紫花苜蓿、白三葉硒蛋白的提取方法篩選及工藝優化

摘要： "硒蛋白是微量元素硒（Se）在生物體內發揮生物學作用的主要形式，對宿主在抗氧化、抗炎、提高免疫力等方面有重要意義。為探究不同豆科牧草硒蛋白提取方法篩選及其工藝優化，本研究以紫花苜蓿（Medicago sativa）和白三葉（Trifolium repens）為原材料，采用堿提法（NaOH）、鹽提法（NaCl）、酸提法（HCl）和水提法（H2O）4種溶劑提取法獲得牧草硒蛋白，并在單因素試驗基礎上進行正交試驗優化硒蛋白提取工藝。結果表明：堿提法提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白效果最好。紫花苜蓿最佳工藝條件為溫度40℃、料液比1∶20 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，硒蛋白提取率為35.39%。白三葉最佳工藝條件為溫度50℃、料液比1∶40 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，硒蛋白提取率為35.52%。本研究可為從豆科牧草中提取硒蛋白提供重要的技術支持和實踐指導。

關鍵詞： 紫花苜蓿；白三葉；硒蛋白；提取；工藝優化

中圖分類號：S431.4 """文獻標識碼：A """"文章編號： 1007-0435（2024）02-0654-07

Extraction Method Screening and Process Optimization of

Alfalfa and White Clover Selenoprotein

WU Qian-qian， SU Ya， ZENG Xiang-ming， LI Dong-heng， CHENG Wei， HAO Jun*

（Department of Pratacultural Science， Institute of Animal Science， Guizhou University， Guiyang， Guizhou Province 550025， China）

Abstract： "Selenoprotein is the main form of trace element selenium （Se） that plays its biological role in organisms，such as antioxidant，anti-inflammatory，and immune improvement. The purpose of this study was to screen and optimize different forage selenoprotein extraction methods. Using alfalfa and white clover as raw forage materials，the selenoprotein was extracted by alkali extraction（NaOH），salt extraction（NaCl），acid extraction（HCl） and water extraction（H2O），and the selenium protein extraction process was optimized by orthogonal test on the basis of single-factor test. The results showed that： The extraction of alfalfa and white selenoprotein by alkali extraction were the best. The optimal process conditions for alfalfa were temperature 40℃，material-liquid ratio of 1∶20 g·mL-1，alkali concentration of 0.15 mol·L-1，and the extraction rate of selenoprotein was 35.39%. The best process conditions for white clover were temperature 50℃，material-liquid ratio of 1∶40 g·mL-1，and alkali concentration of 0.15 mol·L-1，under which the extraction rate of selenoprotein was 35.52%. This study can provide important technical support and practical guidance for extracting selenoprotein from legume forage.

Key words： Alfalfa;White clover;Selenoprotein;Extraction;Process optimization

紫花苜蓿（Medicago sativa）又稱苜蓿、紫苜蓿，是我國分布最廣泛和栽培最早及利用效益最高的豆科牧草之一［1］，因其蛋白質含量高，營養豐富且全面，適應性廣，被譽為“牧草之王”［2］。白三葉（Trifolium repens）又名白車軸草、白三草等，為豆科（Leguminosae）車軸草屬（Trifolium）的多年生草本植物［3］，具有優質、高產和適應性廣等特點，是我國西南地區重要的優質牧草［4］。白三葉含有較高的粗蛋白質、礦物質和維生素，初花期平均蛋白質含量高達24.00%［5］。

硒蛋白是硒生理活性發揮的主要存在形式［6］。硒蛋白不僅具有蛋白質的結構特性，還具有硒的物理和化學特性，在調節細胞氧化應激和內質網應激，提高免疫功能和抗炎癥反應等生物功能特性方面發揮作用，對克山病、癌癥和阿爾茲海默癥等多種疾病有治療和預防作用［7］。硒蛋白提取方法與普通蛋白質提取法相似。隨著對硒蛋白的不斷研究，硒蛋白提取方法有水提法、鹽提法、堿提法、醇提法、酶提法和輔助提取法等［8］。溶劑提取法因易操作、成本低等優點應用較多。梁潘霞等［9］采用溶劑提取法提取大米硒蛋白，研究發現堿提法是最佳的提取方法。程利增［10］采用超聲波輔助鹽法提取茶葉硒蛋白，并確定最佳工藝條件為NaCl濃度0.75 mol·L-1、液固比40（mL·g-1）、提取溫度50℃、超聲時間120 min，在此條件下蛋白提取率為63.68%。曾睿［11］采用提取液（0.05 mol·L-1 NaOH，0.5% NaSO4，2.5% DTT，M固∶M液=1∶12）35℃超聲波清洗機，經真空冷凍干燥，獲得水稻富硒蛋白粉。Wu等［12］采用了4種提取方法（水提法、超聲輔助提取法、脈沖電預處理后水提取法、脈沖電預處理法加超聲輔助提取法）提取了富硒小豆蔻蛋白質，發現超聲輔助提取方法提取的蛋白質純度最高為77%。近年來，研究人員同時利用了一些富硒植物提取硒蛋白，如富硒黑小麥［13］、富硒大米［14］、富硒茶［15］等。

目前，關于紫花苜蓿和白三葉葉蛋白的提取工藝已有研究報道，但有關紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取工藝尚無系統的研究。因此，本試驗以紫花苜蓿和白三葉為原料，研究對比不同方法提取牧草硒蛋白，并采用單因素正交試驗設計，獲得最佳工藝條件，以期為從常見豆科牧草中提取硒蛋白提供重要的技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗區域

試驗地位于貴州省開陽縣禾豐鄉田沖村（6°59′23.83″N，106°53′56.27″E），種植前進行旋耕、翻土、曬土、整平工作，劃定兩個試驗區域，并將石灰與自來水混合，均勻撒灌于試驗地用于調節土壤pH。供試土壤理化指標如下表：

1.2 試驗材料

豆科牧草種子為紫花苜蓿‘賽迪7號’和白三葉‘好友’，均購于貴州眾智恒生態科技有限公司。2021年3月，兩個試驗區域按20 kg·hm-3播種量，采用撒播方式分別種植紫花苜蓿和白三葉。播種后，定期澆水、施肥和除雜草。2021年11月10日，刈割地上部分的新鮮紫花苜蓿（現蕾初期）和白三葉（現蕾盛期至始花期）。將采收后的牧草帶回實驗室于105℃下殺青30 min后65℃烘干至恒重，經QE-200打草機（浙江屹立工貿有限公司）粉碎成草粉，密封置于干燥器中備用。試驗材料硒含量如下表：

1.3 試驗設計

1.3.1 硒蛋白提取 ""紫花苜蓿和白三葉草粉各稱取3 g，分別與H2O、0.1 mol·L-1的NaOH、NaCl和HCl 4種提取液按l∶20 g·mL-1的比例混合， 混合液于常溫下在搖床中震蕩提取3 h，并于25℃下4 000 r·min-1離心20 min，分離取上清液在冰浴下緩慢加入4倍溶液體積丙酮于-24℃冰箱，放置12 h沉淀蛋白，4℃下10 000 r·min-1離心15 min，倒掉上清液在通風櫥讓丙酮揮發，干燥至恒重得到硒蛋白樣品，測定處理后樣品中蛋白含量及硒含量［9］。根據蛋白質在不同浸提液中溶解度不同來選擇最佳提取劑。

1.3.2 單因素試驗設計 ""在得到最佳提取劑的基礎上，按照1.3.1所述提取方法進行單因素試驗。選取溫度、料液比和提取液濃度3個因素，固定其中2個因素的水平不變，研究一種因素的不同水平對試驗結果的影響；分別研究不同溫度（20℃，30℃，40℃，50℃，60℃）、料液比（1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 g·mL-1）、提取液濃度（0.05，0.10，0.15，0.20，0.25 mol·L-1）對硒蛋白提取的影響。

1.3.3 "正交試驗設計 ""參考單因素結果，對溫度、料液比和提取液濃度進行三因素三水平L9（34）正交試驗設計（表3），以提取率為研究指標，分析L9（34）正交試驗結果的極差確定其最佳提取工藝條件。

1.4 測定項目及方法

1.4.1 硒的測定 ""草粉中的硒與1.3.1提取樣品中硒的測定均采用原子熒光光譜法。稱取適量樣品，加入9 mL HNO3和1 mL HClO4混合物，在150℃下消化2.5 h。消化結束后，在6 mol·L-1 HCl介質中，將試樣中的Se6+還原成Se4+，經冷卻后使用25 mL容量瓶定容。將10 mL試樣消化液移入15 mL離心管中，加入6 mol·L-1 HCl 2.0 mL，10%K3Fe（CN）61.0 mL，混合后放置2 h進行測量［16］。同時做空白對照。

1.4.2 硒蛋白含量的測定 ""草粉中的蛋白質與提取的樣品中硒蛋白含量測定均采用凱氏定氮法。稱取試樣0.5 g（準確至0.000 2 g）至消化管底部，加入CuSO4 0.4 g，K2SO4 6 g，與試樣混合均勻后加入H2SO4 10 mL，將消化管放在通風櫥420℃的消化爐中消化，待消化管中液體呈淡黃色或綠色澄清后，停止消化。將消化管置于半自動凱氏定氮儀，同時使用裝有20 mL 2% H3BO3和2滴混合指示劑的三角瓶吸收NH3。蒸餾結束后，使用0.1 mol·L-1 HCl標準溶液滴定吸收液，當溶液由藍綠色變成灰紅色為滴定終點，記錄HCl用量［17］。同時做空白試驗校正。

1.4.3 硒得率的計算 ""硒得率（%）=硒蛋白質量/草粉中硒質量×100%［14］。

1.4.4 硒蛋白提取率的計算 ""硒蛋白提取率（%）=提取物中蛋白質量/草粉中蛋白質量×100%［14］。

1.5 數據分析

所有試驗均重復3次，結果取平均值。采用Excel 2016和Origin 2023軟件對數據進行分析整理和圖形繪制，SPSS 20.0進行顯著性分析和單因素方差分析。

2 結果

2.1 不同提取溶劑對硒蛋白提取效果的影響

由圖1可知，4種溶劑中NaOH提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的效果最好，硒得率顯著高于NaCl、H2O和HCl提取液（Plt;0.05），NaOH提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的硒得率分別為42.06%和40.00%。HCl溶劑提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白效果最差，顯著低于其他提取液（Plt;0.05），硒得率分別為紫花苜蓿12.60%和白三葉16.59%。NaCl和H2O對2種牧草硒得率的影響差異不顯著。因此，本試驗紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的提取均采用NaOH作為提取劑。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 "溫度對硒蛋白提取效果的影響 ""由圖2可知，隨溫度增加，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率呈先增后減的趨勢。當溫度為50℃時，紫花苜蓿硒蛋白提取率達到最大，值為37.97%。溫度超過50℃后，紫花苜蓿硒蛋白提取率隨著溫度的升高而下降，且溫度為50℃和60℃處理組之間硒蛋白提取率差異顯著（Plt;0.05），提取率下降了8.74%。當溫度為40℃時，白三葉硒蛋白提取率最大為35.86%。因此，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取最佳溫度分別為50℃和40℃。

2.2.2 "料液比對硒蛋白提取效果的影響 ""由圖3可知，1∶30 g·mL-1的料液比處理下紫花苜蓿硒蛋白提取率顯著高于其他處理組（Plt;0.05），提取率最大為35.45%。1∶10 g·mL-1處理下紫花苜蓿硒蛋白提取率顯著低于其他處理組（Plt;0.05），在該處理下提取率僅為20.69%。當料液比從1∶10 g·mL-1增加到1∶20 g·mL-1，提取率增幅較大，增加了12.91%。白三葉硒蛋白提取率隨料液比增加呈先增后減的趨勢，1∶30 g·mL-1處理下白三葉提取率最大為37.51%，且與1∶40 g·mL-1處理組差異不顯著，考慮成本問題選擇1∶30 g·mL-1為白三葉最佳料液比。綜上，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取最佳料液比均為1∶30 g·mL-1。

2.2.3 堿濃度對硒蛋白提取效果的影響 ""由圖4可知，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率隨堿濃度遞增呈現先增后減的趨勢。堿濃度0.05 mol·L-1處理下2種牧草硒蛋白提取率顯著低于其他處理組（Plt;0.05），紫花苜蓿硒蛋白提取率僅為24.14%，白三葉為27.58%。堿濃度0.15 mol·L-1處理下2種牧草硒蛋白提取率顯著高于其他處理組（Plt;0.05），硒蛋白的提取率最大分別為39.60%和38.13%。因此，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取最佳堿濃度均為0.15 mol·L-1。

2.3 正交試驗蛋白提取工藝的結果

由表4中的極差R值可以看出，溫度（A）、料液比（B）、堿濃度（C）這3個因素對于牧草硒蛋白提取率的影響程度不同，三者對于紫花苜蓿的影響程度的關系為：Cgt;Agt;B，對于白三葉的影響程度的關系為：Agt;Bgt;C，即堿濃度是影響紫花苜蓿提取率的最主要因素，而溫度是影響白三葉提取率的最主要因素。試驗4號提取的紫花苜蓿硒蛋白提取率最高，由極差分析可知，A2B1C2是最好的組合，即紫花苜蓿硒蛋白最佳提取工藝參數為溫度40℃、液料比1∶20 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，在此條件下硒蛋白提取率為35.39%。試驗9號提取的白三葉硒蛋白提取率最高，由極差分析可知，A3B3C2是最好的組合，即白三葉硒蛋白最佳提取工藝參數為溫度50℃、料液比1∶40 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，在此條件下硒蛋白提取率為35.52%。

為進一步驗證A（溫度）、B（料液比）和C（堿濃度）對紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率影響的主次順序，利用SPSS 20.0進行單因素方差分析。由表5可知，因素A、B和C的P值小于0.01，表明溫度、料液比和堿濃度對紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的提取有極顯著影響。由F值可以得出各因素對紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率顯著性影響的順序為紫花苜蓿：Cgt;Agt;B，白三葉：Agt;Bgt;C，這與極差分析的結果一致 。

3 討論

本研究通過溶劑提取法提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白，得出NaOH作為溶劑提取硒蛋白效果最好，這與梁潘霞等［9］所提取大米硒蛋白結果一致。這可能是在堿性條件下，紫花苜蓿、白三葉的結構變得疏松，并且氫鍵、酰胺鍵和二硫鍵等次級鍵發生水解，進而釋放更多的蛋白質［18］。余芳等［19］采用NaOH、NaCl、Tris-HCl（pH 8.0）和PBS（pH 8.0）提取液提取富硒綠茶中的硒蛋白，也發現堿提法提取硒蛋白效率更高，且硒主要存在于堿溶性蛋白質中，有30.3%的硒與堿溶性蛋白質結合。本試驗中發現堿提液色澤深，其原因可能是堿液激烈的氧化和腐蝕性，導致了美拉德反應［10］。

在單因素試驗中，紫花苜蓿硒蛋白提取溫度由20℃升高到50℃時，提取率迅速上升，當溫度超過50℃后，硒蛋白提取率下降。隨著溫度的增加，蛋白質的空間構型發生改變，有助于其與水的相互作用，加快紫花苜蓿和白三葉中蛋白質的溶解。當溫度升高到一定范圍時，高溫使部分蛋白質發生變性，導致蛋白質的溶解少［20］。溫度越高不僅會破壞硒蛋白的結構，影響其生物活性，還會造成能耗過高，增加生產成本。當液料比為1∶10 g·mL-1時，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率較低。在低料液比值條件下，提取液的黏度較大，導致分子擴散速率較低，從而影響蛋白分子的溶出，并且蛋白質量濃度較高，分子間的相互斥力會阻礙更多蛋白的溶出［21］，易造成硒蛋白的損失和提取不完全。同時，在提取過程中由于提取物粘性過大，硒蛋白提取效率降低，對提取設備和環境造成不利影響。隨著料液比的增大，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率呈下降趨勢，原因一方面是蛋白質質量濃度和體系黏度逐漸變低，另一方面是蛋白質的溶解度可能達到了飽和狀態［22］。當堿濃度從0.05 mol·L-1增加到0.15 mol·L-1時，紫花苜蓿和白三葉硒蛋白提取率增加，這是因為堿溶液能有效提高蛋白質的溶解性，增加蛋白質的提取產率，但堿提法提取時間較長，堿濃度過高會導致蛋白生成賴丙氨酸，改變硒蛋白的生理功能［23］。此外，在強堿條件下蛋白質中的一些氨基酸易發生縮合反應，使蛋白質變性水解［24］。因此，在提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的過程中，堿濃度不宜過大。

在單因素試驗和正交試驗的工藝優化下，2種牧草硒蛋白的提取工藝不同，紫花苜蓿：溫度40℃、料液比1∶20 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，白三葉：溫度50℃、料液比1∶40 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1。羅晶等［14］使 用超聲波細胞粉碎儀輔助堿法提取大米硒蛋白，其最佳工藝條件為堿濃度0.4%、料液比1∶10、超聲波功率220 Hz，提取時間2 h，在此條件下硒蛋白提取率為57.95%。郭哲等［24］采用超聲輔助堿法提取酒糟硒蛋白，最佳工藝條件為超聲時間40 min、堿液濃度0.12 mol·L-1、提取時間3 h、料液比1∶9，在此條件下硒蛋白的提取率達到最大，值為54.26%。本試驗盡管對紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的提取進行工藝優化，但提取率低，仍需探究富集方法后進一步分析。袁莉婷等［25］采用單一堿法和超聲波輔助堿法提取海帶蛋白，發現超聲波輔助堿法提取海帶蛋白的提取方式優于單一堿法提取，不僅能有效縮短提取時間，還可以提高蛋白提取率。楊夢蓮［26］采用堿法、超聲波破碎法以及超聲波輔助堿法3種方法分別提取富硒靈芝硒蛋白，蛋白提取得率經超聲波輔助后，提取效率明顯提升，蛋白提取率為37.2%。因此，在紫花苜蓿和白三葉硒蛋白的提取過程中，可通過復合提取法提高硒蛋白提取率。目前，由于富硒蛋白的分離和純化繁瑣且耗時，不利于工業應用，需要開發更簡單、綠色、高效的分離純化方法，從而降低工藝的復雜性。

4 結論

本試驗采用堿提法、鹽提法、酸提法和水提法4種溶劑提取法提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白，研究溫度、堿濃度和料液比3個因素對硒蛋白提取率的影響，并通過正交試驗發現，堿提法提取紫花苜蓿和白三葉硒蛋白效果最好。其中，影響紫花苜蓿提取率的主次因素為堿濃度gt;溫度gt;料液比，紫花苜蓿硒蛋白提取最佳工藝條件為溫度40℃、料液比1∶20 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，在此條件下硒蛋白提取率為35.39%。影響白三葉提取率的主次因素為：溫度gt;料液比gt;堿濃度，白三葉硒蛋白提取最佳工藝條件為溫度50℃、料液比1∶40 g·mL-1、堿濃度0.15 mol·L-1，在此條件下硒蛋白提取率為35.52%。

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（責任編輯 彭露茜）

收稿日期：2023-07-05；修回日期：2023-11-28

基金項目： "貴州大學大學生創新創業訓練計劃項目（貴大省創字［2021］085號）;貴州省科技計劃項目（黔科合支撐［2020］1Y046號）資助

作者簡介：

吳倩倩（2000-），女，布依族，貴州安龍人，本科生，主要從事牧草飼料栽培及利用研究，E-mail：2070388584@qq.com；*通信作者Author for correspondence，Email：jhao@gzu.edu.cn