西瓜雄性不育類型的遺傳學鑒定與胚胎學觀察

摘" " 要：為了明確西瓜雄性不育材料的不育類型和花藥敗育時期，以西瓜雄性不育系GMS4為材料，對花蕾不育性狀進行田間觀察統計，利用石蠟切片法觀察西瓜花藥發育過程。結果表明，該材料不育性狀由1對隱性基因控制，為細胞核雄性不育類型。可育株雄蕊發育正常，不育株雄蕊較小，花藥干癟無花粉，可育株和不育株雌蕊發育無明顯差異，均可正常結瓜。從花藥發育的整個過程來看，在花藥發育早期，可育株和不育株花藥結構形態差別不大，在小孢子母細胞減數分裂期，不育株異常絨氈層細胞過度增殖，體積小，排列不整齊，擠壓藥室，無二分體和四分體形成，在花藥發育后期，無花粉粒形成，最終導致西瓜雄性不育發生。據此認為，花藥敗育發生時期在小孢子母細胞減數分裂期。

關鍵詞： 西瓜； 細胞核雄性不育； 減數分裂； 絨氈層

中圖分類號：S651 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）02-015-06

Genetic identification and embryological observation of male sterile watermelon

GAO Ningning， LI Xiaohui， KANG Liyun， WANG Yan， CHANG Gaozheng， LIANG Shen， LI Hailun， WANG Huiying， ZHAO Weixing

（Horticulture Institute， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450002， Henan， China）

Abstract： In order to determine the sterility type and anther sterilization period of male sterile watermelon， the male sterile line GMS4 was used as the material to observe the sterility characters of flower buds in the field， and the development process of watermelon anther was observed by the paraffin section method. The results showed that the sterile material was controlled by a pair of recessive genes， which was the type of nuclear male sterility. The stamen of fertile plant was normal while that of sterile plant was small， with shripped auther and no pollen. There was no difference in pistil development between fertile strain and sterile plant， and both of them could bear fruit normally. In the early anther development， there was little difference in anther structure and morphology between fertile and sterile plants. In the meiotic phase of microspore mother cells， the abnormal tapetum cells proliferate excessively， were small in size， irregular in arrangement， squeezed drug chamber， and no dyad and tetrad were formed. No pollen grains were formed at the late anther development stage， which resulted in male sterility. It concluded that anther abortion occurred during the meiosis stage of microspore mother cells.

Key words： Watermelon; Nuclear male sterility; Meiosis; Tapetal layer

雜種優勢在提高作物產量、品質和抗性等方面發揮著重要作用，是目前生產實踐中重要的作物改良途徑，培育作物雜交新品種已成為國內外種業發展的主要方向[1]。西瓜屬于異花授粉植物，雜種優勢強，但在制種時需要人工授粉、套袋處理，制種成本高、工作量大且純度難以保證[2-3]。雄性不育一直是育種研究的熱點，在小麥[4]、玉米[5]、水稻[6]、辣椒[7]、黃瓜[8]等作物上已有大量研究，但有關西瓜雄性不育的研究較少[9-10]。在大豆[11]、辣椒[12]、甘藍[13]等作物上對花藥敗育的細胞學鑒定研究已有相關報道，而關于西瓜雄性不育系花藥細胞學觀察和敗育時期的研究鮮有報道。雄性不育遺傳機制較為復雜，分為兩種類型，一是核基因控制的細胞核雄性不育，其遺傳規律符合孟德爾遺傳定律；二是核基因與線粒體基因共同控制的核質互作雄性不育，表現為母系遺傳[14]。根據雄性不育的表型和細胞學形態，花藥敗育的表現有以下幾種：雄蕊畸形或退化；孢子囊退化，花藥表型正常但沒有花粉；小孢子退化，產生畸形敗育的花粉；花粉功能缺陷，花粉表型正常但無萌發能力；花藥不開裂，花粉有活力但開裂異常[15-16]。

GMS4西瓜材料在田間選育過程中發現部分植株雄花開放后花藥無花粉。利用雄性不育材料進行育種能夠提高制種效率，但小孢子敗育原因較為復雜，且敗育時期從造孢細胞以后的每個發育階段都有可能發生[17]，明確敗育發生的原因及時期對雄性不育系在雜種優勢利用和生產實踐中具有重要意義。因此，筆者以雄性不育系GMS4為材料，鑒定其雄性不育性狀、采用細胞學方法觀察花藥發育時期，明確其敗育時期，初步解析敗育原因，以期為深入研究雄性不育分子調控機制和不育性狀育種應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為西瓜雄性不育系GMS4，由河南省農業科學院園藝研究所西甜瓜課題組提供。2020年3月至2022年7月在河南省農科院原陽基地進行試驗，采用基質穴盤育苗，定植行株距為1.1 m×0.4 m。

1.2 方法

1.2.1 取樣 在盛花期調查西瓜植株育性，通過田間觀察、鏡檢等，統計雄性可育株和不育株，并分別進行標記。采集雄性可育和不育植株雄花花蕾，按照不同發育時期花蕾長度進行取樣，參考前人研究[18]，分別為造孢細胞期＜0.5 mm、花粉母細胞期0.5～1.5 mm、減數分裂期2～3 mm、單-雙核小孢子期4～5 mm和當天開放的雄花，雄花花蕾的長度為花托底部至花蕾頂部，每個時期取3個花蕾，3次重復。利用Nikon Eclipse E100顯微鏡進行鏡檢和圖像采集分析。

1.2.2 石蠟制片 將花蕾放入盛有FAA溶液的離心管中進行花藥固定，石蠟切片制作參考高俊鳳[19]的方法。植物組織切片浸入染液2～5 min后水洗，鏡檢，觀察著色情況，用自來水沖洗后，將切片置于烤箱內烘干；透明封片：切片放入干凈的二甲苯透明10 min，采用中性樹膠封片。將切片置于顯微鏡下，觀察花藥發育過程。

1.2.3 遺傳學鑒定 對雄性不育材料F2代523個植株和測交群體460個植株進行田間觀察，分別統計可育株和不育株，并計算可育株和不育株的分離比。

2 結果與分析

2.1 雄性不育材料性狀鑒定

通過田間觀察鑒定，該材料雄性不育性狀穩定，F2代（396∶127）和測交群體（239∶221）中（圖1），雄性可育和不育的分離比穩定在3∶1和1∶1，遺傳規律符合孟德爾遺傳定律，不育性狀由1對隱性基因控制，為細胞核雄性不育類型。

2.2 雄性不育和可育材料花器官特征

通過田間鑒定，GMS4不育系的不育性狀穩定，不同發育時期雄性可育株與不育株的雄花形態差異較大，雄性可育株的花瓣顏色為深黃色，而不育株的花瓣顏色為淺黃色（圖2-A～B），可育株的雄花花藥較飽滿（圖2-D），開花以后有黃色花粉散出（圖2-E、G），顯微鏡下可觀察到有活性的花粉粒（圖2-I），雄性不育株的雄花花蕾在減數分裂期以后，花藥發育緩慢，花藥明顯小于可育株（圖2-D），開花以后沒有花粉散出（圖2-F、H），顯微鏡下觀察不到花粉粒的存在。雄性不育株雌花發育與可育株無明顯差異，授粉后可以正常結瓜（圖2-C）。

2.3 雄性不育和可育材料花藥發育特征

通過切片觀察，發現在造孢細胞時期，雄性可育株和不育株的花藥細胞結構和形態差異不明顯（圖3-A～B）；花粉母細胞時期，花藥細胞開始分化形成不同的形態結構，雄性可育株花藥壁分化為由外到內的表皮層、藥室內壁層、中層和絨氈層，絨氈層在藥室最內層，呈長方形，排列整齊，為花粉母細胞提供營養。小孢子母細胞呈圓形，較大且排列松散（圖3-C）。與可育株相比，雄性不育株花藥的藥室壁和絨氈層的界限模糊不清，絨氈層細胞多層、不規則且細胞體積小，花粉囊受擠壓，花粉囊較小，小孢子母細胞較小且排列緊密（圖3-D）；減數分裂期，能明顯觀察到雄性可育株的二分體和四分體，絨氈層細胞排列整齊（圖4-A），而雄性不育株花藥絨氈層細胞過度增殖，排列不整齊，擠壓藥室，無二分體和四分體形成，異常小孢子母細胞在藥室中聚集成團（圖4-B）；單-雙核小孢子時期，雄性可育株花藥絨氈層細胞增大，形成空泡，小孢子產生（圖4-C），雄性不育株花藥絨氈層增殖膨大，花粉囊受擠壓變得狹小，不能形成正常的小孢子，僅形成了空泡的異常小孢子，著色較淺（圖4-D）；花粉粒成熟期，可育株花粉粒圓形且著色深，絨氈層細胞降解，花藥開裂，成熟花粉粒散出（圖5-A），而不育株花藥觀察不到成熟花粉粒，整個藥室呈干癟狀，粘連在一起，形成著色深的條帶（圖5-B）。從切片觀察發現，西瓜雄性可育株花藥在各個時期的發育均正常。而不育株花藥除前期造孢細胞時期發育正常，后期發育均存在異常。

3 討論與結論

花藥是雄蕊的重要組成部分，花粉在花藥中發育產生成熟花粉粒，之后進行傳播授粉。花粉發育是一個復雜的過程，任何階段發生異常均會引起雄性不育，敗育形成的時期和原因多種多樣，且依作物不同而異[20-21]。筆者研究發現，西瓜細胞核雄性不育系GMS4在不同的環境條件下性狀穩定，其遺傳規律符合孟德爾遺傳定律，由一對隱性基因控制細胞核雄性不育。這與張顯等[22]對西瓜雄性不育材料Se18的遺傳特性研究結果相同。前人研究發現，雄花花蕾及花藥的色澤、縱橫徑等外觀特征與小孢子發育時期關系密切[23]。筆者的研究對GMS4可育和不育花蕾的表型特征進行了觀察比較，結果發現，雄性可育的花瓣顏色比不育的深，雄性不育株的花蕾縱徑長至2～3 mm以后，花藥大小明顯小于可育株，開花以后，不育株雄花花藥干癟，無花粉產生。這與馬建祥等[24]利用電鏡掃描觀察的西瓜雄性不育兩用系結果一致。花蕾大小與花藥發育時期之間的關系不僅受基因型的影響，同時受環境的影響也較大，因此，在深入研究之前需明確供試材料的花藥敗育時期。

Laser等[20]對被子植物花藥發育過程的研究發現，雙子葉植物花藥敗育時期多在四分體形成前，而單子葉植物的花藥敗育關鍵時期則主要是雙核期。植物花藥敗育在花粉母細胞時期、減數分裂期、單-雙核期等均有發生[12]，葉紈芝等[25]對白菜細胞核雄性不育系進行了花藥細胞學觀察，結果表明，不育系敗育在減數分裂期，無法形成四分體。盛云燕等[26]利用電鏡觀察了甜瓜核雄性不育材料的花蕾發育結構，發現花藥敗育發生在四分體期至單核期。張建奎等[27]研究發現，小麥核雄性不育敗育發生在小孢子單核期，敗育類型為圓敗型。而在筆者的研究中，西瓜雄性不育系GMS4的花藥敗育發生在小孢子母細胞減數分裂期，不育株的花藥不能形成二分體、四分體，這可能與所研究的作物種類不同有關。

諸多報道表明，小孢子敗育與絨氈層的異常發育有關。絨氈層細胞位于花藥壁內側與小孢子母細胞接觸，花藥發育初期為小孢子提供所需的營養元素，四分體時期分泌特異性胼胝質酶，將包裹小孢子的胼胝體壁降解，花藥發育后期提供孢粉素和脂類等[28]。研究表明，絨氈層發生任何異常如絨氈層細胞液泡化、提前退化或降解等都可能引起雄性不育。唐鑫等[13]對油菜溫敏細胞核雄性不育系160S花藥進行細胞學研究，發現不育花藥絨氈層形態異常，細胞空泡化并提前解體。雷剛等[12]研究辣椒細胞質雄性不育系B351A小孢子敗育細胞學機制，表明敗育花藥絨氈層細胞高度液泡化，擠壓藥室產生畸形的花粉母細胞導致敗育。與雷剛等[12]、唐鑫等[13]的細胞學觀察結果不同，這可能與研究的不育類型不同有關。許明等[29]對大白菜核雄性不育兩用系的研究發現，不育株花藥進入減數分裂期后，四分體形成異常，在藥室中央聚成團，絨氈層細胞異常呈液泡化，膨大后擠壓藥室，小孢子得不到充足營養而無法形成花粉粒。王永琦等[30]對西瓜細胞核雄性不育兩用系Se18的研究同樣表明，異常絨氈層細胞過度增殖，無法分泌胼胝質酶，被胼胝質包裹的小孢子只進行了細胞核分裂，細胞質未分裂，四分體無法形成，小孢子母細胞減數分裂異常導致雄性不育發生。許明等[29]和王永琦等[30]的報道與本研究結果一致。在筆者的研究中，不育花藥絨氈層細胞在小孢子母細胞減數分裂期發生異常，絨氈層細胞數量多、體積小且層數多，花粉囊受擠壓，無法形成二分體和四分體，異常的絨氈層細胞無法給小孢子正常發育提供營養而導致敗育。

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