TPD52和TPD52L2在胃癌中異常表達(dá)的臨床病理特征分析和相關(guān)基因共表達(dá)意義研究

高夏青,楊春婷,郭雙銘,韓 靜,樊 濤,楊 霄,李海龍*

(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院,甘肅 蘭州730000;2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 科研科,甘肅 蘭州730000)

胃癌是全球最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。流行病學(xué)資料顯示,2022年中國(guó)大約有51萬(wàn)新發(fā)胃癌病例和40萬(wàn)胃癌死亡病例[1]。到目前為止,手術(shù)治療仍然是早期胃癌最重要的治療手段。因此,探索胃癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,尋找可靠的分子標(biāo)記物對(duì)于提高胃癌的早期診斷和靶向治療水平均有重要的臨床意義。人類(lèi)腫瘤蛋白D52(human tumor protein D52,hTPD52)家族是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)原癌基因,其家族成員包括腫瘤蛋白D52(TPD52)、腫瘤蛋白D52樣1(TPD53、TPD52L1)、腫瘤蛋白D52樣2(TPD54、TPD52L2)和腫瘤蛋白D52樣3(TPD55、TPD52L3)[2]。眾多研究表明,hTPD52家族在腫瘤的進(jìn)展中扮演著重要角色[3-14]。但鮮見(jiàn)TPD52和TPD52L2與胃癌的研究報(bào)道,本研究借助于生物信息學(xué)方法評(píng)估TPD52和TPD52L2在胃癌中的差異表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性,分析TPD52和TPD52L2的表達(dá)和胃癌患者預(yù)后的關(guān)系,并探討TPD52和TPD52L2共表達(dá)基因參與胃癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)信號(hào)通路,以期為胃癌的基因靶向治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 TPD52和TPD52L2差異表達(dá)水平的比較

從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的胃癌項(xiàng)目獲取基因表達(dá)數(shù)據(jù)(407例,包括32例癌旁組織樣本和375例腫瘤組織樣本),使用R語(yǔ)言軟件包pROC和ggplot2進(jìn)行TPD52和TPD52L2的差異表達(dá)和ROC曲線分析。

1.2 TPD52和TPD52L2與臨床病理特征的相關(guān)性

基于從TCGA獲取的407例胃癌患者的數(shù)據(jù)信息,借助R語(yǔ)言軟件包ggplot2比較TPD52和TPD52L2的表達(dá)與胃癌患者的病理分期、組織學(xué)分級(jí)、幽門(mén)螺旋桿菌感染和Barretts食管的相關(guān)性。

1.3 TPD52和TPD52L2的免疫組化分析

通過(guò)Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)[15](https://www.proteinatlas.org/)分析TPD52和TPD52L2在胃癌組織和癌旁組織中的免疫組化染色情況。

1.4 TPD52和TPD52L2與胃癌的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)分析

通過(guò)單樣本基因集富集分析(ssGSEA)的方法分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中胃癌與免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)情況,以及選取Spearman秩相關(guān)性分析與免疫細(xì)胞的相關(guān)度,使用R語(yǔ)言軟件包GSVA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和可視化。

1.5 TPD52和TPD52L2與胃癌預(yù)后關(guān)系的分析

借助于Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)[16](https://kmplot.com/analysis/)在線評(píng)估TPD52和TPD52L2在胃癌中的表達(dá)與總生存期(OS)、首次進(jìn)展生存期(FP)和再次進(jìn)展生存期(PPS)的關(guān)系,并使用R語(yǔ)言軟件包rms、survival對(duì)TCGA數(shù)據(jù)建立Nomogram(列線圖)模型、繪制Calibration(校準(zhǔn)曲線)圖、單因素和多因素Cox回歸分析。

1.6 TPD52和TPD52L2共表達(dá)基因的信號(hào)通路富集分析

通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)[17](https://www.cbioportal.org/)中(TCGA,PanCancer Atlas)胃癌患者的數(shù)據(jù),提取TPD52和TPD52L2的共表達(dá)基因,隨后將Spearman秩相關(guān)系數(shù)(r)的絕對(duì)值≥0.3的共表達(dá)基因輸入SangerBox數(shù)據(jù)分析軟件[18](http://vip.sangerbox.com/home.html)進(jìn)行KEGG富集分析并繪圖。

1.7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)分析與核心基因的篩選

基于cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)篩選的共表達(dá)基因,結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫(kù)[19](https://cn.string-db.org/)構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò),以相互作用分?jǐn)?shù)≥0.7作為閾值,并使用Cytoscape 3.9軟件中CytoNCA插件篩選核心基因。

1.8 核心基因在胃癌中的生存曲線和相關(guān)性分析

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證核心基因與胃癌患者總生存期的關(guān)系,進(jìn)一步借助R語(yǔ)言軟件包ggplot2探索核心基因與TPD52和TPD52L2的相關(guān)性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

R語(yǔ)言軟件包(v.3.6.3)用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間的差異表達(dá)采用t檢驗(yàn)。與臨床病理特征的相關(guān)性分析使用F檢驗(yàn);Spearman秩相關(guān)系數(shù)分析TPD52和TPD52L2的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和共表達(dá)基因;生存分析采用log-rank檢驗(yàn);單因素和多因素的生存分析使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型;富集分析使用FDR方法;Pearson相關(guān)系數(shù)分析TPD52和TPD52L2與核心共表達(dá)基因的相關(guān)性。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TPD52和TPD52L2在胃癌組織中的差異表達(dá)結(jié)果分析

為了探索TPD52和TPD52L2在胃癌進(jìn)展中的作用,使用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(32例癌旁組織樣本和375例腫瘤組織樣本)預(yù)測(cè)基因的差異表達(dá),結(jié)果表明:與癌旁組織相比,TPD52和TPD52L2在胃癌組織中均高表達(dá)(P<0.001)(圖1A,C)。TPD52表達(dá)水平的ROC曲線下面積為0.794(95%CI=0.730～0.859)(圖1B),TPD52L2為0.809(95%CI=0.728～0.890)(圖1D),提示均有一定的診斷價(jià)值。

圖1 TPD52(A,B)和TPD52L2(C,D)在胃癌組織與癌旁組織中的差異表達(dá)和ROC曲線

2.2 TPD52和TPD52L2與胃癌患者臨床病理特征的結(jié)果分析

進(jìn)一步分析胃癌組織與癌旁組織中TPD52和TPD52L2的表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果表明:與癌旁組織相比,TPD52和TPD52L2高表達(dá)與病理分期、組織學(xué)分級(jí)、幽門(mén)螺旋桿菌感染和Barretts食管均密切相關(guān),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2A-H)。

圖2 TPD52和TPD52L2分別在胃癌不同分期(A,E)、不同分級(jí)(B,F)、幽門(mén)螺旋桿菌感染(C,G)和Barretts食管(D,H)中的表達(dá)

2.3 Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化結(jié)果分析

通過(guò)Human Protein Atlas數(shù)據(jù)庫(kù)下載TPD52和TPD52L2在胃癌組織和癌旁組織的免疫組化染色結(jié)果圖片。分析結(jié)果顯示:TPD52在癌旁組織(圖3A)和胃癌組織(圖3B)中均染色成陽(yáng)性;TPD52L2在癌旁組織(圖3C)中染色成陰性,在胃癌組織(圖3D)中染色成陽(yáng)性。

圖3 TPD52(A,B)和TPD52L2(C,D)分別在癌旁組織和胃癌組織的免疫組化染色結(jié)果

2.4 TPD52和TPD52L2的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的結(jié)果分析

通過(guò)Spearman秩相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),TPD52的表達(dá)與免疫細(xì)胞Th2 cells(輔助性T細(xì)胞2)和T helper cells(輔助性T細(xì)胞)等細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān),與免疫細(xì)胞NK cells(自然殺傷細(xì)胞)、pDC(漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞)等細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖4A);TPD52L2的表達(dá)與免疫細(xì)胞Th2 cells的浸潤(rùn)豐度呈正相關(guān),與免疫細(xì)胞pDC和Mast cells(肥大細(xì)胞)等細(xì)胞的浸潤(rùn)豐度呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(圖4B)。

圖4 TPD52(A)和TPD52L2(B)與胃癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的相關(guān)性

2.5 TPD52和TPD52L2的表達(dá)在胃癌中的獨(dú)立診斷價(jià)值結(jié)果分析

Kaplan-Meier生存曲線結(jié)果表明:TPD52高表達(dá)組胃癌患者的OS、FP和PPS高于低表達(dá)組,可能由于樣本量的差異與預(yù)期結(jié)果不符(圖5A-C)。TPD52L2高表達(dá)組胃癌患者的OS、FP和PPS低于低表達(dá)組(P<0.05)(圖5D-F),表明高表達(dá)組的生存期明顯縮短。然后使用TNM分期、病理分期、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)類(lèi)型、TPD52和TPD52L2的表達(dá)作為預(yù)測(cè)胃癌患者1年OS的指標(biāo)(圖6A,C)。校準(zhǔn)曲線圖顯示了1年臨床結(jié)果的理想預(yù)測(cè)(圖6B,D)。TPD52和TPD52L2的單因素Cox分析結(jié)果表明,T期、N期、M期和病理分期與胃癌患者的預(yù)后不良相關(guān),多因素Cox分析結(jié)果表明,M分期是影響胃癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)(表1)。

表1 單因素和多因素Cox回歸分析TPD52和TPD52L2的表達(dá)與OS的相關(guān)性

圖5 TPD52和TPD52L2表達(dá)水平與胃癌患者的OS(A,D)、FP(B,E)和PPS(C,F)生存曲線分析

圖6 TPD52(A,B)和TPD52L2(C,D)表達(dá)的列線圖的構(gòu)建與驗(yàn)證

2.6 TPD52和TPD52L2的共表達(dá)基因信號(hào)通路富集分析結(jié)果

通過(guò)cBioPortal數(shù)據(jù)庫(kù)和SangerBox數(shù)據(jù)平臺(tái)分析TPD52和TPD52L2共表達(dá)基因的KEGG富集分析。分析結(jié)果表明:與TPD52有相關(guān)性的1 365個(gè)共表達(dá)基因主要富集在代謝通路、癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)和TNF信號(hào)通路等信號(hào)通路中(圖7A)。與TPD52L2有相關(guān)性的412個(gè)共表達(dá)基因主要富集在癌癥通路、剪接體和小細(xì)胞肺癌等信號(hào)通路中(圖7B)。

圖7 TPD52(A)和TPD52L2(B)共表達(dá)基因的KEGG富集分析

2.7 共表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與核心基因的篩選結(jié)果

通過(guò)STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建TPD52和TPD52L2共表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)分析,TPD52的平均節(jié)點(diǎn)度為1.08,TPD52L2的平均節(jié)點(diǎn)度為1.33,PPI網(wǎng)絡(luò)富集均P<0.001,隨后分別下載PPI網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件中,使用CytoNCA插件篩選PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心共表達(dá)基因。分析結(jié)果顯示:TPD52位于前10的核心共表達(dá)基因包括PLCG1、PRKACA、MAPK11、CYCS、NGFR、PTK2、NCOR2、NOTCH3、PSEN1和ST3GAL3(圖8A),TPD52L2位于前10的核心共表達(dá)基因包括RUVBL1、NOP56、HSP90AB1、JAK2、CCT6A、PLCG1、PSMA7、EIF6、HJURP和TAF4(圖8B)。

圖8 TPD52(A)和TPD52L2(B)共表達(dá)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.8 核心基因的生存期和相關(guān)性分析結(jié)果

使用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證TPD52和TPD52L2前5位核心共表達(dá)基因與胃癌患者總生存期的關(guān)系。結(jié)果表明:TPD52核心共表達(dá)基因PLCG1、PRKACA、MAPK11和NGFR高表達(dá)組比低表達(dá)組患者的總生存期低(P<0.05),CYCS高表達(dá)組比低表達(dá)組患者的總生存期高(P<0.05)(圖9A-E)。TPD52L2核心共表達(dá)基因HSP90AB1高表達(dá)組比低表達(dá)組患者的總生存期低(P<0.05),核心共表達(dá)基因RUVBL1、NOP56、JAK2和CCT6A高表達(dá)組比低表達(dá)組患者的總生存期高(P<0.05)(圖9F-J)。進(jìn)一步借助R語(yǔ)言軟件包ggplot2驗(yàn)證TPD52和TPD52L2與前5位核心共表達(dá)基因的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn)MAPK11、CYCS和NGFR是與TPD52關(guān)系最緊密的基因(P<0.05)(圖10A-C),RUVBL1、NOP56、HSP90AB1和CCT6A是與TPD52L2關(guān)系最緊密的基因(P<0.05)(圖10D-G)。

圖9 TPD52(A-E)和TPD52L2(F-J)核心共表達(dá)基因在胃癌中的生存分析

圖10 TPD52(A-C)和TPD52L2(D-G)與核心共表達(dá)基因的相關(guān)性

3 討論

TPD52最初在人類(lèi)乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)高表達(dá),位于染色體8q21[20],是腫瘤中常見(jiàn)的染色體擴(kuò)增區(qū)域,與細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。miRNA是一種內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子,在動(dòng)植物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控[21],miRNA通過(guò)結(jié)合靶信使mRNA的3′-UTR抑制mRNA轉(zhuǎn)錄,促進(jìn)RNA降解。然而,TPD52和TPD52L2在不同腫瘤中可作為多種miRNA的靶點(diǎn)。有研究表明,miR-449、miR-34a、miR-1323和miR-218-5p通過(guò)靶向調(diào)節(jié)TPD52抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[22-25],miR-107通過(guò)Wnt/β-連環(huán)蛋白信號(hào)通路下調(diào)TPD52的表達(dá)水平來(lái)增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性[26]。miR-218、miR-224和miR-103a-3p通過(guò)下調(diào)TPD52的表達(dá)抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[27-29],外源性表達(dá)的TPD52也可激活PKB/Akt信號(hào)通路,通過(guò)ανβ3整合素促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的遷移[30],另一方面,TPD52通過(guò)與PRDX1相互作用增加PRDX1過(guò)氧化物酶活性,外源性TPD52在前列腺癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了PRDX1的二聚化,下調(diào)TPD52和PRDX1可協(xié)同抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖[31]。miR-139-5p通過(guò)下調(diào)TPD52抑制子宮平滑肌瘤細(xì)胞的增殖,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G1期阻滯[32]。LEWIS等[33]研究發(fā)現(xiàn),小鼠TPD52(mD52)在3T3細(xì)胞中的表達(dá)誘導(dǎo)多個(gè)參與促進(jìn)轉(zhuǎn)移的基因上調(diào),而預(yù)防腫瘤形成和轉(zhuǎn)移的基因則被下調(diào)。WANG等[34]沉默TPD52通過(guò)降低Akt在Ser473位點(diǎn)的磷酸化來(lái)抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。TPD52在維甲酸誘導(dǎo)的IMR-32神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的體外神經(jīng)元分化中也發(fā)揮了重要作用[35]。LI等[36]報(bào)道TPD52在結(jié)直腸癌中過(guò)表達(dá)通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)(EMT)轉(zhuǎn)化并激活黏著斑激酶介導(dǎo)的整合素和PI3K/Akt信號(hào)通路來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在腎細(xì)胞癌中,TPD52過(guò)表達(dá)可顯著上調(diào)E-鈣黏蛋白和下調(diào)N-鈣黏蛋白與波形蛋白的表達(dá),表明TPD52能抑制EMT轉(zhuǎn)化,從而影響腫瘤的進(jìn)展[7]。沉默TPD52還可抑制胃癌[37]、血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞[38]、鼻咽癌細(xì)胞[39]和肺鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞[40]的進(jìn)展,其TPD52的表達(dá)水平與膽管癌患者的病理分化和TNM分期密切相關(guān)[41]。

TPD52L2基因定位于染色體20q13[42],在人類(lèi)腫瘤中廣泛表達(dá)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)TPD52L2可以和一種在進(jìn)化上非常保守的非跨膜ATP結(jié)合蛋白hABCF3結(jié)合,在體外促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖[43]。miR-485-5p直接下調(diào)其靶點(diǎn)TPD52L2顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[44],TPD52L2的表達(dá)還可通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt/β-連環(huán)蛋白/snail信號(hào)通路影響膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的惡性生物學(xué)行為[45]。miR-217通過(guò)沉默TPD52L2顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和G0/G1期阻滯[46]。REN等[47]研究顯示TPD52L2高表達(dá)與前列腺癌患者的預(yù)后不良相關(guān),沉默TPD52L2可抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖和集落形成[48]。MUKUDAI等[49]發(fā)現(xiàn)TPD52L2通過(guò)talin 1介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)節(jié)整合素的激活,從而影響口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的遷移、細(xì)胞外基質(zhì)的黏附和PKB/Akt的激活。ZHUANG等[50]對(duì)TPD52L2的敲除可增加PDH-E1α蛋白的降解,導(dǎo)致PDH酶活性降低,減少線粒體的耗氧量和活性氧的產(chǎn)生,從而促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞對(duì)二甲雙胍的耐藥。

本研究結(jié)果表明,TPD52和TPD52L2在胃癌組織中高表達(dá),其表達(dá)水平與臨床病理特征和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)密切相關(guān),ROC曲線結(jié)果顯示,TPD52和TPD52L2具有一定的診斷價(jià)值。生存曲線結(jié)果表明,TPD52L2高表達(dá)組比低表達(dá)組生存期明顯縮短,TPD52和TPD52L2的單因素Cox分析結(jié)果表明,TNM分期和病理分期與胃癌患者的預(yù)后不良相關(guān),多因素Cox分析結(jié)果表明,M分期是影響胃癌患者OS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示TPD52和TPD52L2可作為診斷胃癌的潛在分子靶標(biāo),進(jìn)一步增強(qiáng)了TPD52和TPD52L2作為預(yù)后指標(biāo)的可信度。通過(guò)對(duì)KEGG富集分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),TPD52相關(guān)基因主要參與了代謝通路和癌癥的轉(zhuǎn)錄失調(diào)等信號(hào)通路,TPD52L2相關(guān)基因主要參與了癌癥通路和剪接體等信號(hào)通路,表明TPD52和TPD52L2可能通過(guò)以上通路調(diào)控胃癌的發(fā)生發(fā)展。PPI網(wǎng)絡(luò)中核心基因生存分析結(jié)果表明,高表達(dá)組的PLCG1、PRKACA、MAPK11、NGFR和HSP90AB1預(yù)后較差,相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)MAPK11、CYCS和NGFR是與TPD52關(guān)系最緊密的基因,RUVBL1、NOP56、HSP90AB1和CCT6A是與TPD52L2關(guān)系最緊密的基因,可作為探討TPD52和TPD52L2參與胃癌惡性生物學(xué)行為的候選基因。

綜上所述,本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法對(duì)TPD52和TPD52L2的深入挖掘,進(jìn)一步證明了TPD52和TPD52L2與胃癌的發(fā)生發(fā)展存在密切的關(guān)系,可作為未來(lái)胃癌早期診斷和基因治療的潛在靶點(diǎn)。但由于TPD52和TPD52L2影響胃癌患者預(yù)后的確切機(jī)制尚未完全闡明,應(yīng)進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證本研究的結(jié)論。