PON1基因在肝細胞癌中的表達及其對臨床預后的意義和免疫浸潤分析

龍小玲,卜昆鵬,曹 昭,黃軍強,馬彩芳,盧秋龍,曾 煥,張 云,舒 宏*

(1.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院,廣西 南寧530021;2.廣西醫科大學第一附屬醫院,廣西 南寧530021)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)作為世界上第六大最常見的惡性腫瘤,全球死亡率在所有類型的癌癥中排名第二,且每年在全球新增的病例超過90萬[1-4]。在中國,HCC的發生很大程度與肝臟炎癥關系密切[5]。慢性肝臟炎癥會導致氧化/亞硝化應激和脂質過氧化,產生過量的活性氧和活性氮及醛類。作為對氧磷酶基因家族的一員,對氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)是一種在脂質代謝中起關鍵作用的酶,主要負責抗氧化防御[6]。已有研究表明,PON1基因或蛋白活性的改變,與肝細胞癌[7]、卵巢癌[8]、膀胱癌[9]以及肺癌[10]等多種疾病相關。本研究通過檢測90對肝癌及癌旁組織樣本中PON1 mRNA表達水平,并回顧性分析臨床病理資料及預后隨訪信息,以及在線數據庫數據,旨在評估PON1在HCC組織中的表達及其對臨床預后的意義,報道如下。

1 材料與方法

1.1 TIMER數據庫

TIMER2.0數據庫包括TCGA數據庫的32種癌癥類型的10 897個樣本(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)[11]。通過在線數據庫,分析PON1在多種腫瘤組織中的表達差異。

1.2 HCCDB數據庫

利用HCCDB數據庫分析PON1在肝癌和癌旁組織中的表達量,該數據庫包含來自GEO和TCGA的3 917個肝癌組織樣本 (http://lifeome.net/database/hccdb/home.html)[12]。

1.3 組織樣本

收集2011年4月至2015年6月在廣西醫科大學附屬腫瘤醫院手術的90例原發性肝癌患者(24～72歲)的癌組織及癌旁非癌肝組織(距離腫瘤邊緣>5 cm),并回顧性分析對應臨床病理資料及隨訪信息。納入標準:患者接受手術切除的治療方式,且組織病理學診斷為原發性HCC。排除標準:合并其他腫瘤組織和隨訪失敗的患者。標本的使用經醫院倫理委員會批準。

1.4 RT-qPCR

采用Trizol試劑(美國Invitrogen)提取肝癌與癌旁組織總RNA,PON1和內參GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列見表1,采用TaKaRa 公司的RT-qPCR 試劑。根據2-ΔΔCT方法計算PON1的mRNA表達水平,以中位數為界,將90例肝癌組織樣本分為高表達組(n=45)和低表達組(n=45),進行肝癌的預后分析。

表1 引物序列

1.5 Kaplan-Meier plotter

采用Kaplan-Meier plotter數據庫(http://kmplot.com/analysis/),對基于TCGA數據庫的369例HCC樣本分為高、低表達組,進行預后分析[13]。

1.6 COX回歸分析及預后列線圖的構建和驗證

通過單因素和多因素Cox回歸分析,確定PON1與臨床病理特征的相關性和對肝癌患者預測的獨立預后影響。選擇P值具有統計學意義的參數,預測HCC的1、2、3年生存的概率,采用R軟件的“survival”、“ggplot2”和“rms”包,構建肝癌患者的預后列線圖,并通過繪制1、2、3年生存率的校準曲線,以驗證模型預測能力的一致性。

1.7 PON1與免疫細胞浸潤的相關性分析

為了評估HCC中PON1的表達與免疫細胞浸潤之間的相關性,使用包含24種免疫細胞群豐度的“ssGSEA”算法分析免疫浸潤特征[14-15]。此外,采用了R軟件的“GSVA”、“ggplot”包,分析PON1高、低表達組間免疫細胞浸潤水平的差異。

1.8 統計學分析

應用SPSS 26.0、R 4.3.2對所收集數據進行統計學分析。非正態分布的數值資料以中位數(四分位數間距)表示。組間差異采用配對Mann-WhitneyU檢驗,相關性分析采用spearman相關性分析。采用Kaplan-Meier法計算生存率,GraphPad Prism 9.5.1軟件繪制生存曲線。單因素生存分析采用Log-rank檢驗,多因素生存分析采用Cox比例風險模型。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PON1在HCC及其他腫瘤中的mRNA表達水平

圖1A所示,TIMER數據庫中不同類型的腫瘤之間存在明顯的異質性。比較TIMER數據庫中HCC和對應的癌旁組織,PON1 mRNA在HCC中表達水平顯著低于癌旁組織。分析HCCDB數據庫中的10個數據集發現,PON1在HCC組織中的表達水平也顯著低于癌旁組織(圖1B)。qRT-PCR結果證實,與癌旁組織相比,90例肝癌組織中PON1的mRNA水平顯著下調(圖1C,P<0.001)。

圖1 PON1 在HCC中的mRNA表達水平 (A.TIMER數據庫中人PON1在不同腫瘤及癌旁正常組織中的表達水平;B.HCCDB數據庫中人PON1在HCC和癌旁正常組織中的表達水平;C.PON1在90對HCC及癌旁正常肝組織中的mRNA表達水平)

2.2 PON1 mRNA在HCC中表達水平與臨床病理參數的預后價值

Kaplan-Meier生存分析結果顯示,在PON1低表達的HCC患者中,總生存期顯著降低(圖2A,P<0.001)。同樣,在90對臨床組織樣本中,PON1表達水平越低,HCC患者的總生存期也顯著降低(HR=2.019;95%CI:1.041～3.916;P=0.038),表明PON1可能是一個潛在的HCC預后標志物(圖2B,P<0.05)。結合臨床病理參數的預后分析,發現BCLC分期、CNLC分期、T分期、微血管侵犯(MVI)數量、血管侵犯、血清AFP表達水平與HCC患者總生存期密切相關(圖2C-H,P<0.05)。具體結果見表2。

圖2 HCC組織樣本的預后生存分析[A.PON1高、低表達水平分組的總生存期的生存曲線(TCGA數據庫);B-H.PON1 mRNA水平、BCLC分期、CNLC分期、T分期、MVI數量、血管侵犯與血清AFP水平的總生存期的Kaplan-Meier生存曲線(n=90)]

表2 90例HCC患者的臨床病理參數資料

2.3 預后列線圖的構建和驗證

90例臨床肝癌患者預后影響因素的單因素分析表明,PON1 mRNA水平、BCLC分期、CNLC分期、T分期、MVI數量、血管侵犯、血清AFP水平與HCC預后相關性較強(圖3A,P<0.05)。多因素COX回歸分析顯示,BCLC分期(HR=5.309;95%CI:1.453～19.399)、血清AFP(HR=2.486;95%CI:1.166～5.299)和PON1(HR=3.157;95%CI,1.489～6.691)是影響HCC患者預后的獨立危險因素(圖3B,P<0.05)。聯合BCLC分期、血清AFP水平、PON1 mRNA水平三項指標,建立的預測HCC患者1、2、3年總生存率列線圖模型的C-index為0.757(95CI%:0.716～0.797)(圖3C)。圖3D所示,該模型在1、2、3年總生存率的校準曲線與理想曲線(斜率=1)擬合較好。

圖3 臨床樣本的Cox回歸分析與預后列線圖的構建和驗證(n=90)(A、B.單因素和多因素 Cox 回歸分析;C.聯合BCLC分期、血清AFP、PON1表達水平,用于1、2、3年總生存率預測的列線圖;D.用于1、2、3年總生存率預測的列線圖校準曲線)

2.4 HCC中PON1表達與免疫浸潤的相關性分析

對TCGA數據庫中HCC樣本的PON1表達與免疫細胞浸潤水平進行分析。結果顯示,PON1的表達與Treg細胞、淋巴毒性細胞、DC細胞、中性粒細胞、Th17細胞浸潤水平呈正相關,而與Th2細胞、T輔助細胞、CD56bright NK細胞、TFH細胞、效應記憶T細胞(Tem細胞)、活化的DC細胞、巨噬細胞浸潤水平呈負相關(圖4A,P<0.05)。對PON1高、低表達水平的分析結果顯示,低PON1表達的Treg細胞、DC細胞、中性粒細胞、Th17細胞的細胞豐度顯著下降,而Th2細胞、T輔助細胞、CD56bright NK細胞、TFH細胞、Tem細胞、活化的DC細胞的細胞豐度顯著上調(圖4B,P<0.05)。

圖4 PON1與免疫浸潤之間的相關性[A.免疫浸潤與PON1表達之間的相關性。Treg細胞、淋巴毒性細胞、DC細胞、中性粒細胞、Th17細胞浸潤水平與PON1呈正相關,Th2細胞、T輔助細胞、CD56bright NK細胞、TFH細胞、Tem細胞、活化的DC細胞、巨噬細胞浸潤水平與PON1呈負相關(P<0.05);B.低PON1表達組Th2細胞、T輔助細胞、CD56bright NK細胞、TFH細胞、Tem細胞、活化的DC細胞浸潤豐度顯著上調,而Treg細胞、DC細胞、中性粒細胞、Th17細胞浸潤豐度顯著下調]

3 討論

肝癌是一種由慢性炎癥引起的癌癥[5]。慢性炎癥會導致氧化/亞硝化應激和脂質過氧化反應,產生過量的氧化應激,參與肝損傷的發生和發展,被認為是急慢性肝臟疾病的病理生理基礎,與肝癌的發生密切相關[16]。PON1是一種由肝臟合成的水解芳香族羧酸酯、有機磷和碳酸鹽的酯酶,存在于血液和肝臟中,與高密度脂蛋白(HDL)結合,其主要功能是保護HDL及低密度脂蛋白(LDL)免受氧化修飾,起著抗氧化損傷的作用。研究發現,PON1可抑制單核細胞和巨噬細胞的黏附,減輕慢性炎癥[17]。

PON1在肝癌患者中異常低表達,可能是機體長期處于慢性炎癥及氧化應激狀態,利于癌細胞存活和增殖。本研究對PON1的mRNA在HCC中的表達及預后價值進行分析。結果表明,與癌旁組織相比,90例HCC患者中PON1 mRNA的表達水平降低,與HCC患者不良預后密切相關,與數據庫結果及文獻報道一致[8,18]。PON1的mRNA表達水平、BCLC分期及血清AFP是HCC患者預后的獨立危險因素,聯合三個指標建立的預后列線圖模型具有良好的預測性能及臨床實用價值。且PON1的表達與免疫浸潤水平密切相關,提示PON1可能在HCC的腫瘤免疫微環境中發揮重要作用。

腫瘤有著復雜的生態系統,而腫瘤微環境對腫瘤的進展有調節作用[19]。腫瘤微環境中,不止免疫細胞有富集程度的差異,其他組成成分和功能差異對癌癥發生發展也有著重大影響[20]。本研究結果表明,PON1的減少仍可能影響腫瘤細胞和免疫細胞的浸潤。PON1表達與多種免疫細胞豐度呈相關性。此外,T細胞耗竭的標志基因與PON1表達顯著相關。因此,PON1低表達可能參與調節HCC中免疫細胞浸潤,并且與HCC患者的預后不良密切相關。有研究表明,PON1參與腫瘤相關的炎癥調控,其抗炎活性依賴于與HDL的結合[21]。另外,PON1在體內外均能直接抑制巨噬細胞的炎癥反應[22]。然而,PON1在HCC免疫微環境中的具體作用機制還需進一步研究證實。

綜上所述,低表達的PON1可作為肝癌患者預后不良的潛在標志物,PON1聯合血清AFP水平、BCLC分期構建的預測模型,可以幫助醫生更好地為患者制定更科學、有效的治療方案。