外源谷胱甘肽對青花菜硫代葡萄糖苷合成的影響

摘" " 要：為探究谷胱甘肽對硫代葡萄糖苷（GSLs）生物合成的影響，以現蕾期青花菜品種耐寒優秀為試驗材料，研究不同濃度的還原型谷胱甘肽（GSH）、氧化型谷胱甘肽（GSSG）及丁硫堇（BSO）對青花菜花球中硫代葡萄糖苷及其相關底物含量、酶活性和基因表達的影響。結果表明，與CK（蒸餾水）相比，5 mg·L-1 GSH在處理48 h顯著提高了青花菜花球中總硫苷、脂肪族硫苷含量，在24～48 h顯著提高半胱氨酸（Cys）含量，在6～24 h顯著提高了谷胱甘肽含量，在3～12 h顯著提高了硫苷合成相關基因的表達量；45 mg·L-1 GSH處理在48 h顯著降低了青花菜花球中總硫苷、脂肪族硫苷含量，在3～48 h則顯著提高了半胱氨酸含量，在6～48 h則顯著提高了谷胱甘肽含量，在3～12 h顯著抑制了硫苷合成相關基因的表達。與CK相比，5 mg·L-1 GSSG處理下青花菜花球中總硫苷、脂肪族硫苷含量顯著升高，而25、45及65 mg·L-1 GSSG處理則對總硫苷、脂肪族硫苷含量沒有產生顯著影響。綜上所述，外源谷胱甘肽對硫苷含量的影響具有濃度效應，5 mg·L-1 GSH促進硫苷合成，45 mg·L-1 GSH抑制硫苷合成。

關鍵詞：青花菜；硫代葡萄糖苷；谷胱甘肽（GSH）；酶活性；基因表達

中圖分類號：S635.9 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）02-052-09

Effect of exogenous glutathione on the synthesis of glucosinolates in broccoli

CHEN Fangzhen， ZHANG Wenxia， TANG Chenchen， LI Weihuan， WU Zhijian， WANG Junwei， WU Qiuyun， HUANG Ke

（Hunan Provincial Key Laboratory of Vegetable Biology/Engineering Research Center for Horticultural Crop Germplasm Innovation and New Variety Selection and Breeding， Ministry of Education/Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Horticultural Crop Genetic Resources， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， Hunan， China）

Abstract： To investigate the effects of glutathione （GSH） on glucosinolate （GSLs） biosynthesis， the effects of different concentrations of reduced glutathione （GSH）， oxidized glutathione （glutathione disulfide; GSSG）， and glutathione inhibitor （BSO） were studied on the content of glucosinolate and related substrates， enzyme activity， and gene expression in broccoli floret， using the broccoli variety Naihanyouxiu at the budding stage as experimental material. The results showed that， compared to CK， the 5 mg·L-1 GSH treatment significantly increased the total GSL and aliphatic GSL content in broccoli floret at 48 h. It significantly increased cysteine （Cys） content at 24-48 h， significantly increased glutathione content at 6-24 h， and significantly increased the expression of genes related to GSLs biosynthesis at 3-12 h. The 45 mg·L-1 GSH treatment significantly reduced the total GSL and aliphatic GSL content in the broccoli floret at 48 h， while significantly increasing cysteine content at 3-48 h and glutathione content at 6-48 h， and significantly inhibiting the expression of genes related to GSLs biosynthesis at 3-12 h. When compared with CK， the treatment with 5 mg·L-1 GSSG resulted in a significant increase in the content of total GSL， aliphatic GSL in broccoli floret， while treatments with 25， 45， and 65 mg·L-1 GSSG had no effect on the content of total GSL， aliphatic GSL. In conclusion， exogenous glutathione has a concentration effect on the GSLs content， with low concentrations promoting GSLs biosynthesis while high concentrations inhibiting GSLs biosynthesis.

Key words： Broccoli; Glucosinolate; Glutathione（GSH）; Enzyme activity; Gene expression

青花菜（Brassica oleracea L. var. italica Plenck．）為十字花科蕓薹屬甘藍種蔬菜，含有豐富的膳食纖維、礦物質和植物活性物質硫代葡萄糖苷[1]，且具有預防癌癥的效果，經常食用青花菜可以降低患有多種慢性疾病的風險[2-4]，因此市場需求逐年增加，在蔬菜周年供應中占有越來越重要的地位。

硫代葡萄糖苷（簡稱硫苷，glucosinolates，GSLs），是一類富含氮、硫元素的次生代謝產物，主要存在于十字花科植物中[5]。到目前為止，已鑒定的硫苷種類約130種[6]，硫苷生物合成前體物質來源于丙氨酸、亮氨酸、蛋氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，根據前體氨基酸的不同可分為脂肪族硫苷、吲哚族硫苷和芳香族硫苷[7-8]。植物中硫苷生物合成包括3個關鍵步驟：前體氨基酸的側鏈延伸、核心結構的構建以及側鏈的二次修飾[9-10]。其核心結構的形成和代謝途徑的主要基因都已被鑒定[10-11]。簡而言之，前體氨基酸被CYP79家族的細胞色素P450轉化為醛肟，其中CYP79B2催化色氨酸吲哚-3-乙醛肟，CYP79F1轉化所有長鏈型甲硫氨酸衍生物[12-13]。接下來，醛肟被CYP83家族的細胞色素P450氧化為活性化合物（氧化腈或酸式硝基化合物），活化的醛肟在多功能酶GSTs的作用下與硫供體（Cys或GSH）結合生成s-烷基硫代氫肟酸鹽，其中GSTF11和GSTU20催化脂肪硫苷合成，GSTF9和GSTF10催化吲哚硫苷合成[14-15]，當以GSH為硫供體時，硝基化合物與GSH的共軛物還要在γ-谷酰基水解酶（GGP1）的水解作用下才能進入下一步反應。s-烷基硫代氫肟酸鹽通過C-S裂解酶SUR1轉化為硫代氫肟酸[16]，其在UGT74家族的葡萄糖基轉移酶和硫轉移酶的作用下形成脫硫葡萄糖苷，其中UGT74B1被證明能代謝苯丙氨酸的衍生物，UGT74C1在脂肪硫苷生物合成中起作用[17-18]。脫硫硫苷在磺基轉移酶ST的作用下硫酸化形成完整的硫苷核心結構。

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一種由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽[19]，以GSH（還原型）和GSSG（氧化型）存在植物體內，其中以GSH為主，且只有GSH具有生理活性[20]。GSH被稱為“主要抗氧化劑”，可直接或者間接參與植物活性氧（ROS）清除[21]。影響谷胱甘肽合成的因素有很多，但最重要的是γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）活性和半胱氨酸（Cys）濃度，γ-ECS是GSH合成的限速酶（由GSH1編碼），其活性受到細胞內GSH濃度的反饋抑制，當GSH濃度過高時，GSH與γ-ECS的調節位點結合，使活性中心變構失活，從而抑制GSH的合成。谷胱甘肽與GSLs合成的關系主要有2個方面：一方面是，谷胱甘肽可作為GSLs合成的還原性硫供體；另一方面是，谷胱甘肽通過調節初級硫代謝間接影響GSLs的合成[22-23]。已有研究發現，外源GSH處理優先激活抗性系統提高植物抗氧化能力，抑制GSLs合成[24]。然而，外源谷胱甘肽對硫苷合成調控機制的研究報道較少。因此，筆者研究的目的是通過測定硫代葡萄糖苷的組分和含量、硫苷合成過程中關鍵基因的表達量、GSH的含量和GSH1、GSH2的表達，初步分析GSH影響青花菜硫苷合成的主要途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試青花菜品種為耐寒優秀，種子購自高華種子有限公司。試驗于2022年12月至2023年2月在湖南農業大學蔬菜科研基地進行。選取飽滿一致的種子播種于裝有育苗基質的50穴育苗盤中育苗。待幼苗生長至4片真葉時，將植株定植在裝有育苗基質的栽培袋中置于塑料大棚內。青花菜植株現蕾后，挑選長勢一致無病蟲害的植株，進行外源谷胱甘肽處理。

本試驗設置了GSH、GSSG、BSO（索萊寶生物科技有限公司）3個處理，GSH和GSSG設置4個處理：5、25、45、65 mg·L-1，BSO設置1個處理：25 mg·L-1，以蒸餾水作為對照，試驗采取隨機區組設計。將大棚劃分為10個小區，將各處理隨機排列，每小區種植18株，6株為1次重復，每個處理共3次重復。處理期間于08：00開始噴施，以花球均勻布滿液滴為準（每小區各噴施1200 mL），每隔3 d處理1次。共噴施7次，最后1次處理時，選取無病蟲害的花球分時間點于0、3、6、12、24 h取樣進行基因表達和生理分析，于48 h取樣進行硫代葡萄糖苷含量分析及其他生理分析。取樣時，用小刀從花莖基部將花球割下，再用剪刀將花蕾剪下并用錫箔紙包好后迅速放入液氮冷凍，保存-80 ℃冰箱備用。

1.2 方法

1.2.1 硫代葡萄糖苷含量測定 硫代葡萄糖苷含量檢測參照已報道的方法[25-26]，并略做修改。稱取0.1 g冷凍干燥樣品，加入4 mL 70%甲醇和100 μL Sinigrin（5 mmol·L-1，內標）提取20 min，提取后，加入醋酸鋇，8000 r·min-1離心10 min。收集上清液，沉淀中加入70%甲醇重新提取，混合提取的上清液。將提取液加入DEAE Sephadex A 25層析柱，液體流盡后加入硫酸酯酶，室溫反應16 h后洗脫獲得脫硫硫苷溶液。使用高效液相色譜法檢測硫苷含量（b）并計算（以μmol·g-1表示）。

硫苷含量/（μmol·g-1）=。

1.2.2 半胱氨酸（Cys）含量和γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）活性測定 采用索萊寶生物科技有限公司的試劑盒對半胱氨酸（Cys，BC0185）含量、γ-ECS（BC1215）活性進行測量。

1.2.3 谷胱甘肽含量測定 采用索萊寶生物科技有限公司的試劑盒對谷胱甘肽（GSH，BC1175）含量進行測定[27-28]。

1.2.4 RNA的提取及表達量的分析 采用Steady Pure Plant RNA Extraction Kit試劑盒（湖南艾科瑞）從青花菜花球中提取總RNA。以不同處理的青花菜花球RNA為模板，按照TransScript All-in-One First-Strand cDNA SynthesisSuperMix for qPCR試劑盒（南京諾唯贊）用1 μg總RNA合成cDNA。將100 ng·μL-1的cDNA樣品使用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix試劑盒（南京諾唯贊）制備qPCR反應溶液。實時熒光定量PCR分析根據青花菜目的基因的cDNA序列利用國家生物技術信息中心（NCBI）設計擴增基因序列的引物（表1），引物由擎科生物科技有限公司合成。使用2?ΔΔCT方法分析表達數據。

1.3 統計分析

采用Microsoft Excel整理所得數據并繪制表格和柱形圖，利用SPSS 20.0統計軟件對所有數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 外源谷胱甘肽處理對青花菜花球中硫代葡萄糖苷含量的影響

采用高效液相色譜法共檢測出10種硫苷，其中6種為脂肪族硫苷，4種為吲哚族硫苷。由圖1-A可以看出，與CK相比，5 mg·L-1 GSH和5 mg·L-1 GSSG處理下總硫苷含量分別顯著增加了17.4%、19.4%。而45 mg·L-1 GSH處理下總硫苷含量與CK相比顯著降低了21.6%。其他各處理下總硫苷含量與CK相比則沒有顯著變化。

脂肪族硫苷是青花菜中最主要的硫苷種類。由圖1-B可以看出，與CK相比，5 mg·L-1 GSH和5 mg·L-1 GSSG處理下其含量分別顯著提高19.7%、21.5%。而45 mg·L-1 GSH處理使其含量與CK相比顯著降低了20.6%。在其他各處理下，脂肪族硫苷含量與CK相比則無顯著變化。吲哚族硫苷是青花菜中含量較低的硫苷種類。由圖1-C可以看出，GSH處理下，吲哚族硫苷含量隨處理濃度的升高呈先降低后升高的趨勢，GSSG處理下，吲哚族硫苷含量隨處理濃度的升高呈先降低后升高的趨勢。與對照CK相比，25 mg·L-1 GSH和45 mg·L-1 GSH處理下吲哚族硫苷含量顯著降低了17.0%和33.1%。與對照相比，25、45和65 mg·L-1 GSSG處理下吲哚硫苷含量分別顯著下降34.84%、13.40%、9.60%。25 mg·L-1 BSO處理下其含量則沒有顯著變化。

綜上所述，與對照相比，5 mg·L-1 GSH處理下青花菜花球中總硫苷含量顯著上升，45 mg·L-1 GSH處理下總硫苷含量顯著降低。與對照相比，5 mg·L-1 GSSG處理下，青花菜花球中總硫苷含量和脂肪族硫苷含量顯著上升。結果表明，不同類型谷胱甘肽對青花菜花球中硫苷含量的影響基本相同，而不同濃度處理對青花菜花球中硫苷含量的影響不同，顯示出谷胱甘肽對青花菜花球硫苷含量的影響具有濃度效應。基于這些結果，選取最佳處理質量濃度5 mg·L-1 GSH和45 mg·L-1 GSH的樣品進行全參數分析。

2.2 外源谷胱甘肽處理對青花菜花球中硫代葡萄糖苷合成相關基因表達的影響

通過RT-qPCR檢測了8個硫苷合成相關基因的相對表達水平，了解外源谷胱甘肽處理后青花菜花球基因表達規律。由圖2可知，與對照相比，在5 mg·L-1 GSH處理后，青花菜花球中GSTF11、GSTU20、GGP1、UGT74C1、GSTF10、GSTF9的表達均得到了誘導，且除UGT74C1在GSH處理后3 h上調效果最顯著外，其他基因在處理后6 h上調效果最顯著。與對照相比，在45 mg·L-1GSH處理后GSTF11、GSTU20、GGP1、UGT74C1、GSTF10、GSTF9的表達被抑制，其中GSTF11、GSTF10在GSH處理后6 h和12 h抑制效果顯著，GSTU20在GSH處理后6 h抑制效果顯著。結果表明，與對照相比，5 mg·L-1 GSH處理能夠有效誘導硫苷合成基因表達，而45 mg·L-1 GSH處理對硫苷合成基因表達有顯著抑制作用。

2.3 外源谷胱甘肽處理對青花菜花球中谷胱甘肽合成的影響

2.3.1 外源谷胱甘肽處理對青花菜花球中GSH1和GSH2基因表達的影響 分析5、45 mg·L-1 GSH外源噴施處理下青花菜谷胱甘肽合成關鍵基因GSH1和GSH2在24 h內的表達情況。由圖3-A可以看出，與對照相比，GSH1的表達量在5 mg·L-1 和45 mg·L-1 GSH處理后的3 h和6 h顯著下調。與CK相比，處理后3 h分別下調了51%和39%，處理后6 h分別下調了37%和62%。但5 mg·L-1 和45 mg·L-1 GSH處理間GSH1的表達量在處理后沒有顯著差異。與CK相比，5 mg·L-1 和45 mg·L-1 GSH處理下，GSH2的表達量沒有顯著變化。結果表明，外源噴施GSH處理對GSH1和GSH2表達沒有顯著影響。

2.3.2 外源谷胱甘肽處理對青花菜花球中Cys含量和γ-ECS活性的影響 Cys是合成植物體內谷胱甘肽的底物，γ-ECS是植物體內谷胱甘肽合成途徑中的關鍵酶。通過GSH對γ-ECS活性的反饋抑制，調控GSH的生物合成量。由圖4-A可以看出，與CK相比，5 mg·L-1 GSH處理下Cys含量在24 h和48 h分別顯著提高了47%和36%；45 mg·L-1 GSH處理下Cys含量在3 h至48 h內都顯著積累，且在24 h和48 h積累效果最明顯，與CK相比提高了48%和51%。由圖4-B可以看出，不同濃度的GSH處理下γ-ECS活性無顯著變化。由此可知，外源噴施GSH顯著提高了青花菜花球中Cys含量，但是對γ-ECS活性則無顯著影響。

2.3.3 外源谷胱甘肽處理對青花菜花球中GSH含量的影響 由圖5可知，5 mg·L-1 GSH處理后的6、12、24 h青花菜花球中GSH含量均顯著高于CK，而處理后48 h后 GSH含量與CK相比沒有顯著差異。GSH含量在45 mg·L-1 GSH處理6～48 h內均顯著高于CK，較CK相比分別提高了1.28、0.77、1.11和0.54倍。結果表明，外源噴施5 mg·L-1 GSH在6～24 h內顯著增加了青花菜花球中谷胱甘肽含量，外源噴施45 mg·L-1 GSH在6～48 h內顯著增加了其含量。

3 討論與結論

硫代葡萄糖苷是十字花科植物富含硫的次生代謝物，在植物防御和人體營養中具有重要的生物學和經濟作用。谷胱甘肽與代謝物結合形成新的代謝物，參與植物的代謝調節。許多研究表明，谷胱甘肽作為還原性硫供體和活化醛肟偶聯參與GSLs生物合成。在非十字花科植物本氏煙草中發現GSLs部分的形成涉及GSLs偶聯中間體，該化合物由γ-谷氨酰基肽酶（GGP1）代謝，通過代謝積累的谷胱甘肽偶聯物顯著促進硫代葡萄糖苷的產生[29]。對突變體pad2和cad 2-1的分析中，兩種突變體都比野生型植物含有更少的GSH和更多的Cys，盡管硫苷含量不變，但這兩個突變體在昆蟲誘導下，吲哚型硫苷的含量下降[30]。在筆者的試驗中，通過GSH及GSSG處理，確定外源施用低濃度GSH和GSSG對GSLs生物合成具有積累效應，施用高濃度GSH對GSLs生物合成具有抑制作用，施用高濃度GSSG使GSLs含量略有下降，證實GSH參與GSLs的合成且依賴于相應的濃度。這可能是因為低濃度GSH使GSLs合成相關基因的表達上調導致GSLs含量顯著積累，高濃度GSH使GSLs合成相關基因的表達下調導致GSLs含量顯著下降。對GSH處理的擬南芥的分子分析中發現，與色氨酸和GLS生物合成途徑相關的基因被谷胱甘肽顯著上調，因此推斷GSH誘導GSLs的生物合成[31]，這與筆者的試驗結果相似。

低濃度GSH使GSLs合成相關基因的表達上調導致GSLs含量顯著積累，高濃度GSH使GSLs合成相關基因的表達下調導致GSLs含量顯著下降。這可能是由于青花菜花球吸收了外源施用的GSH，并將其轉運到細胞室中導致細胞內GSH及Cys含量升高，調節了GSLs合成相關基因表達從而介導了GSLs的生物合成。植物很容易吸收外源施加的谷胱甘肽，并將其轉運到細胞室中，誘導一系列生理和生化過程，包括調節基因表達、細胞分裂、生殖生長發育和蛋白質活性[32]。Cys既是GSH的降解產物，也是代謝前體，作為GSH合成的前體，可以進一步轉化為Met用于脂肪族GSLs的生物合成[33-34]。GSH運輸到需要還原硫的器官后，部分GSH被降解為Cys，以進一步結合到其他分子中，如蛋白質和輔酶[32]。Cys的吸收量明顯高于GSH的吸收量，這種吸收速率的差異導致抑制硫酸鹽攝取和轉運所需的Cys濃度比引起同樣抑制的GSH濃度低一個數量級[35]。隨著細胞內GSH濃度升高及降解Cys含量開始積累，高濃度的Cys可能抑制了硫酸鹽攝取和轉運，GSLs合成基因的下調導致GSLs含量的下降。王丹[36]研究報道，缺硫脅迫下小白菜葉片中的硫苷合成相關基因通過25 mg·L-1 GSH進行葉面噴施而先上調后下調導致總硫苷含量下降同時顯著增加了GSH和Cys含量，25 mg·L-1 GSSG處理雖然使大部分硫苷合成基因上調，但顯著降低了總硫苷含量，增加了GSH及Cys含量；Sinha等[31]報道，脅迫狀態下外源GSH處理可以誘導硫苷合成關鍵基因的表達以及硫苷含量的上升；何超超[37]報道，25 mg·L-1 GSH處理使小白菜葉片脂肪族和吲哚族合成相關基因表達下調，但對脂肪族和吲哚族硫苷含量沒有影響，而GSH、Cys含量積累GSH1及初生硫代謝關鍵基因表達水平下降。25 mg·L-1 GSSG處理使小白菜葉片脂肪族和吲哚族合成相關基因表達上調，硫苷含量上升，Cys含量短暫上升而后下降，初生硫代謝關鍵基因表達上調。這與本試驗結果相似，但本研究中GSH合成關鍵基因GSH1及GSH2表達水平不受GSH處理影響。這可能是由于GSH1和GSH2由茉莉酸和重金屬誘導[33，38]，對光和某些應激條件（如干旱和某些病原體）也有反應。但到目前為止，相對較差的條件被證明能顯著誘導GSH1或GSH2轉錄。無論是外部施加的H2O2還是細胞內產生的H2O2，都不會導致擬南芥中GSH1或GSH2轉錄水平的升高，盡管在這些條件下谷胱甘肽的含量得到了顯著提升[33，39]。在本試驗中，外源噴施不同濃度的GSH后，GSH1和GSH2表達量沒有發生變化，γ-ECS酶活性同樣沒有變化。說明外源噴施GSH對GSH生物合成沒有產生影響。

與對照相比，5 mg·L-1 GSH和5 mg·L-1 GSSG處理后青花菜花球中GSLs含量顯著積累，45 mg·L-1 GSH處理后GSLs被顯著抑制。基于這些結果，選取最佳處理濃度5 mg·L-1 GSH和45 mg·L-1 GSH的樣品進行全參數分析。結果表明，與對照相比，5 mg·L-1 GSH處理下，外源GSH誘導青花菜花球中GSTF11、GSTU20、GGP1、UGT74C1、GSTF10和GSTF9的表達上調，同時顯著提高了花球中GSH和Cys的含量。與對照相比，45 mg·L-1 GSH處理下，外源GSH下調了青花菜花球中GSTF11、GSTU20、GGP1、UGT74C1、GSTF10和GSTF9的表達量，但顯著提高了花球中GSH和Cys的含量。這說明，外源GSH通過處理濃度差異誘導和抑制基因表達對硫苷生物合成產生影響，低濃度GSH處理誘導硫苷合成基因表達，高濃度GSH處理抑制硫苷合成基因表達從而介導GSLs的合成。

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