羔羊源鏈球菌分離鑒定與耐藥性試驗

摘要：為了鑒定引起山東省東明縣規(guī)?；B(yǎng)殖場中羔羊死亡的病原菌，本試驗2023年3月采集東省東明縣規(guī)?；B(yǎng)殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟、腎臟等病料組織，采用細菌培養(yǎng)、形態(tài)學(xué)觀察、生化試驗、PCR方法進行鏈球菌分離鑒定，對分離的病菌采用人工感染小鼠試驗和K-B藥敏紙片法分別檢測鏈球菌分離菌株的致病性和耐藥性。結(jié)果顯示：從山東省東明縣規(guī)模化養(yǎng)殖場中死亡羔羊的病料組織中分離得到1株鏈球菌，命名為 DMS1株，分離的DMS1株對小鼠具有較強的致病力，致死率為100%（5/5）； DMS1株對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星環(huán)丙沙星4種藥物高度敏感，對氨芐西林、多西環(huán)素、林可霉素中度敏感，對青霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考4種藥物耐藥。本研究為該地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場中羔羊鏈球菌病綜合防控及指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

關(guān)鍵詞：羔羊；鏈球菌；分離鑒定；致病性；耐藥性試驗

鏈球菌（streptococcus suis，SS）為革蘭氏陽性球菌，該菌廣泛存在于自然界及養(yǎng)殖環(huán)境中，可以感染豬、牛、羊、鹿、雞、鴨、鵝等多種家畜和家禽及人，該菌引起多種動物和人的敗血癥、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、乳腺炎、腹瀉、化膿及毒素引起的休克等一系列的疾病，同時可以引起人的發(fā)病，嚴重危害著動物和人的健康，是臨床中常見的人畜共患的病原菌之一[1-3]。羊的鏈球菌病是溶血性鏈球菌引起的山羊、綿羊一種急性熱性傳染病，多發(fā)于冬春寒冷季節(jié)（每年11月至次年4月），主要通過消化道、呼吸道等多種途徑感染，臨床中以出血性敗血癥、漿液纖維素性胸膜肺炎、化膿性肺炎為主要癥狀，該病可以感染不同階段的羊，其中對羔羊具有發(fā)病率迅速、致死率比較高、傳染性比較強的特點，嚴重威脅養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展[4-8]。

近年來，關(guān)于羔羊鏈球菌病的報道越來越多，鏈球菌可以感染不同階段的山羊和綿羊，其中對羔羊最易感，尤其10～30日齡羔羊易感，當羔羊感染鏈球菌后，主要表現(xiàn)為咳嗽、流漿液性鼻液、呼吸困難、肺炎，嚴重者可以出現(xiàn)敗血癥，個別出現(xiàn)急性死亡，其死亡率高達60%以上，給養(yǎng)羊業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失[9-10]。國內(nèi)外相關(guān)研究表明，隨著臨床中抗菌藥物的不合理使用，鏈球菌的耐藥性呈現(xiàn)逐年增高的趨勢，耐藥性鏈球菌菌株不斷地出現(xiàn)，給臨床用藥造成一定困難，鏈球菌的耐藥性在養(yǎng)殖場中普遍存在，由于鏈球菌為人畜共患的病原菌，其鏈球菌的耐藥性可以在動物和人之間相互傳播，已成為公共衛(wèi)生安全問題[11]。本試驗采集山東省東明縣規(guī)?；B(yǎng)殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病料組織，采用不同的方法進行鏈球菌分離鑒定，并檢測其致病性和耐藥性，以期為該地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場中羔羊鏈球菌病綜合防控及指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1病料來源

2023年3月采集山東省東明縣規(guī)?；B(yǎng)殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟、腎臟等病料組織，將采集的樣品進行無菌處理進行鏈球菌的分離鑒定。

1.2細菌分離與培養(yǎng)

將采集的規(guī)?；B(yǎng)殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病料組織樣品進行處理后，在無菌的條件下接種于7%綿羊脫纖血液培養(yǎng)基，在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)12～18 h后，挑取單個菌落接種于鏈球菌培養(yǎng)基進行鑒別培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12～18 h，進行革蘭氏染色鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

1.3 生化試驗鑒定

將從死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病料組織樣品中分離得到的菌株，無菌的條件下，接種在營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期，調(diào)整菌液濃度為2個麥氏濁度，參照Ｒaid ID 32 STREP陽性菌鑒定試劑盒說明書，將2個麥氏濁度菌液，在無菌的條件接種于Ｒaid ID 32 STREP陽性菌鑒定紙質(zhì)條中，在37 ℃恒溫條件下培養(yǎng)12～18 h后生化特性鑒定。

1.4 細菌PCR鑒定

按照參考文獻[7]的方法設(shè)計細菌16SrRNA 基因通用引物（表1），送生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物。 采用水煮沸提取分離菌株的基因組DNA，以提取的分離菌株的基因組DNA為模板進行PCR鑒定，將分離菌株的PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳檢驗?zāi)康臈l帶。

1.5致病性試驗

按照參考文獻[8]報道的方法，將分離菌株DMS1株接種于營養(yǎng)肉湯中培養(yǎng)至對數(shù)期調(diào)整菌液濃度為106～7 cfu/mL，將10只小鼠分為2組，攻毒組5只，將DMS1株通過腹腔注射攻毒5只昆明系小鼠，攻毒的劑量為0.25 mL（106～7 cfu/mL），對照組5只小鼠給予等量的無菌生理鹽水。試驗期為7 d并觀察小鼠發(fā)病情況。

1.6藥敏試驗

分離菌株的藥敏試驗參照美國臨床實驗室標準化協(xié)會（CLSI）2013年推薦的藥敏試驗法標準進行操作與結(jié)果判定。

2結(jié)果

2.1細菌分離培養(yǎng)

在死亡羔羊的肺臟、心血、肝臟等病理組織分離的疑似鏈球菌的菌株，通過在7%綿羊脫纖血液培養(yǎng)基、鑒別鏈球菌（GBS）培養(yǎng)基的培養(yǎng)特性及鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)結(jié)果，與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的鏈球菌的培養(yǎng)特性及鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)基本一致。其分離菌株形態(tài)學(xué)結(jié)果見圖1。

2.2細菌生化試驗

分離菌株DMS1株通過Raid ID 32 STREP陽性菌鑒定試劑盒進行生化鑒定，結(jié)果顯示分離菌株DMS1株的生化特性與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的鏈球菌的生化特性一致，初步鑒定為鏈球菌。

2.3 細菌PCR鑒定

對初步鑒定為鏈球菌用PCR進行進一步鑒定。結(jié)果顯示，DMS1株均擴增出大約為1 500 bp的目條帶（圖2）。通過測序?qū)Ρ确蛛x菌株與參考株（鏈球菌）的同源性在97.7%～98.9%之間，說明分離的DMS1株為鏈球菌。

2.4 致病性試驗

攻毒組小鼠在攻毒后2～3 d出現(xiàn)了精神沉郁、采食量減少、抽搐等不同的發(fā)病情況，個別攻毒的小鼠出現(xiàn)急性死亡，剖檢死亡的小白鼠后采集病料組織，分離得到鏈球菌，攻毒試驗結(jié)束對照組小鼠健康存活，攻毒組的小鼠死亡率為100%（5/5）。

2.5 藥敏試驗

分離菌株的耐性分析顯示：DMS1株對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星4種藥物高度敏感，對氨芐西林、多西環(huán)素、林可霉素中度敏感，對青霉素、阿莫西林、磺胺間甲氧嘧啶、氟苯尼考4種藥物耐藥。

3 討論

相關(guān)研究表明，鏈球菌可以感染多種動物和人，是臨床中常見的人畜共患的條件性致病菌，可以通過多種途徑在不同動物與人之間傳播[12]。鏈球菌可以引起羊的急性病例，具有發(fā)病比較急、死亡率較迅速等特點，為臨床中畜禽常見的急性、敗血性的一類疾病[13]。近年來，關(guān)于羊鏈球菌病的報道越來越多，尤其對羔羊的危害較大。本試驗從山東省東明縣規(guī)?；B(yǎng)殖場中疑似鏈球菌感染死亡羔羊的病料組織中分離得1株鏈球菌，命名為DMS1株，致病性試驗結(jié)果表明，DMS1株對小鼠致死率為100%，說明DMS1株是引起羔羊死亡的主要的病原菌。臨床中羊鏈球菌病主要通過抗菌藥物進行防治[14]。通過藥敏試驗顯示，DMS1株對頭孢噻呋、頭孢喹肟、恩諾沙星、環(huán)丙沙星4種藥物高度敏感，對其他的藥物產(chǎn)生不同的耐藥性。因此，在臨床中治療該病應(yīng)該進行藥敏試驗，選擇敏感的藥物進行交替使用，同時應(yīng)該配合環(huán)境的消毒，提高治療效果，同時注意環(huán)境的衛(wèi)生，加強飼養(yǎng)管理，提高羔羊的免疫力。

參考文獻：

[1] 田國欽. 豬鏈球菌分離調(diào)查及其混合感染對小鼠的致病性研究[D].吉林大學(xué)，2022.

[2] 李飛，張儒博，徐雷，等.豬鏈球菌2型感染仔豬致腦炎模型的建立[J].微生物學(xué)通報，2019，46（11）：3070-3075.

[3] 袁敏明.羊鏈球菌的鑒定與藥敏試驗[J].農(nóng)家參謀，2022（18）：90-92.

[4] 王明瓊，李超，劉學(xué)通，等.羊鏈球菌致病機制研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2021，42（10）：71-75.

[5] 張總超，闞威，林元清，等.巖羊多動物鏈球菌分離鑒定及藥酶試驗研究[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2021（4）：49-53.

[6] 張丹. 新疆北屯墾區(qū)羊細菌性傳染病流行病學(xué)調(diào)查[D].石河子大學(xué)，2019.

[7] 段龍川，胡浩，吳波，等.羊源鏈球菌的分離鑒定及防治[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2018（17）：116-119+238.

[8] 朱相儒，吳白，易成功，等.羊?qū)冁溓蚓姆蛛x鑒定及其致病性的初步研究[J].中國獸醫(yī)科學(xué)， 2016， 46（01）： 26-30.

[9] 付明哲，李長安，白濤，等.羊鏈球菌的自動鑒定和耐藥性分析[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，23（1）：36-40.

[10] 王明道，楊素新.羊鏈球菌的分離鑒定[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31（1）：149-150.

[11] 王雙山，歐陽素貞，劉書梅，等.羊鏈球菌的分離鑒定及藥敏試驗[J].中國獸醫(yī)雜志，2007（9）：43-44.

[12] 黨如意，白新棟，郭曉凡，等.一例羔羊鏈球菌性肺炎病例的實驗室診斷[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)， 2023，. 666（6）：93-96+143.

[13] 徐鋒，齊新永，王曉旭，等.湖羊感染綿羊鏈球菌病例的診斷[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2023，44（3）：140-144.

[14] 張寶泉.羊鏈球菌病病原分離鑒定及藥敏試驗[J].飼料博覽，2022， 360（4）：58-60+65.