布魯氏菌病的診斷技術進展

摘要：隨著分子生物學、納米、化學發光免疫診斷等新技術的迅速發展，布魯氏菌病的實驗室檢測技術也有了更多種選擇，他們具有靈敏、特異、快速、直接定量、可自動化等多種優勢，正逐步被廣泛使用，有些已經占據了布病實驗室診斷的重要位置，但傳統的診斷技術也不可就此丟棄，它是現代檢測技術的前提和基礎，依然在生產實踐的一線起著不可替代的重要作用。

關鍵詞：布魯氏菌病；檢測；技術進展

1 布魯氏菌病傳統的診斷技術

家畜布魯氏菌病傳統的診斷技術包括流行病學、臨床癥狀、病理變化、病原的分離鑒定以及實驗室里的虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗、全乳環狀試驗、瓊脂擴散實驗、補體結合試驗、ELISA等血清學檢測技術以及適合現場操作的變態反應等。

1.1 流行病學特點

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的人和多種動物共患的變態反應性傳染病，幾乎所有陸生動物和海洋里的哺乳動物都易感，陸生家畜中羊、牛、豬最易感，接觸性傳播，無明顯的季節性。布魯氏菌細胞內寄生，典型癥狀過后，細菌寄生胞內，藥物很難對它起到作用，至今尚無根治辦法，主要侵害生殖系統，母畜比公畜易感，成年畜比幼年畜易感。

1.2 臨床癥狀

多數動物隱性感染、排毒卻無明顯癥狀；典型癥狀主要表現為發熱、流產、關節炎、乳房炎、睪丸炎等相關癥狀。

1.3 病理變化

子宮、胎盤炎性浸潤、化膿性壞死、睪丸炎、關節內膜炎，多器官特征性肉芽腫、胎兒敗血癥等病變。

1.4 病原分離鑒定

1）取典型病變組織。取典型病變組織抹片，柯氏染色后鏡檢，發現紅色球桿狀小桿菌，其他菌為藍色時可做出初步判斷。

2）實驗室準備。實驗室人員在做好個人防護的前提下，取典型未污染病料，在馬丁瓊脂（含10%馬血清）、肝浸液瓊脂等培養基上分離培養，通過其特異性單向血清A、M凝集試驗、生化試驗、分離物的特點、菌體粗糙程度等綜合判斷。

1.5 血清學試驗

1）虎紅凝集試驗（RBT）。虎紅平板凝集是目前在生產一線運用最廣的一種試驗，具有操作簡便、材料簡單、成本低、反應快、可定性也可定量等優點。其原理是將布氏桿菌抗原滅活后，用虎紅染色，當遇到被檢血清中特異性抗體后發生凝集，形成肉眼可見的凝集顆粒。適合大面積初篩。但虎紅抗原主要與IgM發生凝集，對疾病后期產生的IgG檢出率低，另外，受到觀察者主觀判斷的差異、抗原質量差異、環境溫度等因素影響，容易出現漏檢和假陽性結果[1]。

2）試管凝集試驗（SAT）。其原理與虎紅凝集試驗相似，常用于虎紅凝集試驗的復檢，操作相對復雜，結果判斷受實驗環境光線等多種因素影響，同樣有一定的主觀性和差異性，對IgM的敏感性高于IgG，適合于布病的早期診斷。

3）全乳環狀試驗（MRT）。用于檢測乳汁中布病抗體，陽性乳汁會在抗原和乳汁的界面上形成白色沉淀環。操作簡單、靈敏度高，但對乳汁檢樣要求苛刻，也有非特異性結果，適用于布病的初篩。

4）補體結合試驗（CFT）。補體結合試驗是布病檢測的“金標準”，目前收錄在國標中。主要用于檢測布病感染后機體中后期產生的IgG，由于補體抗體產生的晚，在體內保持時間長，對于慢性病例診斷意義較大。但此方法試驗條件比較苛刻，所用試劑種類多、操作復雜、對試驗操作者的要求較高、結果判斷也有主觀性。此方法也不適于豬的診斷。

5）瓊擴試驗。此方法主要針對綿羊種布魯氏菌的檢測，用全乳環狀抗原檢測乳汁中的布病抗體，陽性乳與標準抗原兩孔間會形成肉眼可見的沉淀線。此方法操作簡單，適合大批量檢測，但需24～72 h判結果。

6）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）。這種方法是將抗原或抗體吸附于聚苯乙烯反應板表面，再與被檢樣本中的抗體或抗原相結合，形成抗原抗體復合物，再加入酶標記的抗體（或抗原），加入底物后，底物被酶催化后形成有色產物，顏色的深淺與被檢物中抗原（或抗體）含量正相關，通過酶標儀檢測吸光度的值來計算被檢物的含量。這種方法具有敏感度高、操作簡單、易于自動化操作，適合大批量檢測，主要檢測IgG，效果與補體結合試驗相當，但也存在假陽性或假陰性的現象。布病的檢測常用I-ELISA和C-ELISA，此方法已納入布病檢測的國家標準[2]。

7）變態反應。用布魯氏菌水解素注射于被檢動物尾根皺褶處的皮內，在24 和48 h各觀察一次有無紅腫現象來判斷陰陽性的一種診斷方法，這種方法操作簡單，但等待結果時間較長，需要多次保定被檢動物，對于慢性病例檢出率較高。傳統的血清學方法有一個共同的缺點就是無法區別疫苗和野毒。

2 布魯氏菌病檢測的新技術

隨著分子生物學、納米和基因缺失技術的快速發展，近年來，對于布病的檢測又有了一些新的方法，比如PCR技術、熒光偏振技術、化學發光技術等。

2.1 聚合酶鏈式反應（PCR）

PCR并不屬于新技術，但它在不斷發展和改進，日益親民化，目前在疫病檢測中逐步占據了主要位置，在實驗室診斷中被廣泛應用。他的基本原理是將檢材中特定的微量的DNA片段迅速呈幾何倍的擴增，利用特定的儀器設備進行檢測的技術。

PCR技術目前發展到了第三代。第一代是將核酸擴增后，采用瓊脂糖電泳的方式對PCR產物進行分析，只能用于定性分析。目前，國標布病的PCR檢測中只收錄了此種方法。第二代是采用特定的儀器采集擴增產物熒光強度的熒光定量PCR技術，目前廣泛使用。第三代是以微滴化處理步驟為主要特征的數字PCR，是一種全新的對核酸進行檢測和定量的方法。它直接計數目標分子，可確定低至單拷貝的待檢靶分子的絕對數目。

1）AMOS-PCR屬于第一代PCR，對于家畜布病的檢測，AMOS-PCR可以對所檢布氏桿菌進行分型，它是根據IS711在各菌株中的插入位置不同和拷貝不同而進行鑒別分型的，可以鑒別牛種生物型1、2、4，羊種生物型1、2、3，豬種生物型1和綿羊附睪種。可以區分疫苗株和野毒株。

2）多重引物PCR或復合PCR是在同一PCR反應體系里加上二對以上引物，同時擴增出多個核酸片段，可以鑒別除綿羊附睪種外的牛種、羊種、豬種、沙林鼠種、犬種布魯氏菌。

3）熒光定量PCR既可鑒別布魯氏菌屬，也可進行種型鑒定，適合布病的早期快速診斷。PCR技術具有敏感性高、特異性強、操作簡便快速、對起始材料質量要求低等特點。但PCR技術也不能完全克服假陰性和假陽性的現象，造成的原因比較復雜，比如：實驗室環境的問題，如：污染、氣溶膠等；樣品本身存在問題，如：樣品質量差、保存不當等；此外，實驗操作的不規范、試劑的質量問題、數據分析中的誤差、擴增儀溫度不準確、反應液處理不好導致PCR抑制物進入反應體系等都可能導致實驗結果失真[3]。

2.2 熒光偏振試驗（FPA）

熒光偏振試驗是一種抗原/抗體相互作用的簡單技術，該試驗基于物理原理：在溶液中，在布魯氏菌屬的抗體的存在下，和抗原形成了大的熒光復合物。在陰性樣品中，抗原是未結合的狀態，與布魯氏菌屬陽性樣本相比，這些較小的抗原分子旋轉得更快，因此引起光的更大去極化。這種方法操作快速（幾分鐘出結果）、簡便，在實驗室和野外都可操作，相比凝集試驗SAT，其結果更客觀，特異性和敏感性與ELISA相似，但需要專業的熒光偏振儀器，成本較高，適合大規模布魯氏菌病的篩查和檢測，未來值得推廣。

2.3 bp26-iELISA

這是一種將基因缺失技術與傳統間接酶聯免疫吸附試驗相結合的方法。bp26蛋白具有良好的抗原性，其基因在布魯氏菌7個種21個生物型中幾乎完全一樣，是比較保守的序列，將純化的bp26蛋白包被ELISA板，建立檢測布魯氏菌病的間接ELISA方法，它比SAT方法更敏感。這種方法為以后M5-90疫苗株bp26基因缺失苗的應用提供配套性血清學檢測奠定基礎，可區分基因缺失苗和野毒感染。

2.4 化學發光分析技術

化學發光免疫分析技術是將免疫反應和化學發光分析相結合，化學發光分析系統是利用化學發光物質經催化劑的催化和氧化劑的氧化，形成一個激發態的中間體，當他回到穩定的基態時，同時發射出光子（hM），免疫反應系統是將發光物質直接標記在抗原或抗體上，或酶作用于發光底物，利用發光信號測量儀測量光子強度。

盡管目前還沒有看到針對布魯氏菌病的化學發光免疫分析技術的報道，但此項技術已經運用于多種疾病的檢測，隨著科研工作者的不懈努力，這項技術很快就會運用到布魯氏菌病的檢測上來，尤其是微粒體發光免疫分析技術更具有推廣應用前景，它將納米級的磁微粒作為反應載體，可實現多項目同步檢測、全自動運行、結果定量、靈敏度高等特點，是一種劃時代的獸醫免疫學診斷技術。

3 結語

診斷一種疾病不僅要考慮實驗室結果，還要綜合考慮臨床癥狀、流行病學、病理變化等綜合因素。近年來隨著科學技術的飛速發展，布病的檢測技術更新得也很快。但不論是哪一種技術都有其優缺點，它的應用要綜合考慮實際條件的限制。從技術角度來看，血清學診斷方法比較經濟和相對簡單，更適合進行大規模的篩查和診斷，特別是在流行地區。

參考文獻：

[1] 楊海榮，關平原，范偉興.AMOSPCR在布魯氏菌種型鑒定中應用的研究[J].中國動物檢疫，2007，24（10）：25-28.

[2] 田克恭，李明.動物疫病診斷技術-理論與應用[M].中國農業出版社，209-218.

[3] 加洛子哈.動物布魯氏菌病的診斷技術及防治措施[J].山東畜牧獸醫，2017，38（3）：29+33.