番木瓜環斑病毒甜瓜分離物的基因組及其侵染性克隆

摘" " 要：番木瓜環斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是瓜類作物主要病毒之一，分析了甜瓜分離物HaNHK10的基因組序列和分子變異，構建了具有侵染性的全長cDNA克隆。結果顯示，HaNHK10分離物基因組全長為10 332 nt，與其他分離物的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為74.60%～97.80%和85.30%～98.50%。基于全基因組序列的系統進化分析顯示，HaNHK10與來自中國的所有分離物均聚集于II組中，并與中國山東的西葫蘆分離物PRSV-SD親緣關系最近。接種試驗顯示，HaNHK10分離物的全長cDNA克隆具有侵染性，它能系統侵染甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜6種作物，經接種產生的病毒后代也能夠通過摩擦接種侵染植株。

關鍵詞：番木瓜環斑病毒；甜瓜分離物；基因組；侵染性克隆

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2024）02-008-07

The genome and infectious clone of papaya ringspot virus melon isolate

LIU Liming1， PENG Bin1， KANG Baoshan1，2， WU Huijie1， LIU Xi1， GU Qinsheng1

（1. Henan Key Laboratory of Fruit and Cucurbit Biology/Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou 450009， Henan， China; 2. Zhongyuan Research Center， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Xinxiang 453500， Henan， China）

Abstract： Papaya ringspot virus （PRSV） is one of the most important viruses in cucurbits crops. In this study， the genome sequence of melon isolate HaNHK10 was cloned and analyzed， and its full-length cDNA infectious clone was constructed. The results showed that the genome of isolate HaNHK10 was 10 332 nt in length， and the identities of the genome nucleotide sequence and amino acid sequence between HaNHK10 and other isolates were 74.60%-97.80% and 85.30%-98.50%， respectively. Phylogenetic analysis based on genome sequences showed that HaNHK10 and all the isolates from China were clustered in group Ⅱ， and zucchini isolate PRSV-SD from Shandong province was most closely related to HaNHK10. The inoculation showed that the infectious clone was successfully constructed， and it could systematically infect melon， cucumber， watermelon， pumpkin， zucchini and bottle gourd. The progeny produced from the clone was infectious by mechanical inoculation.

Key words： Papaya ringspot virus; Melon isolate; Genome; Infectious clone

番木瓜環斑病毒（papaya ringspot virus，PRSV）是一種單鏈正義RNA病毒，屬于馬鈴薯Y病毒屬（Potyvirus），病毒粒子呈彎曲線狀，長度為700～900 nm，直徑約為12.5 nm，在自然條件下，主要通過蚜蟲以非持久性方式進行傳播，也可通過農事操作進行傳播。根據寄主范圍不同，PRSV可分為番木瓜（papaya，P）株系和西瓜（watermelon，W）株系，其中，P株系侵染番木瓜和葫蘆科作物，W株系侵染葫蘆科作物，不能侵染番木瓜。PRSV侵染番木瓜后引起葉片花葉、畸形，莖稈和果實表面出現環斑，嚴重時葉片脫落、植株死亡；感染葫蘆科作物后會引起葉片花葉、卷曲和畸形，植株矮化，果實畸形，嚴重影響作物的產量和果實的商品性。PRSV自20世紀40年代末在美國首次報道以來，目前在法國、巴西、哥倫比亞、厄瓜多爾、墨西哥、中國、澳大利亞、東帝汶、韓國、泰國、越南和印度等國均有發生[1-9]。在我國，自1964年PRSV在華南地區開始流行成災后[10]，目前已在海南、臺灣、廣東、廣西、福建、山東、河南、云南、四川等地發生[11-16]，給番木瓜和葫蘆科作物的生產造成嚴重損失。

目前，國內外已報道了許多不同地理來源的PRSV分離物，并獲得了許多分離物的全基因組序列信息[1，5，7，9，17-21]，通過分析發現PRSV不同分離株與其地理來源有顯著的相關性[13，15，20-22]，但與其株系劃分并不顯著相關。通過分析NCBI數據庫公布的PRSV全基因組序列信息，發現澳大利亞、巴西和東帝汶等國報道的均為W株系，分離物數量分別為13、3、4個，墨西哥和孟加拉國報道的均有2個分離物，且均為P株系，而我國報道的21個分離物中僅有4個為W株系，若要進一步分析不同株系間的進化關系，仍需更多的全基因組序列數據支撐[21]。對于我國報道的4個W株系，從寄主來源上來看，它們分別分離自南瓜、西葫蘆和絲瓜，目前尚無甜瓜分離物及其全基因組序列信息。為了深入研究病毒與寄主之間的相互關系，獲得病毒侵染性克隆至關重要。在PRSV侵染性克隆構建方面，目前已有成功構建PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分離物以及PRSV-W株系SD和CI分離物的侵染性克隆的報道[23-27]。從寄主來源看，PRSV-P株系均分離自番木瓜，PRSV-W株系SD分離物分離自西葫蘆，W-CI分離自絲瓜，目前尚無PRSV-W甜瓜分離物侵染性克隆構建的相關報道。

筆者在2017年的葫蘆科作物病毒病調查時從海南省海口市采集到一株PRSV-W甜瓜分離物，將其命名為HaNHK10[28]。以此為基礎，筆者通過RT-PCR擴增獲得該分離物的全基因組序列，并對其進行序列比對和系統進化分析，同時利用同源重組策略構建該分離物的全長cDNA克隆，通過接種試驗分析其在不同瓜類作物上的侵染性，為在瓜類作物上開展該病毒的進化機制和分子致病性研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2021年4—9月在中國農業科學院鄭州果樹研究所進行，PRSV-W分離物HaNHK10采集于海南省海口市露地甜瓜發病植株。植物表達載體pXT1由南京農業大學陶小榮教授饋贈。

1.2 載體構建

取約0.1 g甜瓜發病葉片進行總RNA的提取和cDNA的合成，具體操作參照RNAsimple總RNA提取試劑盒和PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒說明書。從GenBank數據庫中下載PRSV的全基因組序列，通過比對分析序列的保守性，設計3對引物P-1F/P-1R、P-2F/P-2R、P-3F/ P-3R（表1），以合成的cDNA為模板，將分離物HaNHK10的全基因組分成3段進行擴增，利用NEBuilder高保真DNA組裝預混液將獲得的3個PCR產物與經Stu I和Sma I雙酶切處理的植物表達載體pXT1進行同源重組、轉化、篩選和測序驗證，獲得含有HaNHK10全基因組的cDNA克隆pPRSV-HaNHK10。

1.3 序列分析

對pPRSV-HaNHK10進行測序分析和拼接，獲得HaNHK10分離物的全基因組序列。從GenBank數據庫中下載76條來自不同國家的PRSV分離物的全基因組序列，利用ClustalW軟件將它們與HaNHK10分離物進行序列比對，用BioEdit軟件進行全基因組核苷酸和氨基酸序列一致性分析[29]。以西瓜花葉病毒（watermelon mosaic virus，WMV，AY437609）為外組，基于PRSV不同分離物的全基因組核苷酸序列，利用Mega X軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）進行系統進化分析[30]，重復1000次。

1.4 接種試驗和病毒檢測

接種試驗于2021年6—8月在中國農業科學院鄭州果樹研究所西瓜甜瓜病蟲害防控課題組溫室進行。其中，甜瓜品種為白玫，由新疆農業科學院哈密瓜研究中心提供；黃瓜品種為津研4號，購自天津科潤農業科技股份有限公司；西瓜品種為紅和平，購自浙江浙農種業有限公司；南瓜品種為早栗蜜本，購自河北茂華種業有限公司；西葫蘆品種為歐諾，購自太谷縣雨潤谷禾種業有限公司；瓠瓜品種為甬砧1號，由寧波農業科學院提供；當植株培養至子葉完全展開時開始試驗。將pPRSV-HaNHK10轉入農桿菌菌株GV3101中，然后利用農桿菌介導的方式接種甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜植株，以接種誘導緩沖液為陰性對照（CK），具體方法參照劉莉銘等[31]的報道。待甜瓜發病后，采集發病葉片用1×PBS緩沖液按照葉片與緩沖液1∶10的質量/體積比進行研磨，通過摩擦方式接種甜瓜和西瓜健康植株。將接種后的植株置于25～28 ℃條件下進行培養，觀察植株發病情況。在每次試驗中每種作物分別接種6株，并設置3次重復。待發病后，采集接種植株的系統發病葉片，提取葉片總RNA，利用HiScript? II One Step RT-PCR Kit （Dye Plus）以P-5480F/ P-6980R為引物（目的片段長度約為1500 bp）對病毒的侵染情況進行檢測，同時以P-9673F/P-T7-10045R為引物，對HaNHK10基因組9 673～10 045 nt區域進行擴增，PCR產物經體外轉錄獲得地高辛標記的RNA探針，以利用dot blot方法進一步檢測植株葉片中PRSV的侵染情況。

2 結果與分析

2.1 PRSV分離物HaNHK10基因組結構分析

PRSV分離物HaNHK10基因組全長為10 332 nt，GenBank登錄號為OK465456，包含5′UTR（1～85 nt）和3′UTR（10 127～10 332 nt），編碼1個由3346個氨基酸組成的多聚蛋白（86～10 126 nt），經蛋白酶切割形成11個成熟的蛋白質，包括P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb、CP以及P3編碼區內部通過+2移碼產生的PIPO，具體的基因組結構如圖1所示。

2.2 PRSV分離物HaNHK10序列分析

序列一致性分析結果顯示，分離物HaNHK10與其他PRSV分離物之間的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為74.60%～97.80%、85.30%～98.50%。在這些分離物中，HaNHK10與中國山東的西葫蘆分離物PRSV-SD（MF085000）一致性最高，核苷酸和氨基酸序列一致性分別達到97.80%、98.50%，與孟加拉國的番木瓜分離物（MH444652）一致性最低，核苷酸和氨基酸序列一致性分別僅為74.60%、85.30%。

基于PRSV全基因組核苷酸序列的系統進化分析結果顯示（圖2），供試的77個PRSV分離物可以分為2組，其中，來自巴西、哥倫比亞、厄瓜多爾、法國和墨西哥的所有分離物均聚集于Ⅰ組，來自中國、東帝汶、韓國、泰國和越南的所有分離物均聚集于Ⅱ組，來自澳大利亞的13個分離物中有12個聚集于Ⅰ組，來自印度的13個分離物中有12個聚集于Ⅰ組，說明PRSV分離物與其地理來源有顯著的相關性。另外，在Ⅰ組和Ⅱ組中，分離自番木瓜的分離物分別聚集在一起，分離自葫蘆科作物的分離物分別聚集在一起，說明PRSV分離物與其寄主來源也有顯著的相關性。其中，筆者獲得的分離物HaNHK10與來自中國山東的西葫蘆分離物PRSV-SD（MF085000）親緣關系最近，它們均聚于Ⅱ組中。

2.3 分離物HaNHK10全長cDNA克隆的侵染性

將HaNHK10分離物的cDNA克隆pPRSV-HaNHK10采用農桿菌介導的方法分別接種甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜植株。在接種后7 d左右，甜瓜葉片葉脈開始褪綠、產生脈帶，10 d左右所有接種植株葉脈褪綠均較為明顯，此時黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜接種植株開始產生皺縮或花葉癥狀，14 d時所有接種植株均出現明顯癥狀（圖3-A）。RT-PCR和dot blot檢測結果進一步證實了發病植株均被PRSV所侵染（圖3-B～C）。通過摩擦接種方式將甜瓜發病葉片進一步接種甜瓜和西瓜植株，發現在接種后1～2周內所有接種植株均可發病，經PCR進一步證實了PRSV的侵染。以上結果說明，PRSV分離物HaNHK10的侵染性克隆構建成功，該克隆在6種供試瓜類作物上均可系統侵染，并產生相應的癥狀。

3 討論與結論

目前NCBI數據庫中已公布76個PRSV分離物的全基因組序列信息，筆者以從海南海口采集到的PRSV甜瓜分離物HaNHK10為研究對象，對其全基因組序列進行擴增和拼接，隨后基于全基因組核苷酸序列對以上77個PRSV分離物進行了系統進化分析，結果顯示同一國家的分離物大多聚集在一起，說明PRSV不同分離物與其地理來源有顯著的相關性，這與已有報道[13，15，20-22]結果一致。另外，PRSV分離物在系統進化樹中可分為2組，雖然P和W株系所對應的分離物分別分布在這2組中，但在各分組內2種株系之間有所分化，且同一地理來源的相同株系所對應的分離物分別聚集在一起，親緣關系更近，說明在同一地理區域內PRSV分離物與其株系分化有一定的相關性。由于PRSV-W株系中來自不同葫蘆科作物的分離物較少，無法進一步判斷PRSV-W分化與其寄主來源之間的關系。

病毒侵染性克隆的獲得對開展和推進病毒與寄主互作研究至關重要。對PRSV來說，目前已有PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分離物以及PRSV-W株系SD和CI分離物侵染性克隆成功構建的報道[23-27]。筆者利用同源重組策略構建了PRSV-W株系HaNHK10分離物的侵染性克隆，通過接種試驗證實了該克隆在甜瓜、黃瓜、西瓜、南瓜、西葫蘆和瓠瓜中的高侵染性（侵染率可達100%）。與已報道的PRSV侵染性克隆相比，構建策略、接種對象及侵染率有所不同，如HN-1分離物侵染性克隆利用Gibson組裝方法構建而成，通過接種番木瓜和南瓜，發現其在接種后30 d時侵染率分別為66.7%和60%[24]，利用酵母同源重組系統構建的HN-2分離物侵染性克隆在番木瓜中的侵染率僅為8.33%[25]，而利用Gibson組裝構建的HN-2分離物侵染性克隆在番木瓜中的侵染率可達96%[26]，對PRSV-W株系SD分離物來說，它的侵染性克隆是通過同源重組策略構建而成的，與本試驗相比，構建策略相同，且均可系統侵染甜瓜、黃瓜、西瓜和西葫蘆4種作物，但它未用于南瓜和瓠瓜接種檢測，接種寄主較少[27]。在寄主來源方面，HN-1、HN-2和YK分離物均分離自番木瓜，CI分離自絲瓜，SD分離自西葫蘆，而HaNHK10分離自甜瓜。已有研究證實NIa-Pro的Lys27決定了PRSV侵染番木瓜的寄主特異性[23]。通過分析以上6種分離物的序列，發現PRSV-P株系HN-1、HN-2和YK分離物NIa-Pro的aa27均為Lys，而PRSV-W株系SD、CI和HaNHK10分離物NIa-Pro的aa27均為Asp，說明各分離物NIa-Pro的aa27類型與其株系劃分屬性一致，株系劃分結果較為可信。但對于分離自番木瓜的BD-2、PM-H、PM-I、PS3-I和Meghalaya分離物來說，該位點分別為Ser、Arg、Arg、Arg、Glu，而對于分離自葫蘆科作物的E2和16R分離物來說，該位點分別為Glu和Asn，與已有報道有所不同，說明目前尚不能僅依賴于該位點的氨基酸類型對所有PRSV分離物進行明確的株系劃分。該位點對PRSV的致病性和寄主范圍的具體影響及其作用機制仍需深入探討，PRSV侵染性克隆的獲得為開展該方面的研究提供了有力工具。

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