腸道菌群代謝物TMAO對兔動脈粥樣硬化斑塊形成及狹窄程度的影響

路懷志,池 堯,趙 輝,許學升

(1.商丘市第一人民醫院 心血管內科,河南 商丘476000;2.吉林大學第二醫院 心內科,吉林 長春130041)

冠心病在世界范圍內依然是威脅人類健康的重大公共衛生問題[1]。因此,早期發現加速斑塊產生或者加快其發展速度的因素,對于降低疾病發生率具有重要意義。腸道菌群及其代謝產物是近年來研究熱點,已有研究證明其與動脈硬化疾病存在一定相關性[2]。氧化三甲胺(Trimetlylamine oxide,TMAO),作為腸道菌群代謝產物之一,其高水平與臨床不良心血管事件發生呈正相關[3-4],但TMAO是否具有直接促進動脈粥樣硬化斑塊形成及進展的作用缺乏研究數據。本研究以新西蘭兔為研究對象,通過TMAO干預與阻斷,來評估TMAO對于斑塊形成及血管管腔狹窄程度的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 健康純種雄性新西蘭白兔32只,體重3～4 Kg,購自鄭州兔爾康牧業有限公司,飼養于鄭州大學動物實驗中心標準條件下,實驗方案符合鄭州大學動物實驗中心要求,并經鄭州大學動物研究委員會審核批準。

1.1.2主要器材及試劑 冰凍切片機[賽默飛世爾科技(中國)有限公司,型號 CRYOSTAR NX50];成像系統(日本尼康,型號 NIKON DS-U3);無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司);通用型組織固定液、HE 染液套裝、EVG 染液套裝、Masson 染液套裝、油紅染液、蘇木素染液、分化液及返藍液(Servicebio公司);氯化膽堿、DMB試劑(阿拉丁公司);飼料(北京科澳協力飼料有限公司)。

1.2 方法

1.2.1將兔隨機分為A、B、C、D共4組,每組8只,A組為空白對照組:普通飼料喂養;B組為模型組:低溫氣體損傷+高脂飲食(1%膽固醇+8%豬油+10%蛋黃粉+兔基礎飼料);C組為TMAO組:低溫氣體損傷+高脂飲食+氯化膽堿灌胃(1.5%氯化膽堿無菌生理鹽水4 ml,可促進TMAO的產生,每天1次)。D組為TMAO抑制組:低溫氣體損傷+高脂飲食+氯化膽堿灌胃+TMAO抑制劑飲水[含1.0%的3,3-二甲基-1-丁醇(DMB)]。

1.2.2造模方法 B、C、D組兔高脂喂養1周后進行內膜損傷。建模步驟:①3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉及備皮后暴露右側頸總動脈。②阻斷血流并留置裝置:利用動脈夾阻斷遠心端血流后再以同樣方法阻斷近心端血流。注射器針頭于分離動脈的遠心端刺入血管,生理鹽水沖洗血管管腔,從近心端使用靜脈輸液針平行于血管縱軸方向刺入血管并留置。③進行低溫氣體損傷:于液氮治療儀中注入液氮200 ml,封閉后快速連接靜脈輸液針。封閉液氮治療儀后端通氣孔后液氮由槍頭噴出并氣化為低溫氣體,氣體經靜脈輸液針導入血管,頸動脈被低溫氣體充盈,出現膨脹,并由遠心端穿刺孔噴出,持續5 s后放開液氮治療儀后端通氣孔,如此過程反復進行3次。④損傷后處理:用生理鹽水沖洗動脈管腔后,進行壓迫止血,止血后青霉素生理鹽水沖洗手術切口,縫合皮膚創口并以碘伏消毒。術后連續3 d肌注青霉素鈉40萬單位預防感染。A組兔,不進行低溫氣體損傷,余操作同其他組。術后各組繼續喂養12周。低溫氣體輸出裝置:由液氮治療儀、一次性使用靜脈輸液針構成。

1.2.3血清學指標檢測 分別于高脂飲食前、血管損傷后12周,采集兔外周血,檢測各組血脂及TMAO水平。

1.2.4血管病理組織學切片 留取血管標本后行HE染色、Masson三色染色、彈力纖維染色及油紅O染色。利用Image-Pro Plus 6.0測算斑塊面積,狹窄率(斑塊的像素面積/管腔的像素面積×100)。并對斑塊狹窄程度及TMAO濃度進行相關性分析。

2 結果

2.1 一般情況

B組1只白兔因腹瀉死亡,A、C、D組各1只白兔因麻醉過量死亡,余動物均完成實驗。

2.2 各組血脂水平比較

與高脂飲食前比較,模型組、TMAO組及TMAO抑制組喂養13周后HDL-C差異沒有統計學意義(P>0.05),但LDL-C、TC、TG水平均顯著增高,差異存在統計學意義(P<0.05)。高脂飲食13周后3組間HDL-C、LDL-C、TG、TC差異沒有統計學意義(P>0.05),與對照組比較,3組LDL-C、TC、TG水平均顯著增高,差異存在統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組間LDL-C、HDL-C、TC、TG水平對比

2.3 4組間血清TMAO水平比較

喂養13周后TMAO組血清TMAO水平較余3組差異均存在統計學意義(P<0.05),較喂養前亦有顯著性升高(P<0.05)。其余3組間TMAO水平差異沒有統計學意義(P>0.05),見表2。

表2 4組間TMAO水平對比

2.4 血管斑塊染色比較

4組血管分別進行了HE、Masson、彈力纖維及油紅O染色評估斑塊形態及管腔狹窄情況。可見A組血管管腔內皮細胞完整,中層平滑肌細胞形態及排列正常,無斑塊形成,無脂質沉積(見圖1A、B、C、D)。B組血管可見斑塊形成(圖1E),Masson三色染色膠原纖維呈現藍染,表達豐富,中膜平滑肌細胞與心外彈力板排列整齊(圖1F);中層彈力纖維呈現規律的彎曲改變,無血管重構表現(圖1G),少量脂質沉積(圖1H)。C組血管從切片上來看,斑塊纖維帽薄(圖1I),脂質核心較大(圖1I、1L),內膜中各種來源的泡沫細胞豐富,Masson三色染色顯示纖維帽中藍染的膠原纖維散在,含量明顯偏少(圖1J),彈力纖維染色中,部分血管中膜彈力纖維被牽拉變直,中膜變薄(圖1K),均符合典型的易損斑塊特點。D組血管表現整體情況類似B組(圖1M、N、O、P),有斑塊形成,但較C組斑塊相對較小,結構更加完整。

圖1 4組目標血管分別進行了HE、Masson、彈力纖維及油紅O染色[A:對照組血管HE染色(×40),可見血管內膜、中膜及外膜結構完整,無斑塊形成;B:對照組血管Masson染色(×40),血管壁膠原纖維豐富;C:對照組血管彈力纖維染色(×40),血管彈力板結構完整;D:對照組血管油紅O染色(×40),血管內無脂質沉積;E:模型組HE染色(×40),可見血管管腔內斑塊形成;F:模型組Masson染色(×40),血管壁膠原纖維豐富;G:模型組彈力纖維染色(×40),血管彈力板結構完整;H:模型組油紅O染色(×40),血管內存在脂質沉積;I:TMAO組HE染色(×40),管腔可見明顯斑塊形成;J:TMAO組Masson染色(×40),纖維帽薄,斑塊整體膠原纖維含量少;K:TMAO組彈力纖維染色(×40),彈力板破損,城墻樣形態消失,部分斷裂;L:TMAO組油紅O染色(×40),斑塊富含脂質,并形成脂質核心;M:TMAO抑制組HE染色(×40),血管內斑塊形成,但體積較小;N:TMAO抑制組Masson染色(×40),斑塊膠原纖維含量較多,纖維帽較厚;O:TMAO抑制組彈力纖維染色(×40),彈力板相對完整,形態輕度改變;P:TMAO抑制組油紅O染色(×40),部分脂質沉積,未見脂質核心]

2.5 4組血管斑塊面積及狹窄率對比

各組管腔面積差異無統計學意義(P>0.05)。對照組未見明顯斑塊形成,斑塊面積及狹窄率與余各組差異均有統計學意義(P<0.05)。TMAO組斑塊面積顯著大于模型組、TMAO抑制組,差異有統計學意義(P<0.05),管腔平均狹窄率74.38%,均高于模型組與TMAO抑制組。模型組與TMAO抑制組組間斑塊面積及狹窄率差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

表3 各組間斑塊面積、管腔面積及狹窄率對比

2.6 血清TMAO濃度與斑塊狹窄程度的相關性

Pearson 相關分析結果顯示,血清TMAO水平與管腔狹窄率呈正相關(r=0.61,P<0.01;圖2)。

圖2 血清TMAO濃度與狹窄程度的相關性分析

3 討論

本研究以低溫氣體直接損傷血管內皮,模擬高血壓、糖尿病、吸煙等心血管危險因素對血管內皮的損傷,并輔以高脂飲食,建立動脈粥樣硬化斑塊模型[5]。從病理切片上來看,除空白對照組外,均形成了動脈硬化斑塊,說明造模成功。在本研究中,TMAO與 TG、HDL-C、LDL-C、TC等血脂指標無明顯相關性,與劉振東等[6]研究一致。

TMAO促進了斑塊的形成并增加不穩定性傾向。雖然內皮損傷后給予高脂飲食,均可大概率引起動脈硬化斑塊形成,但TMAO組,因高膽堿飲食的干預引起TMAO水平的升高,斑塊有著更大的脂質核心,而模型組及TMAO抑制組,脂質核心并不明顯。目前研究發現,含有大脂質核心的斑塊,易于破裂繼發血栓形成導致血管阻塞,引起急性心血管事件[7]。同時,模型組及TMAO抑制組有著更厚的纖維帽,斑塊內膠原纖維更為豐富。斑塊肩部纖維帽受血管應力影響較大,若斑塊纖維帽內膠原纖維缺乏,易導致纖維帽發生破裂[8]。彈力纖維顯色中可以看到,TMAO組部分內彈力板破損,部分血管中膜彈力纖維被牽拉變直,血管中膜變薄,甚至中膜消失后內膜與外膜相接,展示了血管重構的一面,而模型組及TMAO抑制組血管整體結構基本未見顯著被侵蝕改變,這種斑塊更加穩定。TMAO促進斑塊的不穩定性,可能與積極地參與了動脈粥樣硬化過程中的各種生物反應相關。動物研究中發現,高濃度TMAO能通過ROS-TXNIP通路誘導TXNIP-NLRP3炎性體的活化,以劑量和事件依賴性的方式促進白介素-1β(IL-1β)的成熟和分泌,并且增加白介素-18(IL-18)等炎癥因子的表達[9],從而引發炎癥和免疫反應導致內皮損傷,并最終影響AS斑塊的進展。同時也有實驗證明,TMAO能通過NLRP3通路促進巨噬細胞向M1型巨噬細胞轉化,上調IL-1β、腫瘤破壞因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)等炎癥因子的表達[10],導致炎癥細胞的募集、促進細胞外基質的降解、加重內皮細胞功能障礙,進而對AS的進展產生影響。此外,利用經TMAO誘導內皮祖細胞(EPCs)的實驗證明了在TMAO能使EPCs上調IL-6、CRP、TNF-α、ROS以及減少了NO的產生[11]。TMAO還能通過促有絲分裂原活化的蛋白激酶和NF-kB信號加重炎癥,下調抗炎因子白介素-10(IL-10)表達[12]。這些炎癥因子表達的增加,加速了AS的形成和發展,并可促進急性斑塊破裂事件的發生。因此,TMAO的過表達促進斑塊炎癥反應,可引起斑塊結構不穩定,顯著增加斑塊破裂出血風險,引起急性心腦血管事件的發生。

通過斑塊測量數據,本研究中3組間管腔面積未有明顯差異,但TMAO組斑塊面積及狹窄程度顯著偏大,平均狹窄74.38%,遠高于其余兩組。斑塊面積及狹窄程度很大程度上決定了患者的臨床癥狀,同時,斑塊負荷重的易損斑塊更易出現破裂閉塞[13],增加急性心血管事件,并增加冠脈介入干預或冠脈搭橋手術治療的風險。通過Pearson相關分析,發現斑塊造成的管腔狹窄率與TMAO濃度存在正相關。可見,TMAO的過表達對斑塊的形成及發展均有重要影響,斑塊體積及管腔狹窄的增大均可顯著增加臨床冠脈血運重建治療的機率。

因此,本研究結果顯示腸道菌群代謝物TMAO對血脂并無顯著性影響,但其表達增加后可促進動脈粥樣硬化斑塊的產生,并加重斑塊內脂質沉積,增加狹窄程度,增加斑塊的不穩定性并可能引起急性血栓事件,對其抑制后有改善作用。但本研究存在一定局限性,一是樣本量偏小,統計可能有一定偏倚,二是TMAO影響動脈硬化斑塊產生與發展的具體機制如何,本研究并未涉及。