糞便差異菌群、代謝物聯合彌散張量成像對早產兒腦白質損傷的診斷價值*

劉 玲,羅 晗,李銀珊,李承燕,敖 當,林少珠

(廣東醫科大學附屬醫院兒科,廣東湛江 524000)

由于新生兒重癥監護病房的技術不斷提高,早產兒數目每年都在不斷增加,存活的早產兒患彌漫性腦白質損傷(white matter injury,WMI)和神經發育不良的風險較高[1]。WMI是早產兒腦損傷的主要表現形式,多發生在胎齡<32周白質發育未成熟的早產兒,是造成慢性神經系統發育不良的主要原因[2-3]。WMI可引起腦性癱瘓、癲癇、認知障礙、語言及視覺障礙[4-5]。

彌散張量成像(diffusion tensor imaging,DTI)是一種新的MRI成像技術,能夠可視化白質結構,評估白質纖維髓鞘化程度,對大腦皮層的微觀結構變化更敏感[6]。對于早產兒WMI來說,DTI是目前唯一可用于研究白質纖維的無創技術。本課題組前期研究也發現,DTI能夠早期量化早產兒的WMI,即FA值的降低和ADC值的升高能反映神經纖維束的發育和WMI的程度。

腸道菌群的平衡是維持腸道功能和機體穩態的關鍵,腸道菌群與宿主之間的相互作用是當前的熱點。然而,腸道菌群的組成和多樣性是不穩定的,極易受到食物、生活環境、藥物、疾病,尤其是抗生素的影響[7]。微生物-腸-腦軸在神經系統疾病中起著至關重要的作用。

目前,MRI及超聲可檢測的非囊性WMI的比例較低,輕、中度WMI患兒的早期診斷仍是一大挑戰,與WMI相關的潛在的微生物學標志物尚未被確定。本研究旨在使用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線探討糞便腸道菌群、LC-MS/MS代謝組學及DTI聯合診斷WMI的靈敏度和特異度,尋找診斷WMI的生物學標志物,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2022年4—12月本院收治的71例早產兒為研究對象。納入標準:(1)出生胎齡<32周;(2)出生體重<1 500 g;(3)入院日齡≤24 h;(4)家屬簽署知情同意書。排除標準:(1)死亡;(2)住院期間因故未能完成頭顱MRI+DTI檢查;(3)合并先天性染色體異常或遺傳代謝病者;(4)先天性大腦畸形;(5)各種原因造成圖像不能分析;(6)已使用微生態制劑。本研究經醫院機構審查倫理委員會批準(PJ2021-097)。

1.2 方法

1.2.1糞便收集與保存

分別采集研究對象出生后24 h內及出生后14、28 d糞便標本,取標本時使用無菌棉拭子從糞便的3個不同位置采集,每管約0.2 g(黃豆大小),貯存于-80 ℃冰箱保存至送檢。

1.2.2DNA提取、PCR擴增及Illumina Miseq測序

根據E.Z.N.A.?soil DNA kit(美國Omega Bio-tek公司)說明書進行微生物群落總基因組DNA抽提,使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因組DNA的質量,使用NanoDrop2000(美國Thermo Scientific公司)測定DNA濃度和純度。以上述提取的DNA為模板,使用攜帶Barcode序列的上游引物338(正向:5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和下游引物806(反向:5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′)[8]對16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

瑪麗的“本我”和“超我”正是處于這樣一種博弈的循環中，“本我”已經千瘡百孔，“超我”又是面目全非。正是因為瑪麗那無處發泄的“本我”，“超我”處于極度的崩潰狀態。

1.2.3高通量測序數據分析

使用CCA分析臨床指標對腸道菌群結構的影響,采用ROC曲線分析診斷效能。

1.2.4LC-MS/MS分析

使用超高效液相色譜串聯傅里葉變換質譜UHPLC-Q Exactive HF-X系統(美國Thermo Scientific公司),預處理后的數據上傳美吉生物云平臺(https://cloud.majorbio.com)進行數據分析。

1.2.5MRI+DTI檢查及圖像處理

MRI檢查采用3.0T磁共振成像儀(美國GE公司)掃描對所有研究對象頭部實施MRI掃描。常規MRI掃描序列包括:T1WI軸位(TR 2 849 ms/TE 30 ms)及矢狀位(TR 3 266 ms/TE 38 ms)、T2WI(TR 5 454 ms/TE 92 ms)及T2WI FLAIR(TR 8 500 ms/TE 90 ms)軸位成像。軸位掃描序列均以聽眥線為掃描基線,層厚為5 mm,層間距為1 mm,FOV=20×20。矢狀位掃描層厚5.0 mm,層間距0.5 mm,FOV=20×20;DWI及DTI掃描采用單次激發平面回波成像(EPI)序列,DWI掃描b值為0,1 000 s/mm2,FOV=20×20;DTI掃描b值為1 000 s/mm2,TR 3 000 ms/TE minimum,層厚5.0 mm,層間距1.0 mm,FOV=20×20,彌散梯度方向采用非同一直線上的25個方向。

利用FLnctool功能軟件(美國GE公司)對DTI原始彌散圖像進行后處理得到彩色FA圖。感興趣區(region of interest,ROI)在T2WI上選定,測量的8個ROI區域分別為額葉白質、頂葉白質、枕葉白質、側腦室旁白質、內囊前肢、內囊后肢、胼胝體膝部、胼胝體壓部。

1.2.6影像學結果分析

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 各組一般資料比較

各組一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 各組ADC和FA值比較

輕度WMI組胼胝體壓部ADC值較非WMI組升高,中重度WMI組枕葉白質、腦室旁白質、胼胝體膝部和壓部ADC值較非WMI組升高(P<0.05)。輕度WMI組額葉白質、胼胝體壓部FA值較中重度WMI組升高,中重度WMI組額葉白質、內囊后肢、胼胝體壓部FA值較非WMI組降低(P<0.05),見圖1。

A:輕度WMI組、中重度WMI組與非WMI組各ROI的ADC值比較;B:輕度WMI組、中重度WMI組與非WMI組各ROI的FA值比較;①:額葉白質;②:頂葉白質;③:枕葉白質;④:腦室旁白質;⑤:胼胝體膝部;⑥:內囊前肢;⑦:內囊后肢;⑧:胼胝體壓部;a:P<0.05。

2.3 DTI值和腸道菌群結構的相關性

CCA分析結果顯示,頂葉白質、枕葉白質及胼胝體壓部的ADC值與菌群結構相關(P<0.05),其中胼胝體壓部ADC值的r2值最大(r2=0.230 2,P=0.001),胼胝體壓部與菌群結構相關性較大。此外,額葉白質、枕葉白質、胼胝體膝部和壓部的FA值與菌群結構相關,其中枕葉白質的FA值r2值最大(r2=0.291 0,P=0.001),見圖2。

A:枕葉白質和胼胝體壓部的ADC值明顯影響腸道菌群組成;B:枕葉白質、頂葉白質及內囊前肢FA值明顯影響腸道菌群組成。

2.4 腸道菌群對WMI的診斷價值分析

屬水平診斷WMI的曲線下面積(area under the curve,AUC)為0.88(95%CI:0.74～<1.00)。每個變量的貢獻用變量的重要性得分來表示,葡萄球菌屬(g_Staphylococcus)的得分最高,達5.692 56分,見圖3。

A:ROC曲線(屬水平);B:物種重要性排序圖。

2.5 差異代謝物對WMI的預測能力

ROC曲線分析結果顯示,在區分WMI與非WMI時,幾種代謝物具有高靈敏度和特異度,WMI組和非WMI組AUC前3的代謝物分別是7-Methylhypoxanthine、Gly Gly Leu和2-Aminobenzylstatine。WMI1和非WMI1差異代謝物集診斷WMI的AUC為0.98(95%CI:0.96～0.99),見圖4。

A:AUC最高的前3個代謝物的ROC曲線;B:WMI1 vs. 非WMI1代謝物集的ROC曲線。

2.6 差異菌群、代謝物及DTI聯合對診斷WMI的預測能力

ROC曲線分析結果顯示,在區分WMI與非WMI時,側腦室旁白質和胼胝體壓部FA值診斷WMI的AUC為0.74(95%CI:0.56～0.92)。差異菌群和代謝物指標聯合診斷WMI的AUC為0.94(95%CI:0.86～<1.00)。差異菌群、代謝物聯合FA值診斷WMI的AUC為0.98(95%CI:0.93～<1.00)。每個變量的貢獻用變量的重要性得分來表示,Cholic Acid的得分最高,為5.453分,N-Docosahexaenoyl Cysteine得分為5.166分,g_Staphylococcus得分為5.159,見圖5。

A:指標重要性排序圖;B:FA值診斷WMI的ROC曲線;C:差異菌群、代謝物聯合診斷WMI的ROC曲線;D:差異菌群、代謝物和FA值聯合診斷WMI的ROC曲線。

3 討 論

腸道菌群的作用受得越來越多的關注,腸道菌群失調與糖尿病、代謝綜合征、非酒精性脂肪性肝病等代謝疾病,甚至與阿爾茨海默病、抑郁癥等神經精神疾病有關[10-11]。WMI是與早產相關的常見并發癥之一,是迄今為止早產兒腦損傷最常見的類型,50%以上發生在極低出生體重兒[12-13],然而目前WMI的早期診斷仍有挑戰。本研究評估使用糞便16S rRNA基因測序、代謝組學及DTI聯合指標對診斷WMI的預測能力。

腸道菌群多樣性的減少及腸道微生物種類、數量、比例和位置的改變被稱為菌群失調,在多種疾病的發病機制中起著重要作用[14-15]。早產兒腸道中潛在致病菌的定植增加,會使菌群多樣性減少[16]。在過去的十年里,越來越多的學者認識到腸道菌群對大腦功能的重要性及其在神經系統疾病中的作用,甚至可能作為影響大腦發育的生物學標志物[17-18]。有研究發現,克雷伯桿菌屬在腸道的過度生長可高度預測腦損傷[19]。本研究在屬水平物種重要性得分排序中,葡萄球菌屬得分最高,可能是WMI早期診斷的潛在微生物。葡萄球菌屬作為潛在有害的腸道細菌,ZHANG等[20]研究發現其豐度與血清總膽紅素水平呈正相關。YOU等[14]研究發現,創傷性腦損傷引起腸道菌群失調后會改變膽汁酸分布而導致胃腸功能障礙,而葡萄球菌屬可能是導致膽汁酸代謝變化的主要菌群。

本研究通過ROC曲線分析發現可能的生物標志物,從而將WMI糞便標本與非WMI組標本區分開來,結果顯示,7-Methylhypoxanthine、Gly Gly Leu和2-Aminobenzylstatine可作為診斷WMI的高靈敏度和高特異度的代謝物。7-Methylhypoxanthine屬于嘌呤和嘌呤衍生物,2-Aminobenzylstatine屬于羧酸及其衍生物,二者在WMI組水平降低。Cholic Acid屬于膽汁酸、醇及其衍生物,參與初級膽汁酸生物合成[21]。葡萄球菌屬可能通過下調Cholic Acid和Allocholic Acid等代謝物,影響膽汁酸生物合成,從而引起WMI。然而,這些代謝物對大腦發育的影響尚未見公開報道,其功能需要進一步的研究探討。

DTI是目前唯一量化早產兒腦白質發育和損傷的方法,它可以識別MRI無法篩查的損傷[22]。本研究發現,在WMI組中,腦髓鞘形成延遲,尤其以側腦室旁白質和胼胝體壓部表現最明顯,二者ADC值增高及FA值降低可能是早產兒發生WMI的早期重要標志。本研究還發現,早產兒WMI的發生率為32.3%,中重度WMI的發生率為15.4%,這與GANO等[23]的研究一致,但本研究早產兒胎齡和出生體重更小。

本研究選取的ROI為雙側額部白質、頂葉白質、枕葉白質、側腦室旁白質、內囊前后肢、胼胝體膝部和壓部,包括外周白質和深部白質,這些區域是WMI最常見的位置。胼胝體和內囊位于腦組織中心和深部白質,額葉、頂葉和枕葉白質分別位于周圍腦組織的前、中、后,分析上述ROI影像學變化,可以初步了解早產兒白質結構的整體特征。FA值由神經纖維密度、含水量、髓鞘形成和纖維一致性來決定,多項研究發現,早產兒低FA值和神經系統發育異常有關[13,24]。本研究發現,根據胼胝體壓部的ADC值和FA值,可以很好地判斷新生兒WMI及損傷的程度。連接左右大腦皮層并高度整合高級運動中心和認知功能的胼胝體,一旦被破壞,就會導致雙側大腦半球連接斷開。MALAVOLTI等[25]研究發現,當校正年齡為18個月時,胼胝體FA值降低與運動發育延遲有關。GANO等[23]研究發現,內囊損傷可導致定向障礙、構音障礙、記憶障礙、語言障礙、行為改變等。中重度WMI組內囊后肢的FA值較非WMI組明顯降低。

綜上所述,本研究首次將早產兒的腸道菌群、代謝物和腦白質結構相結合,并探討這些因素對WMI的診斷價值,結果擴展了現有的關于微生物-腸-腦軸的知識,表明特征性腸道菌群、差異代謝物和DTI在很大程度上有助于區分WMI和非WMI,可以作為診斷和治療的潛在靶點。但本研究仍有局限性:(1)相對較小的樣本量,未來需要擴大樣本量;(2)因為不可控力因素影響,研究對象出院后無法順利完成隨訪;(3)本研究是單中心研究,這些發現可能不適用于其他地區,需要前瞻性、多中心研究來驗證該結論。