium for injection can be used in the field to control Erwinia amylovora in fields.

Key words： Erwinia amylovora; bacteriostatic circle; toxicity test in the lab; safety evaluation

Fund project：The S amp; T Research Project of XPCC \"Study on Dynamic Monitoring and Control Techniques of Shoot Blight in Southern Xinjiang\"（2018AB038）

Correspondence author： ZHANG Wangbin（1974-）， male， from Chengcheng Shanxi，professor， research field：Plant Pathology，（E-mail）zwbzky@163.com