制草烏肝毒性效應的代謝通路分析

摘要：目的基于代謝組學技術檢測制草烏對大鼠肝功能指標及肝組織病理影響從而探究代謝通路分析。方法以制草烏為示例藥物，以大鼠為研究對象，將大鼠按體重隨機分成4組。根據預試驗結果設定正常組、制草烏高劑量組、中劑量組、低劑量組。除正常組外，其余各給藥組灌胃相應的藥物溶液，1次/d，連續灌胃28 d，末次給藥后收集血清樣本，檢測各組的血清生化指標及采用LC-MS非靶向代謝組學技術對血清內源性代謝產物變化進行分析。結果血清生化指標結果顯示，與正常組比較，制草烏高劑量組ALT含量顯著升高，有統計學意義（Plt;0.05）；制草烏中和低劑量組指標差異無統計學意義（Pgt;0.05）；肝組織病理檢測顯示，正常組肝小葉結構清晰，肝細胞索和肝血竇大致呈放射狀排列，肝細胞圓潤、飽滿，肝板排列規則、整齊。制草烏高劑量組肝細胞廣泛水腫、空泡化、喪失結構完整性；制草烏中和低劑量組未見明顯異常；從血清中共篩選出34個內源性差異代謝物，其中上調15個、下調19個，多數涉及煙酸和多種氨基酸代謝。結論明確制草烏具有一定的肝毒性；肝毒性機制主要與煙酰胺（NA）和1-甲基煙酰胺（MNA）代謝有關。

關鍵詞：制草烏；肝臟毒性；血清；代謝通路；機制分析

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2024）03-0084-06

Analysis of Metabolic Pathway of Hepatotoxicity Effect of Prepared Aconiti

JIANG Yan-li1，Tu Bu-xin1，WU Ri-han2，HUYU Ligeqi1，LIU Jin-wen1，

HAN Xiao-jing1，ADU Qinfu1，BAI Mei-rong1

（1. Inner Mongolia University for Nationalities，Tongliao 028000，China;

2. Inner Mongolia Medical University，Hohhot 010010，China）

【Abstract】Objective： To explore the metabolic pathway analysis based on the metabolomics technique to detect the effects of prepared Aconiti on liver function indexes and liver histopathology in rats. Methods： The rats were randomly divided into 4 groups according to their body weight. According to the pre-test results，normal group，high dose group，medium dose group and low dose group were set up. In addition to the normal group，the other drug administration groups were given corresponding drug solution once a day for continuous gavage for 28 days. After the last administration，serum samples were collected to detect serum biochemical indexes and the changes of serum endogenous metabolites were analyzed by LC-MS non-targeted metabolomics technology. Results： The results of serum biochemical indexes showed that ALT content in high dose group was significantly increased compared with that in the normal group，with statistical significance（Plt;0.05）; There was no significant difference between the two groups（Pgt;0.05）. Liver histopathological examination showed that in the normal group，the structure of hepatic lobules was clear，hepatocyte cords and hepatic blood sinuses were roughly arranged radially，hepatocytes were round and full，and hepatic plates were arranged regularly and neatly. Hepatocyte edema，vacuolation and loss of structural integrity were widespread in the high dose group. No obvious abnormality was found in the middle and low dose groups. A total of 34 endogenous differential metabolites were screened from serum，including 15 up-regulated and 19 down-regulated，most of which involved niacin and various amino acid metabolism. Conclusion： It is clear that prepared Aconiti has certain hepatotoxicity and the mechanism of hepatotoxicity is mainly related to the metabolism of niacinamide（NA） and 1-methylnicotinamide（MNA）.

【Key words】Prepared Aconiti; Hepatotoxicity; Serum; Metabolic Pathway; Mechanism Analysis

草烏為毛茛科植物北烏頭Aconitum kusnezoffii Reichb.的干燥塊根。異名為畢哈、曼欽、哈拉、泵那格、哈日·泵阿、哈日·浩熱蘇。味辛，性溫，效輕，有大毒。功能與主治為殺黏，燥協日烏素，止痛。主治瘟疫，黏痧癥，急性刺痛，黏刺痛，黏奇哈，癰癤，丹毒，白喉，炭疽，癭瘤，黏性脖頸僵直，陶賴，赫如虎，關節疼痛及相訌熱，肺感冒，喉感冒等癥［1］。制草烏作為大毒蒙藥，不合理應用將會對肝臟有毒性影響。肝臟擔負著人體代謝、解毒、合成等重要生理功能。不僅是體內藥物代謝和排泄的重要場所，也是藥物毒性反應的易感靶器官。由藥物所致急慢性肝功能衰竭呈逐年增高，已成為嚴重制約臨床安全用藥和藥物研發的又一大荊棘。以此不合理應用含有毒味的制草烏亦有一定的肝毒性［2-3］。血清丙氨酸氨基轉移酶（ALT），天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）和堿性磷酸酶（ALP）是臨床常用的診斷指標，其參考區間主要用于幫助臨床醫生判斷就診者肝功能是否正常［4］。目前，尚未見制草烏肝毒性與內源性代謝物相關的研究報道。因此，本研究以大鼠為研究對象，以制草烏為示例藥物，探討制草烏產生肝毒性時從肝功能指標及肝組織病理影響且出現的內源性代謝產物變化規律而探究通路分析，為尋求防治制草烏肝毒性的相應靶點及為制草烏臨床指導合理應用提供有力的實驗依據。

1實驗材料

1.1動物SD雄性大鼠，SPF級，體重為200 g±20 g，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供（SCXK（遼）2021-0001）。飼養條件：室溫維持23±1℃，光照12 h，自由飲水、攝食。

1.2藥品與試劑制草烏由內蒙古民族大學附屬醫院蒙藥制劑室提供，經專家（內蒙古民族大學蒙醫藥學院藥用植物鑒定教研室包桂花教授）鑒定為正品；純化水（屈臣氏集團有限公司），谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、磷酸酶（ALP）試劑盒均購自羅氏診斷產品（上海）有限公司。

1.3儀器Eppendorf N13462C型移液器（德國Eppendorf公司）；TripleTOF5600+質譜儀MASS（AB SCIEXTM公司）；Mikro 220R型臺式高速冷凍離心機（Hettich公司）；TL-48R型粉碎研磨儀（上海萬柏生物科技有限公司）；cobas c 311羅氏全自動生化分析儀（上海羅氏診斷產品有限公司）；SB-1100型恒溫水浴鍋（上海愛郎儀器有限公司）；生物顯微鏡（Nikon公司）；Nexera UHPLC LC-30A色譜UHPLC（島津SHIMADZU公司）。

2實驗方法

2.1草烏溶液的制備取鑒定為正品的制草烏，用粉碎研磨儀適量進行粉碎，過80目篩，用純化水配制成不同濃度的制草烏給藥溶液。

2.2給藥劑量設置把臨床等效量設為中劑量進行了研究。制草烏高劑量組為臨床等效量的4倍量，即0.5143 g/kg；制草烏中劑量組為臨床等效量，即0.1285 g/kg；制草烏低劑量組為臨床等效量的1/4倍量，即0.0321 g/kg。

2.3動物分組及取材動物分組：取SD大鼠40只，按體重隨機分為正常組、制草烏高劑量組、制草烏中劑量組、制草烏低劑量組，每組10只。自實驗開始，給藥組給予相應的藥物溶液灌胃，每日1次，連續28 d；正常組灌胃等量生理鹽水。取材：末次給藥后，麻醉動物，用采血管從腹主動脈取血，使用離心機以3500r/min離心15min后移液槍分離血清到離心管，取部分肝臟組織固定于10%甲醛溶液后將血清和其余肝臟部分置于-80 ℃保存。隨后使用cobas c 311羅氏全自動生化分析儀（上海羅氏診斷產品有限公司）測肝生化指標及生物顯微鏡檢測病理切片分析其肝臟內源性代謝產物。

2.4代謝物提取置4 ℃解凍上述分組的血清樣本分別取100 μL，加入300 μL甲醇，震蕩提取于12000 rpm，4 ℃下離心10 min，取上清液過0.22 μm 有機濾膜，進樣10 μL，用UPLC-MS檢測。

分別稱取上述分組的肝臟樣品0.3 g于PE管中，加入1000 μL甲醇，使用玻璃研磨器研磨至勻漿，離心15min（4 ℃，12000 rpm），取上清液過0.22 μm 有機濾膜，進樣10 μL，用UPLC-MS檢測。

2.5UPLC-MS檢測色譜條件：采用SHIMADZU InerSustain C18色譜柱（100×2.1 mm，2 μm）。流動相A：乙腈，B：0.1%甲酸水溶液，流速0.3 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 uL。洗脫梯度：95%～30% B，0～7 min；30%～0% B，7～13 min；0%～95% B，13～16 min。

質譜參數條件：采用電噴霧電離（ESI）正離子和負離子模式進行檢測。ESI源條件如下：離子源 Gas1：50，離子源 Gas2：50，界面加熱溫度：500 ℃（正離子）和450 ℃（負離子），離子噴霧電壓浮動（ISVF）5500 V（正離子）和4400 V（負離子），氣簾氣壓力（CUR）：25，TOF質量掃描范圍：100-1200 Da，產物離子掃描范圍：50-1000 Da，產物離子掃描累積時間0.01 s，TOF MS 掃描累積時間0.2 s，二級質譜采用 information dependent acquisition（IDA）獲得，并采用high sensitivity模式，碰撞能量：35±15 eV，去簇電壓（DP）：±60 V。

2.6數據處理應用SPSS 22.0進行統計分析，各組生化指標用（x±s）表示。組間比較分別采用t檢驗、秩和檢驗、單因素方差分析法，以Plt;0.05為差異有統計學意義。

利用Analysis Base File Converter軟件將獲得的原始數據轉換成ABF格式，再導入MS-DIAL 4.60軟件進行峰信息的提取。使用MassBank，Respect，GNPS數據庫進行比對。分析各組樣本采用多維分析即PCA和PLS-DA法，篩選Plt;0.05，FCgt;1.5（或lt;0.5）及VIPgt;1作為差異代謝物。再使用MBRole 2.0分析代謝通路。

3結果

3.1多元統計分析

3.1.1血清生化指標檢測結果與正常組比較，從單個組別觀察制草烏高劑量組ALT顯著升高（Plt;0.05）；制草烏中和低劑量組ALT、AST、ALP含量無顯著差異。正常時血清中的AST含量較低，但相應細胞受損時，細胞膜通透性增加，胞漿內的AST釋放入血，故其血清濃度可升高［5］。肝細胞內ALT的濃度比血清高1000～3000倍。只要有1%的肝細胞壞死，便可使血中酶活性增高1倍，因此轉氨酶（尤其是ALT）是急性肝細胞損害的敏感標志。在肝臟細胞和線粒體受到損害后，兩者均會滲透到血液內，造成血清ALT、AST 水平明顯上升［5］。肝功能受損時AST、ALT往往會升高［6］。當AST明顯升高，AST/ALT的值大于1時，提示有肝實質的，預后不良。結果見表1。提示，制草烏超過臨床等效量4倍時具有一定的肝毒性。

3.1.2肝組織病理檢測肝組織病理檢測顯示，正常組肝小葉結構清晰，肝細胞索和肝血竇大致呈放射狀排列，肝細胞圓潤、飽滿，肝板排列規則、整齊。制草烏高劑量組肝細胞廣泛水腫、空泡化、喪失結構完整性；制草烏中和低劑量組未見明顯異常。見圖1。

3.1.3PCA結果及Metabo Analyst聚類結果分析PCA是依據主要新變量歸類各組數據，去除重異常和離群樣本，可觀察樣品的聚集、離散程度。如圖2所示，與正常組比較，制草烏高劑量組的大鼠血清代謝物呈完全分離。

利用Metabo Analyst軟件進行聚類分析，以熱圖的聚類結果分析組間差異，使用顏色梯度使不同分組間的差異實現可視化，不同顏色的區域代表不同的聚類分組，顏色深淺梯度表示代謝物水平。如圖3所示，與正常組比較制草烏高劑量組的血清代謝物相對豐度有明顯差異，其余組的代謝模式相似或者由相近的代謝物聚成類，差異較小。

以上表明，制草烏高劑量組可使大鼠血清代謝物產生一定變化。

3.1.4PLS-DA結果及單變量結果分析通過參數檢驗進行PLS-DA模型驗證，具有良好的解釋度和預測度（參數R2Y和Q2均大于0.5）。如圖4所示，與正常組比較，制草烏高劑量組大鼠血清代謝物能完全分離。表明制草烏高劑量組大鼠血清代謝物譜有顯著差異，其可能引起的毒性較為明顯。

在單變量分析中，采用倍數檢驗得到Fold Change，選用log2（倍數檢驗）作為橫坐標，并對各組數據進行t檢驗，選用-log10（t檢驗）作為縱坐標，得到火山圖。火山圖分析顯示，標紅的點為在倍數檢驗中大于2并且t檢驗中小于0.05的物質，即制草烏中具有顯著差異的代謝物。如圖5所示，與正常組比較，制草烏高劑量組血清中顯著差異代謝物較多。表明，肝毒性可使制草烏高劑量組產生顯著差異代謝物變化。

3.2差異代謝物的篩選為尋找潛在差異代謝物，以OPLS-DA中VIP≥ 1和Plt;0.05，且fold changegt;1.5（或lt;0.5）的標準篩選，用MassBank，Respect，GNPS數據庫進行檢索分析。

3.2.1血清差異代謝物的篩選制草烏高劑量組血清樣本中篩出34個差異代謝物。與正常組比較，制草烏高劑量組4-甲基-5-羥乙基噻唑、5-氨基戊酸、羥丁酸、異麥芽酮糖、L-瓜氨酸、甲芬那酸、蛋氨酸亞砜、煙酰胺、正亮氨酸、亞精胺、特非那定、氧化三甲胺、酪氨酸、D-異亮氨酸、葡萄糖明顯增加，（-）-核黃素、3-（4-羥基苯基）、羥基苯乳酸、9-芴酮、9-反式棕櫚酸、咖啡酰膽堿、3-氨基異丁酸、谷氨酰胺、反丁烯二酸、D-谷氨酰胺、果糖、L-（+）-賴氨酸、N-乙酰神經氨酸、L-亮氨酸、高脯氨酸、吡哆胺、L-正纈氨酸、癸二酸、十八碳烯酸明顯下降，見表2。

3.3通路富集分析將上述篩選出的差異代謝物導入MBRole 2.0分析其代謝通路。血清差異代謝物涉及ABC轉運蛋白（ABC transporters）、精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）、癌癥的中心碳代謝（Central carbon metabolism in cancer）、煙酸和煙酰胺代謝（Nicotinate and nicotinamide metabolism）、谷胱甘肽代謝（glutathione metabolism）、苯丙氨酸代謝（Phenylalanine metabolism）、cAMP信號通路（cAMP signaling pathway）、代謝途徑（Metabolic pathways）、GABA能突觸（GABAergic synapse）、β-丙氨酸代謝（beta-Alanine metabolism）等通路，見圖6。發現，血清代謝物均與ABC轉運蛋白相關性最強，其次為精氨酸和脯氨酸代謝、煙酸和煙酰胺代謝、癌癥的中心碳代謝。

3.4討論制草烏產生肝毒性時從檢測血清生化指標、肝組織病理檢測、PCA結果、Metabo Analyst聚類結果分析、 PLS-DA結果及單變量出現的變化規律表明制草烏高劑量組具有一定的肝毒性，從而探究的通路試驗分析結果表明制草烏肝臟毒性機制主要與煙酰胺（NA）與1-甲基煙酰胺（MNA）代謝有關。

4小結

代謝組學是一種可提供毒性評價和機理研究方法。它可通過對內源性代謝物進行動態分析，靈敏的監測藥物引起的異常代謝變化，同時闡明藥物毒性作用機理［7］。因此，代謝組學快速、高效的檢測技術對促進毒理學的研究，闡明肝毒性潛在標志物及安全用藥提供有力依據。

煙酸（NA）是機體必需的一種維生素，在體內轉化為煙酰胺（NAM），作為脫氫酶輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成成分，在氧化還原過程中起傳遞氫的作用。對維持體內脂質代謝、葡萄糖酵解、蛋白質、碳水化合物、氨基酸代謝等發揮著重要作用［8-9］。本研究發現，給予制草烏后大鼠血清內煙酸和煙酰胺代謝均發生

紊亂，如1-甲基煙酰胺含量增加。1-甲基煙酰胺（MNA）是煙酰胺的主要代謝物，具有抗血栓形成和抗炎作用。煙酰胺（NA）轉化為 1-甲基煙酰胺（MNA）和 N-甲基轉移酶（NNMT），其表達上調與肝硬化密切相關［10］。

草烏作為含有大毒的蒙藥，不合理應用將會對作為人體的重要器官的肝臟有著毒性作用。采用LC-MS非靶向代謝組學技術對肝臟組織內源性代謝產物進行檢測分析及觀察肝組織病理切片結果顯示，血清中制草烏高劑量組ALT異常升高，制草烏高劑量組肝細胞廣泛水腫、空泡化、喪失結構完整性；制草烏中劑量組部分肝細胞水腫；制草烏低劑量組未見明顯異常。引起此現象的主要與肝臟組織中的煙酸（NA）有關，結果表明制草烏對肝臟有著毒性作用主要與煙酸（NA）有關。最終發現臨床劑量高會出現肝臟廣泛的損害，臨床等效劑量與低劑量目前尚未發現一定的肝損傷。本實驗結果為下一步制草烏肝毒性進行其更加深入的研究奠定了基礎。

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