POF1B在自然流產孕婦絨毛膜中的表達及其相關作用機制研究*

盛 叢,張 鑫,黃 慧,陳曼詩,何春容,范 濤△

[1.中山大學附屬第八醫院(深圳福田)婦產科,廣東深圳 518033;2.深圳市福田婦幼保健院婦科,廣東深圳 518045]

自然流產是指在妊娠28周內出現胚胎停育、生化妊娠及空孕囊等妊娠結局失敗的情況,是人類妊娠最常見的并發癥,發病率較高(10%～15%)[1-2]。近年來,隨著我國晚婚晚育人群的增多,高齡孕產婦的比例明顯增加,自然流產的發病率逐年升高,既往統計發現,自然流產患者出現反復性流產的概率較高,嚴重影響生育計劃及生活質量,還可導致出現抑郁、焦慮等負性情緒,給心理帶來負面影響[3-4]。因此分析其發病機制,對于自然流產高危孕婦給予早期預防及干預對改善妊娠結局具有重要意義。目前研究認為,自然流產病因復雜,其中遺傳因素、免疫因素及內分泌失調等均參與其發生[5-6]。POF1B是一種胞質蛋白,作為卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)的候選基因,其主要在極化上皮組織中表達,可通過干擾連接處F-肌動蛋白表達和誘導組織有絲分裂定向錯誤等參與纖毛發生、囊腫缺陷等病理學改變;還可通過人腸道Caco-2細胞中內源蛋白的shRNA表達調節肌動蛋白細胞骨架緊密連接情況。既往動物實驗發現,POF1B在成年小鼠卵巢中表達極低,可在產前小鼠卵巢中微量表達[7],POF1B是否參與自然流產的發生及發展,以及具體作用機制目前尚不完全明確。本研究旨在分析POF1B在自然流產孕婦絨毛膜中的表達及其相關作用機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2021年1月至2023年1月中山大學附屬第八醫院(深圳福田)收治的60例自然流產孕婦(自然流產組)的臨床資料。納入標準:(1)妊娠時間<12周,均為單胎妊娠,B超診斷出現自然流產;(2)婦產科門診就診;(3)孕婦及家屬知情,依從性良好,可配合檢查及治療,均簽署知情同意書。排除標準:(1)合并神經系統或精神方面疾病;(2)孕婦染色體異常診斷陽性;(3)子宮發育異常;(4)因弓形蟲等感染導致胚胎停育。同期收集行人工流產的孕婦60例為自然對照組,具有完整病例,均為單胎妊娠。自然流產組年齡(33.23±4.01)歲,BMI(23.27±2.06)kg/m2,孕齡(49.07±4.98)d。正常對照組年齡(32.80±3.78)歲,BMI(23.26±1.74)kg/m2,孕齡(49.25±5.82)d。兩組年齡、BMI及孕齡等臨床資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準(2021d082)。

1.2 方法

1.2.1ELISA檢測血清β-人絨毛膜促性腺激素(β-human chorionic gonadotropin,β-HCG)、孕酮、雌激素水平

采集兩組孕婦清晨空腹靜脈血,3 000 r/min離心10 min,于-80 ℃保存,避免反復凍融。ELISA檢測血清β-HCG、孕酮、雌激素水平。

1.2.2Western blot檢測相關蛋白表達

取孕婦血清、細胞及子宮絨毛膜樣本,加入十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)裂解液進行裂解,4 ℃ 3 000 r/min離心15 min,取沉淀物進行風干,加入四乙基溴化銨(tetraethyl ammonium bromide,TEAB)后4 ℃ 3 000 r/min離心15 min。采用二喹啉甲酸(diquinoline carboxylic acid,BCA)法檢測蛋白質濃度,制備SDS聚丙烯酰胺凝膠后混合沸水浴5 min,電泳后將蛋白轉印到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上,室溫下封閉液封閉1 h,與不同抗體按比例孵育,4 ℃搖床過夜,三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液及聚山梨酯-20(TBS with Tween-20,TBST)緩沖液清洗3次,每次10 min,暗室中增強型化學發光(enhanced chemiluminescence,ECL)超敏發光液孵育,室溫反應1～2 min,檢測各樣本中POF1B蛋白表達。

1.2.3細胞實驗

選擇人絨毛膜滋養層細胞HTR-8/Svneo于高糖型細胞培養基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)中進行培養、傳代。將HTR-8/Svneo細胞分為對照組及POF1B過表達組,POF1B過表達組采用過表達POF1B質粒構建pHS-AVC-1021慢病毒載體,對照組不予處理。(1)采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況:兩組細胞轉染48 h后去除培養基,磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer salt solution,PBS)清洗2次,制作細胞懸液,取100 μL細胞懸液轉移至5 mL培養管中,與5 μL膜聯蛋白-V-PE(Annexin-V-PE)/7-氨基放線菌素(7-aminoactinomycin,7-AAD)混合均勻后于暗室孵育15 min,加入400 μL混合緩沖液,流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。(2)采用細胞增殖檢測試劑盒(cell counting Kit-8,CCK-8)檢測細胞增殖情況:分別于細胞轉染0、12、24、48 h時加入適量CCK-8試劑,37 ℃環境下孵育2 h,采用酶標儀檢測HTR-8/Svneo細胞450 nm波長的吸光度值,計算兩組細胞的相對數量。(3)采用1.2.2方法檢測兩組細胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate protease 3,Caspase3)、Jun二聚化蛋白2(Jun dimerization protein 2,JDP2)、分泌性磷蛋白 1(secretory phosphoprotein 1,SPP1)的蛋白表達。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 兩組孕婦血清激素水平比較

自然流產組孕婦血清β-HCG、孕酮、雌激素水平明顯低于正常對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 兩組孕婦血清激素水平比較

2.2 兩組孕婦血清及絨毛膜POF1B蛋白表達比較

自然流產組孕婦血清及絨毛膜POF1B蛋白表達明顯高于正常對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表2。

表2 兩組孕婦血清及絨毛膜POF1B蛋白表達比較

2.3 相關性分析

Pearson相關性分析顯示,血清及絨毛膜POF1B與β-HCG、孕酮、雌激素均呈明顯負相關(P<0.05),見表3。

表3 血清及絨毛膜POF1B與激素的相關性分析

2.4 POF1B過表達對人絨毛膜滋養層細胞凋亡及Caspase3蛋白表達的影響

POF1B過表達組凋亡細胞比例、Caspase3蛋白表達明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表4、圖1。

圖1 Western blot檢測Caspase3蛋白表達情況

表4 兩組細胞凋亡及Caspase3蛋白表達情況

2.5 POF1B過表達對人絨毛膜滋養層細胞增殖的影響

0 h時,兩組細胞的相對數量比較差異無統計學意義(P>0.05)。12、24、48 h時,POF1B過表達組細胞的相對數量明顯少于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表5。

表5 兩組細胞相對數量比較

2.6 POF1B過表達影響人絨毛膜滋養層細胞生物學行為的相關機制分析

POF1B過表達組細胞JDP2、SPP1蛋白表達明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),見表6、圖2。

圖2 Western blot檢測JDP2、SPP1蛋白表達情況

表6 兩組細胞JDP2、SPP1蛋白表達比較

3 討 論

自然流產是妊娠結局失敗較為常見的類型,是婦產科尚未解決的問題[8-9]。目前自然流產發生機制尚不明確,但多數研究認為自然流產的發生與內分泌、遺傳、免疫、凝血、感染等多因素密切相關,相關調控基因可參與自然流產的發生[10-11]。劉彩等[12]研究認為,子宮蛻膜組織中免疫調控蛋白FOXO3的高表達可提高脾臟CD4+CD25+T細胞比例,調節小鼠的免疫平衡,從而能降低胚胎吸收率,減少自然流產發生風險。此外,非特異性基因、非編碼RNA的表達也可能參與自然流產的發生。

POF1B是位于性染色體的基因之一,POF1B主要在極化上皮組織中表達,POF1B的異常表達與皮膚鱗狀細胞癌、肺腺癌等惡性腫瘤的發生、發展過程密切相關,可能成為潛在的治療靶點或生物標志物。原發性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency,POI)是由卵巢中的卵泡耗盡決定的,這會導致40歲之前的不孕癥,具有很強的家族性和異質性遺傳背景。既往研究發現,POF1B基因與綜合征性POI有關,可能參與卵巢發育和卵母細胞減數分裂/DNA修復途徑等[13]。YUAN等[14]研究認為,POF1B與POF存在一定聯系。本研究顯示,自然流產組孕婦血清及絨毛膜POF1B蛋白表達明顯高于正常對照組,說明POF1B的異常表達與自然流產存在一定聯系。激素是內分泌細胞合成并分泌進入血液循環的化學信息物質,妊娠相關激素水平變化與維持妊娠過程及自然流產的發生、發展密切相關[15-16]。Pearson相關性分析顯示,血清、絨毛膜POF1B與β-HCG、孕酮、雌激素均呈明顯負相關。說明POF1B與妊娠相關激素水平變化密切相關,可能協同或相互介導參與自然流產的發生。

早期研究認為,細胞增殖、遷移及凋亡均在胚胎發育階段發揮重要作用,其中胎盤滋養細胞增殖、凋亡的動態平衡決定著胎盤發育及胎兒生長情況,若動態平衡被打破可出現流產情況[17-18]。POF1B是目前發現僅存在脊椎動物表達的新型基因,可介導POI及POF的發生。本研究進行細胞實驗發現,POF1B過表達組凋亡細胞比例明顯高于對照組。12、24、48 h時,POF1B過表達組細胞的相對數量明顯低于對照組。說明POF1B可介導胎盤滋養細胞增殖、凋亡的平衡紊亂導致自然流產的發生。SPP1是一種子宮內膜蛋白,可通過介導局限性粘連的組裝決定子宮內膜的容受性[19-20],早期研究發現,SPP1可通過調控巨噬細胞功能參與不明原因反復流產的發生[21-22]。烏吉斯古楞等[23]研究認為,SPP1可通過介導周期素D1、P-糖蛋白、細胞色素c依賴性半胱氨酸蛋白酶3等參與胰腺癌細胞增殖、細胞周期及凋亡等生物學行為改變。JDP2是一種廣泛分布于小腦、睪丸、肺等器官的蛋白,可調控細胞增殖、凋亡等行為[24-25],既往研究發現,過表達JDP2可進一步促進創傷性腦損傷誘導的炎癥、細胞凋亡和Caspase3激活,JDP2 敲除通過阻斷Caspase3激活,在體內和體外有效減輕創傷性腦損傷[26]。本研究發現,POF1B過表達組細胞JDP2、SPP1、Caspase3蛋白表達均明顯高于對照組。說明POF1B可通過介導JDP2/SPP1調控凋亡蛋白的表達參與滋養層細胞的凋亡及增殖過程,POF1B可能是參與自然流產的新型基因。

綜上所述,POF1B在自然流產孕婦血清及絨毛膜中高表達,與孕婦相關激素呈負相關,可參與人絨毛膜滋養層細胞增殖、凋亡等生物學行為,其機制可能與POF1B調控JDP2、SPP1蛋白表達有關。但由于本研究時間較短,尚未分析POF1B是否存在參與自然流產的多途徑調控方式,未來將擴大實驗對象、增加實驗時間以此方向進行深入探究,為早期預測自然流產的發生并指導預防治療提供一種新思路。