酶聯(lián)免疫吸附法與核酸檢測(cè)技術(shù)在血站血液標(biāo)本乙肝病毒篩查中的應(yīng)用

饒曉安，李麗娟

甘肅省張掖市中心血站檢驗(yàn)科，張掖 734000

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，全球范圍內(nèi)有數(shù)億人受到感染[1]。乙肝病毒的傳播途徑多樣，其中血液傳播是重要的途徑之一。因此，血站在采血和輸血前對(duì)血液進(jìn)行乙肝病毒篩查是保證血液安全、防止病毒傳播的關(guān)鍵步驟。盡管酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）已被廣泛用于血液中HBV 標(biāo)志物的篩查，但其對(duì)于低病毒載量的敏感性有限[2-3]。隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，核酸檢測(cè)技術(shù)（nucleic acid testing，NAT）因其高敏感性和特異性在乙肝病毒檢測(cè)中得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，能夠檢測(cè)到更早期的感染和低病毒載量的個(gè)體[4]。為進(jìn)一步提高血液制品的安全性，有必要對(duì)現(xiàn)有的血液篩查方法進(jìn)行評(píng)估，以確定最有效的篩查策略。電化學(xué)免疫發(fā)光法（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）作為一種HBV 血清學(xué)檢測(cè)被認(rèn)為是HBV 檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，具備較高的靈敏度和特異度，然而其需要特定的儀器進(jìn)行測(cè)量，且檢測(cè)限度較高，相比較ELISA 與核算混檢，其在血站HBV 篩查中可能存在局限性。比較ELISA 和NAT 在血站實(shí)際操作中的性能，對(duì)于優(yōu)化乙肝病毒篩查流程、降低輸血相關(guān)感染風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。本研究旨在評(píng)估酶聯(lián)免疫吸附法與核酸檢測(cè)技術(shù)在血站乙肝病毒篩查中的應(yīng)用效果，比較兩種方法在篩查靈敏度、特異性方面的差異。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2022 年1 月—2022 年12 月血站采集的血液標(biāo)本12 282 例作為研究對(duì)象，其中男性6632 例，女性5650 例，平均年齡為（39.82±5.34）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《獻(xiàn)血者健康檢查要求》相關(guān)規(guī)定；年齡在18～60 歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：由于溶血或污染導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果可能受到干擾的血液標(biāo)本。所有患者均簽署知情同意書，本研究在醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)監(jiān)督下進(jìn)行。

1.2 方法 血液標(biāo)本均來(lái)自無(wú)償獻(xiàn)血樣本，待凝集后3500 rpm 離心20 min 后留血清待檢，2～8℃低溫保存。通過(guò)電化學(xué)免疫發(fā)光法（ECLIA）檢測(cè)乙肝病毒血清標(biāo)志物，包括乙肝表面抗原（HBsAg）、乙肝表面抗體（HbsAb）、乙肝e 抗原（HbeAg）、乙肝e 抗體（HbeAb）及乙肝核心抗體（HbcAb）；通過(guò)ELISA 定性檢測(cè)HBsAg、HbsAb、HbeAg、HbeAb及HbcAb；NAT 法利用核酸提取擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，先進(jìn)行6 人份HBV-DNA 混樣檢測(cè)，混樣檢測(cè)無(wú)反應(yīng)則判斷為陰性，若混樣檢測(cè)有反應(yīng)，則進(jìn)行單人份拆分檢測(cè)，拆分檢測(cè)有反應(yīng)則判斷為陽(yáng)性，無(wú)反應(yīng)則判斷為陰性。主要儀器及試劑為：ECLIA 采用Roche Modular E170 全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀以及配套試劑；HBV-DNA 檢測(cè)采用羅氏核酸檢測(cè)系統(tǒng)以及配套試劑，ELISA 試劑為北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司；所有操作過(guò)程嚴(yán)格遵守標(biāo)準(zhǔn)操作流程。

1.3 觀察指標(biāo) 分析ELISA、NAT 檢測(cè)HBV 的診斷效能；比較兩種檢測(cè)方法的窗口期、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度、陽(yáng)性率、漏診率差異，其中特異度=真陰性/（真陰性+假陽(yáng)性）；敏感度=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陰性）；準(zhǔn)確度=檢測(cè)正確的數(shù)量（真陽(yáng)性+真陰性）/總檢測(cè)樣本數(shù)量×100%；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值=真陽(yáng)性/（真陽(yáng)性+假陽(yáng)性）；陰性預(yù)測(cè)值=真陰性/（真陰性+假陰性）；比較不同HBV 感染狀態(tài)患者HBV-DNA 陽(yáng)性率差異，判斷標(biāo)準(zhǔn)：大三陽(yáng)：HBsAg、HbeAg 與HbcAb 三者均為陽(yáng)性；小三陽(yáng)：HBsAg、HbeAb 與HbcAb 三者均為陽(yáng)性；小二陽(yáng)：HBsAg、HbcAb 均為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料如窗口期時(shí)間等經(jīng)過(guò)正態(tài)性檢驗(yàn)，確認(rèn)符合正態(tài)分布，表示為均值±標(biāo)準(zhǔn)差，使用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料如準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性檢出率、漏診率、HBV-DNA 陽(yáng)性率等表示為n（%），使用卡方檢驗(yàn)；以ECLIA 為參考結(jié)果，ELISA、NAT 檢測(cè)結(jié)果與其做一致性分析，并記錄Kappa值；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELISA 檢 測(cè)HBV 的 結(jié)果 ELISA 檢 測(cè)HBV 的陽(yáng)性59 例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為72.88%（43/59），陰性12 223 例，陰性預(yù)測(cè)值為99.90%（12 211/12 223），Kappa值=0.753。見(jiàn)表1。

表1 ELISA檢測(cè)HBV的結(jié)果（例）

2.2 NAT檢測(cè)HBV的結(jié)果 NAT檢測(cè)HBV陽(yáng)性66例，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為80.30%（53/66），陰性12 216 例，陰性預(yù)測(cè)值為99.98%（12 214/12 214），Kappa值=0.875。見(jiàn)表2。

表2 NAT檢測(cè)HBV的結(jié)果（例）

2.3 兩種檢測(cè)方法的窗口期、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度、陽(yáng)性率、漏診率比較 ELISA 檢測(cè)HBV 的窗口期高于NAT（P＜0.05），準(zhǔn)確度、靈敏度低于NAT，漏診率高于NAT（均P＜0.05）；ELISA、NAT 檢測(cè)HBV 的特異度、陽(yáng)性率比較，無(wú)差異（均P＞0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩種檢測(cè)方法的窗口期、準(zhǔn)確度、靈敏度、特異度、陽(yáng)性率、漏診率比較

2.4 不同HBV 感染狀態(tài)患者HBV-DNA 陽(yáng)性率比較 ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，大三陽(yáng)的HBV-DNA 陽(yáng)性率均高于小二陽(yáng)、小三陽(yáng)（均P＜0.05）；小二陽(yáng)、小三陽(yáng)兩者的HBV-DNA 陽(yáng)性率比較，無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩種方法檢測(cè)結(jié)果分析

3 討論

乙肝患者的血清學(xué)檢測(cè)一直以來(lái)被認(rèn)為是HBV檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，其中ECLIA 具備高靈敏度和特異度、寬線性范圍以及較高的可比性等，被認(rèn)為是一種可靠性較高的檢測(cè)方法。然而其需要使用特定的試劑盒和儀器，試劑的保存和使用一般需要遵循廠家的要求，無(wú)法適用于長(zhǎng)期儲(chǔ)存和大規(guī)模的批量檢測(cè)。ELISA 在既往被廣泛應(yīng)用于HBV 檢測(cè)，由于其成本低、操作簡(jiǎn)單，在HBV 的大規(guī)模篩查中具備顯著優(yōu)勢(shì)。然而由于對(duì)感染的早期階段反應(yīng)較差，通常需要一定窗口期才能檢測(cè)到抗體水平，且其對(duì)低病毒載量的敏感性低，ELISA 存在較高的漏診風(fēng)險(xiǎn)[5]。本研究結(jié)果顯示，其漏診率為0.09%，與既往研究結(jié)果相似[6]。這提示需要探究新的HBV 檢測(cè)方法作為對(duì)血清學(xué)診斷方法的補(bǔ)充，提高血清學(xué)診斷方法對(duì)HBV 的診斷效能。

NAT 是一種基于核酸的病原體檢測(cè)方法，用于檢測(cè)病毒、細(xì)菌或其他微生物的核酸（DNA 或RNA），具備高度敏感度和特異性。本研究結(jié)果顯示，NAT檢測(cè)HBV 的靈敏度為96.36%，特異度為99.89%，準(zhǔn)確度為99.87%，與既往研究結(jié)果相似[7-8]。并且ELISA 檢測(cè)HBV 的窗口期高于NAT（P＜0.05），準(zhǔn)確度、靈敏度低于NAT，漏診率高于NAT（P＜0.05）。這提示NAT 可進(jìn)一步提高對(duì)HBV 的診斷效能，且窗口期短。究其原因認(rèn)為，NAT 直接檢測(cè)HBV 的核酸（DNA 或RNA），而ELISA 檢測(cè)的是體液中的抗原或抗體。通過(guò)直接檢測(cè)病毒核酸，NAT 可以在感染早期就能發(fā)現(xiàn)病毒存在，而ELISA 需要等到免疫系統(tǒng)產(chǎn)生足夠的抗體才能被檢測(cè)到[9-10]，可知NAT 對(duì)于低病毒載量的HBV 仍然能夠獲得陽(yáng)性結(jié)果，從而具備較高的準(zhǔn)確度和靈敏度，降低漏診率[11]。此外，本研究顯示，大三陽(yáng)的HBV-DNA 陽(yáng)性率均高于小二陽(yáng)、小三陽(yáng)（均P＜0.05）。這說(shuō)明HBV-DNA 陽(yáng)性率可有效反映HBV 的傳染性。其中30 例“大三陽(yáng)”中，27 例檢出HBV-DNA 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為90.00%；19 例“小三陽(yáng)”和10 例“小二陽(yáng)”患者中，分別有12 例和4 例 檢出HBV-DNA 陽(yáng)性，陽(yáng)性率為63.15%、40.00%，陽(yáng)性率雖然小于“大三陽(yáng)”組，但是此類患者不容忽視，如果不積極抗病毒治療，任其發(fā)展可導(dǎo)致肝硬化[12]。

綜上所述，ELISA、NAT 均對(duì)HBV 檢測(cè)具備較高的診斷效能，其中NAT 檢測(cè)可提高HBV 檢測(cè)的準(zhǔn)確度和靈敏度，降低漏診風(fēng)險(xiǎn)，且可有效反映HBV傳染性，可為臨床中HBV 的預(yù)防和治療策略的制訂提供參考。