脂肪組織保存條件對體外分離培養人脂肪間充質干細胞的影響*

梁坤榮,王 慧,顧恩妍,吳振奇,石 峰,靳麗艷,張 蕊,于婷婷,王艷超,薛冰華△

(1.北京吉源生物科技有限公司技術部,北京 101300;2.北京翰潔吉源醫院有限公司外科,北京 101300)

1966年,FRIEDENSTEIN等從骨髓中發現了一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的細胞稱之為間充質干細胞[1],可來源于除骨髓外的多種組織[2]。脂肪間充質干細胞(adipose derived mesenchymal stem cells,ADMSC)來源于脂肪組織,具有來源部位多、取材容易、擴增能力強、細胞因子分泌種類多等優勢[3-6]。ADMSC的優勢使其在整形醫學[7-10]、臨床醫學[11-14]、再生醫學[15-18]等方面均受到了研究者的青睞,同時也成為一種主要的細胞治療藥物的種子細胞[19-20]。ADMSC有多種提取方法[21-23],包括酶消化法、組織塊貼壁法、酶消化法結合組織塊貼壁法、懸浮培養法及機械分離方法(渦旋離心法、吸附柱法、超聲處理法)等。本研究采用酶消化法進行脂肪組織分離純化,旨在探討抗生素、脂肪組織保存時間和保存溫度、培養基等對體外分離培養人ADMSC的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞

腹部皮下脂肪組織由北京翰潔吉源醫院在征得志愿者同意并簽署知情同意書的情況下采集,所有志愿者健康狀況良好,無系統性疾病和傳染性疾病,每次采集約100 cm3。本研究已通過北京翰潔吉源醫院倫理委員會,審查意見號:(2021)臨倫審第(235)號。采集的脂肪組織僅用于科學研究,全部實驗人員始終保持嚴謹、實事求是的科學態度。

1.1.2試劑與儀器

α-MEM基礎培養基(C3060-0500,上海龍田生物技術有限公司),α-MEM基礎培養基(C12571500BT,美國Gibco公司),5%血小板裂解液(PL-NH-500,美國Sexton公司),慶大霉素(宜昌人福藥業有限責任公司),Tryple(12604-021,美國Gibco公司),胰蛋白酶(0458-25G,北京經科宏達生物技術有限公司),Ⅰ型膠原酶(V900891-1G,美國Sigma公司),CD73-PE(550257,美國BD公司),CD90-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC,5555985,美國eBioscience公司),CD105-PE(560839,美國eBioscience公司),CD34-PerCP(29103,美國BD公司),CD45-ECD(A07785,美國BD公司),人類白細胞抗原(human leukocyte antigen,HLA)-DR-APC(2350758,美國eBioscience公司),CD14-FITC(555397,美國BD公司),CD79a-APC(551134,美國BD公司),3-利福定-1-1甲基黃嘌呤(3-Isobuty-1-1-Methylxanthine,IBMX),地塞米松,吲哚美辛,各種細胞培養皿和孔板,流式細胞儀(AFC2,美國Thermo公司),恒溫培養振蕩器(ZWY-100H,上海智城分析儀器制造有限公司),細胞計數儀(CountessⅡ,美國Invitrogen公司),倒置顯微鏡[AE2000,麥克奧迪(廈門)醫療診斷系統有限公司]。干細胞無血清培養基:含95% α-MEM和5%血小板裂解物。脂肪組織消化液:含80%胰蛋白酶(儲存濃度0.25%)和20% Ⅰ型膠原酶(儲存濃度1%)。

1.2 方法

1.2.1ADMSC分離培養及傳代

原代ADMSC分離培養:取不同實驗條件的脂肪組織,在超凈工作臺中將脂肪組織與0.9%生理鹽水按照1∶4的體積比混合并置于適宜容器內顛倒混勻,充分清洗含有膨脹液和血水的脂肪組織,500×g離心5 min,重復2次。脂肪組織轉移至新的離心管中,加入脂肪組織消化液(脂肪組織∶脂肪組織消化液體積比為1∶1),充分混勻后置于37 ℃、230 r/min的恒溫搖床振蕩消化30 min。加入上一步消化液總體積3倍的干細胞無血清培養基終止消化,500×g離心8 min。棄上清液,收集底部細胞,將細胞轉移至新的離心管中,加生理鹽水補足最大離心體積,500×g離心5 min,此步驟重復1次,去除油脂。棄上清液,加入干細胞無血清培養基重懸,將脂肪原液按0.18 mL/cm2的密度接種于培養皿中,置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養。

原代ADMSC換液培養:分離得到的原代ADMSC培養24 h后細胞開始貼壁,觀察細胞狀態,3～4 d后全量吸棄原代ADMSC培養液,加入等量新鮮干細胞無血清培養基,去除紅細胞,在倒置顯微鏡下對不同實驗條件下的細胞進行拍照。

原代ADMSC傳代:當原代ADMSC融合度至90%時,進行細胞傳代,生理鹽水清洗兩遍,加入0.01 mL/cm2稀釋后的Tryple(生理鹽水∶Tryple體積比為1∶1),并使之均勻浸潤全部細胞,1 min后顯微鏡下觀察細胞,加入3倍消化液體積的生理鹽水終止消化,收集細胞至離心管內,充分混勻后取100 μL到EP管中計數并計算活率(細胞懸液∶臺盼藍體積比為1∶1),其余細胞500×g離心5 min,棄上清液,加入干細胞無血清培養基重懸,按1×104/cm2進行傳代。

1.2.2脂肪組織添加抗生素對體外分離培養人ADMSC的影響

因脂肪組織在采集和運輸過程中很難做到完全無菌狀態,故抗生素的加入有利于抑制細菌的增殖,這為后續無菌培養奠定基礎,但抗生素的添加又可能影響細胞的活性。因此本實驗對比抽脂時膨脹液中加入慶大霉素(8萬單位/1 L膨脹液)和不加慶大霉素對脂肪組織分離ADMSC的影響,具體操作同上。

1.2.3脂肪組織保存時間對體外分離培養人ADMSC的影響

將志愿者脂肪組織標本平均分成6份,分別保存0、1、2、3、5、7 d進行分離培養,記錄傳代時間及細胞收獲量。

1.2.4脂肪組織保存溫度對體外分離培養人ADMSC的影響

將志愿者脂肪組織標本平均分成3份,分別于2～8 ℃、室溫(22 ℃)、37 ℃保存,分離培養,記錄傳代時間及細胞收獲量。

1.2.5培養基對體外分離培養人ADMSC的影響

分離后的脂肪,分別用不含核苷和含核苷的培養基進行培養,記錄傳代時間及細胞收獲量。

1.2.6流式細胞術分析細胞表型

收集第5代ADMSC,利用流式細胞術[24-25]檢測ADMSC表面標志物CD73+、CD90+、CD105+、CD34-、CD45-、HLA-DR-、CD14-、CD79a-。流程如下:取待測單細胞懸液,離心后用磷酸鹽緩沖液調整密度為1×106/100 μL;將標記抗體加入試管底部,充分混勻;室溫避光孵育20 min。向管中加入1 mL生理鹽水,混勻后300×g離心5 min,棄上清液,重復洗滌2次。棄上清液,用500 μL生理鹽水重懸細胞,混勻后上機分析。

1.2.7定向誘導成脂分化

將生長狀態良好的第5代ADMSC消化、重懸,調整細胞濃度,將1.5×105/孔細胞接入6孔板,融合度長至70%～80%時,換ADMSC成脂誘導培養基(DMEM+10%胎牛血清+IBMX 0.5 mmol/L+地塞米松1 μmol/L+吲哚美辛200 μmol/L+胰島素10 μg/mL),2～3 d換液,對照組用干細胞無血清培養基進行培養,當誘導組培養至鏡下可以看到脂滴,吸除培養基,用磷酸鹽緩沖液清洗2次,4%多聚甲醛固定30 min,油紅O染色10 min,磷酸鹽緩沖液洗去多余染料,拍照。

1.2.8定向誘導成骨分化

將生長狀態良好的第5代ADMSC消化、重懸,調整細胞濃度,將1.5×105/孔細胞接入6孔板,融合度長至70%～80%時,換ADMSC成骨誘導培養基[26],2～3 d換液,對照組用干細胞無血清培養基進行培養,當誘導組培養至鏡下可以看到結節,吸除培養基,用磷酸鹽緩沖液清洗2次,4%多聚甲醛固定30 min,茜素紅染色10 min,磷酸鹽緩沖液洗去多余染料,拍照。

2 結 果

2.1 ADMSC形態

原代ADMSC接種24 h后,鏡下可見少數貼壁細胞為大而扁平的單層細胞,有的細胞細長,似成纖維細胞。48 h后大多數細胞貼壁,并開始伸展、分裂,呈梭形且有粗大突起,見圖1。接種ADMSC后培養5～9 d,細胞逐漸分裂、匯合成單層,成簇分布,傳代后細胞呈梭形,見圖2。

圖1 原代ADMSC培養48 h貼壁狀態(40×)

圖2 ADMSC傳代后培養72 h貼壁狀態(40×)

2.2 脂肪組織添加抗生素對體外分離培養人ADMSC的影響

通過對10個志愿者的數據進行統計,抽脂時膨脹液中不添加慶大霉素,分離得到的原代ADMSC初次傳代時間為接種后5～6 d;添加慶大霉素后,原代ADMSC增殖明顯緩慢,無典型間充質干細胞形態,初次傳代時間為接種后9～10 d,見表1、圖3。因此,后續實驗脂肪組織膨脹液中不再添加慶大霉素。

表1 抗生素對體外分離培養人ADMSC的影響

圖3 抗生素對體外分離培養人ADMSC的影響(40×)

2.3 脂肪組織保存時間對體外分離培養人ADMSC的影響

通過對10個志愿者的數據進行統計,保存0 d的脂肪組織分離得到的原代ADMSC呈梭形,初次傳代時間為5 d。保存1～2 d的脂肪組織分離得到的原代ADMSC呈梭形,初次傳代時間為6 d。保存3 d的脂肪組織分離得到的原代ADMSC不規則形態細胞變多,生長緩慢,初次傳代時間為接種后7 d。保存5 d的脂肪組織分離得到的原代ADMSC數量明顯減少,初次傳代時間為接種后9 d。保存7 d的脂肪組織無法分離得到原代ADMSC,見表2、圖4。

表2 保存時間對體外分離培養人ADMSC的影響

圖4 脂肪組織不同保存時間分離的ADMSC培養3 d的生長狀態(40×)

2.4 脂肪組織保存溫度對體外分離培養人ADMSC的影響

通過對10個志愿者的數據進行統計,在2～8 ℃、室溫、37 ℃保存下的ADMSC均培養到6 d進行傳代,結果顯示,2～8 ℃保存下的ADMSC生長狀態最佳,融合度約95%,室溫保存下的ADMSC融合度約90%,37 ℃保存下的ADMSC融合度約85%,見表3、圖5。

表3 保存溫度對體外分離培養人ADMSC的影響

圖5 不同溫度下保存的ADMSC傳代時的融合度(40×)

2.5 培養基對體外分離培養人ADMSC的影響

通過對6個志愿者的數據進行統計,在原代ADMSC分離培養時,用含核苷的α-MEM培養基,培養3 d有少量梭形細胞爬出,培養5 d可以進行傳代。用不含核苷的α-MEM培養基,培養4 d有少量梭形細胞爬出,培養7 d可以進行傳代,見表4。

表4 不同培養基對體外分離培養人ADMSC的影響

2.6 流式細胞術分析細胞表型

通過對10個志愿者的數據進行統計,流式細胞術檢測ADMSC表面標志物,高表達CD73[(99.5±0.1)%]、CD90[(99.7±0.2)%]、CD105[(97.8±0.3)%],低表達CD34[(0.8±0.2)%]、CD45[(0.6±0.2)%]、HLA-DR[(0.12±0.02)%]、CD14[(1.4±0.2)%]、CD79a[(0.6±0.2)%],見圖6。

圖6 流式細胞術分析細胞表型結果

2.7 成骨、成脂誘導分化

成脂誘導:油紅O染色陽性,細胞質內可見大量脂滴被染成橘紅色,而對照呈陰性結果,見圖7。成骨誘導:茜素紅染色陽性,提示鈣結節形成,而對照呈陰性結果,見圖8。

A:40×;B:100×。

圖8 ADMSC成骨誘導茜素紅染色(40×)

3 討 論

張云巍等[27]通過實驗發現,人ADMSC在脂肪組織中的含量與年齡的增長并無嚴格的相關性,且其體外擴增培養的形態學特征、生長周期也無明顯差異。因此本實驗對其他影響因素進行探究。

脂肪采集手術過程中向每升膨脹液中加入8萬單位慶大霉素,雖然可在一定程度上防止標本污染,但脂肪組織在后期生長中,細胞貼壁時間過長且狀態較差,影響細胞增殖。慶大霉素是氨基糖苷類抗生素,主要通過抑制細菌蛋白質的合成而起到抗菌作用,可能也會抑制ADMSC蛋白質合成,雖然能夠在一定程度上避免污染,但會嚴重影響脂肪組織活性從而導致培養、增殖的速度變慢,細胞存活率降低。

本研究保存溫度實驗結果顯示,溫度升高,細胞的生長速度就減慢。從兩個方面來考慮溫度對脂肪活性的影響,一個是油脂的氧化速度逐漸升高,另一個是油脂中溶解的氧氣含量降低,所以2～8 ℃下細胞貼壁、增殖、存活率更趨于穩定。保存時間延長,脂肪組織氧化的程度就加重,所以脂肪保存時間不宜超過72 h。

核苷具有提供能量,促進細胞生長、增強細胞活性,同時也參與DNA和RNA的合成,構成細胞基因組,所以核苷在ADMSC的原代分離、傳代培養中起到重要作用。脂肪組織活性是ADMSC分離培養過程中最為關注的問題,而脂肪組織的保存時間、保存溫度是影響脂肪組織活性的主要因素。

綜上所述,使用抗生素、長時間、高溫度保存會抑制ADMSC增殖,而核苷可促進其增殖,本實驗為今后以ADMSC為目標的細胞治療藥學研究奠定了基礎。