氣單胞菌屬低溫淀粉酶基因改造與原核表達

doi：10.6048/j.issn.1001-4330.2024.02.025

摘" 要：【目的】獲取低溫淀粉酶基因，分析其相關功能，為工業生產上的應用提供參考。

【方法】以氣單胞菌（Aeromonas）LA77為出發菌株克隆低溫α-淀粉酶基因，以BL-21（DE3）為宿主菌進行克隆。分析其它已知氣單胞菌屬低溫α-淀粉酶基因同源性，設計特異引物， PCR擴增獲得C13片段，將其克隆到pMAL-2X，轉化到BL-21（DE3）中，篩選藍白斑，驗證PCR及EcoRⅠ和HindⅢ的雙酶切，獲得高效表達生物工程菌株pMAL-2X-C13。設計定點突變引物，以pMAL-2X-C13為模板，獲得低溫淀粉酶基因突變株三株C19、C29、C43。

【結果】表達蛋白的分子大小為114kD，突變菌株C19蛋白表達量均高于pMAL-2X-C13。

【結論】低溫淀粉酶基因突變株C19比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表達量更高。

關鍵詞：氣單胞菌屬；α-低溫淀粉酶；基因改造；原核表達

中圖分類號：S188""" 文獻標志碼：A""" 文章編號：1001-4330（2024）02-0479-06

收稿日期（Received）：

2023-06-21

基金項目：

新疆維吾爾自治區重點研發任務專項（2022B02053-3）；第三次新疆綜合科學考察（2022xjkk1204）；新疆農業科學院自主培育項目團隊建設專項（nkyzztd-001）

作者簡介：

楚敏（1977-），女，新疆烏魯木齊人，副研究員，碩士，研究方向為微生物學與分子生物學，（E-mail）chuliu2002@163.com

通訊作者：

張志東（1977-），男，新疆烏魯木齊人，研究員，博士，

研究方向為微生物生態， （E-mail）zhangzheddong@sohu.com

0" 引 言

【研究意義】淀粉酶（amylase）是指水解淀粉和糖原的酶類通稱［1］。低溫淀粉酶多由低溫微生物分泌，因其催化條件更溫和，反應能耗更低，其適冷機制主要歸因于獲取低溫淀粉酶基因及其相關功能。獲取低溫淀粉酶基因，有利于揭示酶作用機理及微生物冷適應性機制。【前人研究進展】Feller等 ［2，3］從南極篩選到一株低溫淀粉酶產生菌Alteramonas haloplanctis A23，發現該酶在0～30℃具有高效的低溫催化能力。此后相繼有文獻報道從南北極［4，5］、冰川［6］的低溫土壤以及海洋［7，8］中分離得到低溫淀粉產生菌。【本研究切入點】目前，低溫酶產生菌酶活不高且產量低，而誘變、基因工程等分子手段對其進行基因改造和高效表達能有效地解決該問題［9，10］。【擬解決的關鍵問題】以氣單胞菌株LA77為出發菌株，分析低溫淀粉酶序列同源性，PCR擴增獲得編碼基因，將該基因連接到載體pMAL-2X中，轉化到BL-21（DE3）表達；設計定點突變引物，定點改造低溫淀粉酶基因，提高蛋白表達量，為低溫淀粉酶基因進一步提高酶活提供參考。

1" 材料與方法

1.1" 材 料

1.1.1" 質粒與菌株

分離新疆一號冰川土樣獲得低溫α-淀粉酶產生菌LA77，載體pMAL-2X，宿主菌BL-21（DE3）由新疆農業科學院微生物應用研究所保存。

1.1.2" 試劑和儀器

pMD19-T，pMAL-2X，限制性內切酶（TaKaRa，大連）， 凝膠回收試劑盒（博大泰克，北京），PCR 擴增儀（Eppendoff，德國），DNA 電泳儀（Bio-Rad，美國），雙穩數顯電泳儀（DG-3，北京）和凝膠成像儀（Bio-Rad，美國），超速離心機（Hitachi，日本）。

1.2" 方 法

1.2.1" 氣單胞菌LA77基因組DNA的提取

將氣單胞菌LA77接種于LB液體培養基中，30℃ ，200 r/min過夜培養，離心管收集菌體，提取總DNA，參考文獻 ［7，8］方法。

1.2.2" 低溫α-淀粉酶基因的克隆

根據其保守區域設計上下游引物Primer up：（5'-ATGCGTCGCTCTCCTCG-3′），Primer down：（5′-TCAAGGTACGGT TGCAGTGG-3′），進行低溫淀粉酶基因片段的PCR擴增。PCR反應體系50 μL：2.0 μL基因組DNA，上下游引物各1.0 μL，tag酶1.0 μL，Buffer 10.0 μL，H2O 35 μL。PCR擴增 條件：94℃ 5 min ，94℃ 1 min ，59℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 7 min。目的片段通過電泳回收純化后，連接到pMD19-T載體上轉化到宿主菌DH5α中。藍白斑篩選以及PCR擴增驗證后，陽性克隆子送往上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.3" 低溫α-淀粉酶基因的構建

設計合成含酶切位點EcoRⅠ和HindⅢ的引物。F-E：（5′-CCGGAATTCATGCGTCGCTCTCCTCGCTTCT-3′）; R-H：（5′-CCCAAGCTTCTACGGCTGCCGACCGG-3′）。PCR反應體系：1.0 μL基因組DNA，引物各1.0 μL，Buffer 5.0 μL，dNTP 2.0 μL，Mg2+ 2.0 μL，tag酶1.0 μL，H2O 38 μL。PCR擴增條件：95℃ 5 min ，94℃ 1 min ，59℃ 45 s，72℃ 2 min，35個循環；72℃ 7 min。用EcoRⅠ和HindⅢ（NEB）雙酶切純化的PCR產物和pMAL-p2X載體電泳回收后連接轉化入DH5α。挑取單克隆提質粒進行PCR及酶切驗證。

1.2.4" 低溫a-淀粉酶基因定點突變

根據 M695 位點Val→Ala設計引物， up：5-ATCGACGGCTTCCGCGC-3′，down：5-GCGCGGAAGCCGTCGAT-3′，分別與down：5′-TCAAGGTACGGTTGCAGTGG-3′ ，up：5′-ATGCGTCGCTCT CCTCG-3′做對擴增后，以擴增產物為模版，以down：5′-TCAAGGTACGGTTGCAGTGG-3′ ，up：5′-ATGCGTCGCTCTCCTCG-3′為引物擴增全長，測序后獲得定點突變體19#; 根據M549位點Leu→Met，設計引物，up：5′-CACGACACCAAGCTGTTCTTT-3′，down：5′-AAAGAACA GCTTGGTGT CGTG-3′; 分別與down：5′-TCAAGGTACGGTTGCAGTGG-3′，up：5′-ATGCGTCGCTCTCCTCG-3′作引物擴增后，以擴增產物為模版，以down：5′-TCAAGGTACGGTTGCAGTGG-3′ ，up：5′-ATGCGTCGCTCTCCTCG-3′為引物擴增全長，測序后獲得定點突變體29#。

1.2.5" 低溫α-淀粉酶蛋白誘導表達

將構建好的陽性克隆子轉化到BL21（DE3）表達菌株，轉化方法同DH5α。挑取DE3對應菌株，接菌到少量LBAmp+液體培養基中，搖菌過夜。按5%接種量接菌到50 mL LBAmp+液體培養基中，搖菌到OD600=0.6，取2 mL作為誘導前的對照樣品，剩余的添加終濃度1 mM的TPTG，于37℃搖床誘導過夜，收集菌液作為誘導后樣品。誘導溫度梯度為15、20、25、30和37℃。誘導時間梯度為3、6 h、過夜分別取4 mL樣品。12 000 r/min 離心1 min，收集菌體，加5×SDS 上樣Buffer，混勻，100℃水煮10 min，上樣10～20 μL，SDS-PAGE蛋白凝膠120 V電泳約1 h，考馬斯亮藍染色15 min，脫色后觀察。

2" 結果與分析

2.1" 低溫淀粉酶基因的克隆

研究表明，提取低溫淀粉酶總DNA，通過PCR擴增，獲得一條大于2 100 bp左右的特異條帶，與蛋白質SDS-PAGE電泳結果推測的低溫α-淀粉酶基因片段大小相似。回收后連接到PMD 19-T克隆載體上，經過藍白班篩選、PCR鑒定后送北京鼎國昌盛生物技術有限公司測序。圖1，圖2

所獲得的序列經手工校正并拼接后，確定所擴增基因序列大小為2 133 bp。所得序列經DNAStar及NCBI ORF Finder在線分析，確定該段基因有多個開放閱讀框，其中一個基因開放閱讀框大小為2 112 bp。將基因序列放在NCBI上進行序列比對后發現，與該基因序列有較高的覆蓋率和同源性的僅為5個，均來源于氣胞菌屬淀粉酶基因，且均為全基因測序，最高同源性為95%，而與不同屬的基因序列比對覆蓋率非常低，最高僅為12%，獲得的淀粉酶基因具有較強的屬內保守性。該基因編碼蛋白與α-淀粉酶氨基酸序列有較高同源性，且于同屬間同源性相對較高，均大于90%，其中于Aeromonas salmonicida 產生的淀粉酶同源最高達到96%，而與不同屬的淀粉酶氨基酸序列普遍較低，最大同源性僅為52%，獲得的淀粉酶氨基酸序列具有較強的屬內保守性。該基因序列及其編碼氨基酸序列已上傳NCBI，并獲得Genebank號：KF712275。圖3

2.2" 低溫淀粉酶基因的構建

研究表明，pMAL載體含有編碼麥芽糖結合蛋白（Maltose Binding Protein， MBP）的大腸桿菌malE基因，其下游的多克隆位點便于目的基因插入，N端帶有MBP的融合蛋白。通過tac強啟動子和malE翻譯起始信號使克隆基因獲得高效表達，并利用MBP對麥芽糖的親和性達到用Amylose柱對融合蛋白的進一步親和純化。

根據pMAL-p2X載體圖，結合低溫淀粉酶序列酶切位點，設計在片段兩端插入EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點。載體和片段均用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切連接后，轉化到宿主菌中。挑取單克隆做雙酶切驗證以及菌落PCR鑒定，一條帶2 000 bp，另一條帶6 700 bp左右，與目的條帶及載體大小一致。陽性克隆送北京鼎國昌盛生物技術有限公司測序，測序結果與低溫淀粉酶基因的克隆測序結果一致。圖4，圖5

2.3" 低溫a-淀粉酶基因定點突變

研究表明，活化位點及催化位點周邊氨基酸相對保守，但也存在細微區別。設計相關引物獲得了突變體19#：695 Val→Ala；突變體29#：549 Leu→Met，突變體43#。由于蛋白在編碼折疊時的不確定性，設計定29#突變點位于活化中心，，19#位于活化中心的后端，43#位于活化中心前端，全面涵蓋氨基酸序列的各個主要部分，提高了獲得高效表達菌株的可能性。圖6

2.4" 低溫淀粉酶誘導表達

研究表明，低溫a-淀粉酶全長2 112 bp，約74 KD加上MBP標簽蛋白40 KD，表達蛋白約114 KD，屬于分子量較大的融合蛋白。將構建好的工程菌轉化到宿主菌BL-21（DE3）中，以重組質粒13#為模式菌株進行初步誘導表達，以空載體做對照，在最佳誘導蛋白表達條件下，即IPTG濃度為1 mM時在30℃誘導6 h后， 110 KD左右有明顯的目的條帶。但融合蛋白多以包涵體形式在沉淀里存在，部分在上清中。即使將誘導溫度降低至15℃，仍有大量目的蛋白在沉淀中，是融合蛋白分子量太大，無法完全表達。圖7

最佳誘導條件即IPTG濃度為1 mM時在30℃誘導6 h。在此條件下將突變體43#、19#、29#與原始序列13#比較目的蛋白的含量高低，29#突變體在電泳中在

110 KD處沒有特異性條帶，其融合蛋白并未表達。19#突變體蛋白表達量略高于13#基因，43#突變體與13#基因蛋白表達量相似，從蛋白電泳中幾乎無法區別。圖8

3" 討" 論

利用定點突變技術有效提高酶活已成為重要手段，可以有目的地在 DNA 序列中插入、取代或去除若干核苷酸片段，可以改變一段

DNA序列，也可以改變特定堿基位點，從而改變氨基酸，得到突變酶蛋白［11］。通過定點突變技術有效的改變提高酶的活力，增強酶的穩定性，使酶在與底物的催化反應中對反應條件的要求極大的降低。研究是通過對3個特定的氨基酸位點合理突變，從而改變酶的理化性質和反應活力。 研究設計定29#突變點位于活化中心，19#位于活化中心的后端，43#位于活化中心前端，結果發現突變點位于活化中心的片段蛋白不表達，蛋白質作為一個分子整體，存在著很多遠程效應，一些關鍵位點的突變對蛋白質結構的整體產生重要的影響，蛋白質分子設計較復雜，具體原因還需要進一步的深入分析。α-淀粉酶己經被廣泛應用于食品，農業，發酵，紡織品，藥品，洗滌和釀造等工業領域，是最為重要的工業酶制劑之一［12］。酶的穩定性對工業生產至關重要，對淀粉酶進行的定向改造，能更好地解決低溫淀粉酶在工業生產中的低穩定性。

4" 結" 論

對一株氣單胞菌屬的低溫淀粉酶產生菌LA77，設計引物進行分子克隆，獲得了大小為2 112 bp的低溫淀粉酶基因。將目的基因連接到含有編碼麥芽糖結合蛋白的pMAL-p2X高效表達載體上，獲得了大小約114 KD的蛋白，獲得低溫淀粉酶基因突變株C19，比原始菌株pMAL-2X-C13淀粉酶基因蛋白表達量更高。

參考文獻（References）

［1］

Tucke G A，Woods L F J著，李雁群，肖功年譯.酶在食品加工中的應用（第二版）［M］.北京：中國輕工業出版社，2002.

Tucke G A，Woods L F J.Enzymes in food processing（2rd Edition translated by LI Yanqun，XIAO Gongnian）［M］.Beijing：China Light Industry Press， 2002.

［2］Charles G， Mohamed A， Mostafa B， et al.Cold-adapted enzymes：from fundamentals to biotechnology ［J］.Trends in Biotechnology， 2000， 18（3）：103-107.

［3］ Feller G， D’Amico D， Gerday C.Thermodynamic stability of a cold active amylase from the psych rophile Alteromonas haloplanctzs ［J］. Biochemistry， 1999， 38（14）：4613-4619.

［4］ Cotrle瘙塅 M， Negoi瘙塅 T G， Bahrim G E， et al.Partial characterization of cold active amylases and proteases of Streptomyces sp.from Antarctica ［J］. Brazilian Journal of Microbiology， 2011， 42（3）868-877.

［5］ Zhang J W， Zeng R Y.Purification and Characterization of a Cold-Adapted α-Amylase Produced by Nocardiopsis sp.7326 Isolated from Prydz Bay， Antarctic［J］.Marine Biotechnology，2008， 10（1）：75-82.

［6］王曉紅，茆軍，傅力，等，低溫淀粉酶產生菌的篩選及酶學性質研究［J］，農產品加工， 2007， （1）：7-9.

WANG Xiaohong， MAO Jun， FU Li， et al.Filtration and Enzymology Property of cold-active Amyase-producing Fungus［J］. Farm Products Processing， 2007，（1）：7-9.

［7］ Gobius K S， Pemberton J M.Molecular cloning， characterization， and nucleotide sequence of an extracellular amylase gene from Aeromonas hydrophila.［J］. Journal of Bacteriology， 1988， 170（3）：1325-1332.

［8］ Lu M S， Fang Y W， Li H Z， et al.Isolation of a novel cold-adapted amylase-producing bacterium and study of its enzyme production conditions［J］. Annals of Microbiology， 2010， 60（3）：557-563.

［9］ Alikhajeh J， Khajeh K， Ranjbar B， et al.Structure of Bacillus amyloliquefaciens-amylase at high res o lution：i" mplications for thermal stability［J］." Acta Cryst，2010， 66（2）：121-129.

［10］ Lu M S， Wang S J， Fang Y W， et al.Cloning， expression， purification， and characterization of cold-adapted α-amylase from Pseudoalteromonas arctica GS230.［J］. Protein Journal， 2010， 29（8）：591-597.

［11］ 閆亞茹.理性設計提高低溫α-淀粉酶穩定性的研究［D］.保定：河北農業大學，2018.

YAN Yaru.Improvement of the stability of cold-adaption α-amylase through rational design ［D］.Baoding：Hebei Agricultural University， 2018.

［12］王翔，沈盼盼，周玉玲，等.低溫淀粉酶菌株分離及其酶學性質研究［J］.湖北大學學報（自然科學版），2018，40（5）：448-451，456.

WANG Xiang， SHEN Panpan， ZHOU Yuling， et al.The producing strain isolation and enzymatic properties of a cold-active amylase ［J］. Journal of Hubei University（Natural Science Edition），2018，40（5）：448-451，456.

Gene modification and" expression of α cold-adapted amylase

in Aeromonas

CHU Min， SHI Yingwu，GU Meiying，YANG Hongmei，HUO Xiangdong， ZHANG Zhidong

（Xinjiang Laboratory of Special Environmental Microbiology/Institute of Applied Microbiology， Xinjiang Academy of Agricultural Sciences， Urumqi 830091， China）

Abstract：【Objective】 In order to obtain the low-temperature amylase gene and its related functions， and better apply it in industrial production.

【Methods】 Cloning of the low temperature ɑ-amylase gene from the starting strain LA7 to BL-21 （DE3）. Other known low temperature ɑ-amylase gene was" homology analysis，design specific primers，and C13 fragment was obtained by PCR amplification.Then clone it to pMAL-2X，Convert it to BL-21 （DE3），and screening blue and white spots.The ɑ-amylase gene was verified by PCR and double enzyme digestion of EcoRⅠ and Hind Ⅲ，the highly expressed bioengineering strain pMAL-2X-" C13was obtained.The site directed mutagenic primers was design，take" pMAL-2X- C13 as the template，three mutant strains of low temperature amylase gene C19， C29 and C43 were obtained.

【Results】 SDS-PAGE test result display that the molecular size of the protein is 114 kD and the protein expression of mutant strain C19 was higher than that of strain pMAL-2X- C13.

【Conclusion】 The protein expressed of mutant strain C19 more than the original strain" pMAL-2X- C13.It provides a scientific and theoretical basis for the future application of the engineering bacteria in industrial production.

Key words：Aeromonas; α cold-adapted amylase;genetically engineered; procaryotic expression

Fund projects：Key R amp; D Project in Xinjiang Uygur Autonomous Region \"Xinjiang Agricultural Microbial Fermentation and Biological Enzyme Preparation Key Technology Research and Development（2022B02053-3）；The Third Comprehensive Scientific Expedition In Xinjiang \"Investigation of Stress-Resistant Microbial Resources in Tuha Basin and Its Application Potential Assessment\" （2022xjkk1204）；The Independent Cultivation Project Team Construction Special Project of Xinjiang Academy of Agricutural Sciences \"Xinjiang Special Environment Microbial Resources Digging and Utilization Innovation Team\"（nkyiztd-001）

Correspondence author： ZHANG Zhidong（1977-）， male， from Urumqi， Xinjiang， Professor， Dr.research field：Microbial ecology，（E-mail）zhangzheddong@sohu.com