MEBT/MEBO對糖尿病大鼠創面中CaN/NFAT信號通路表達的影響*

葛星月,楊雅量,李文武,竺仕林,姚明哲,唐乾利

(右江民族醫學院研究生學院,廣西百色 533000)

隨著糖尿病患者數量的不斷增加,糖尿病潰瘍的發病率也逐年上升,現已成為潰瘍患者中僅次于手術后未愈合潰瘍的主要原因[1]。由燒傷濕潤暴露療法(moist exposed burn therapy,MEBT)和濕潤燒傷膏(moist exposed burn ointment,MEBO)組成的皮膚再生醫療技術(MEBT/MEBO),被首先應用于燒傷創面,后延伸應用于糖尿病潰瘍創面,其在創面形成早期可無損傷性地保護治療創面、液化排除壞死組織及促進皮膚再生修復,對臨床糖尿病創面產生巨大的修復治療作用[2-3]。目前發現MEBT/MEBO可能是通過干預磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、Wnt/β-連環蛋白(β-catenin)、轉化生長因子-β1(TGF-β1)/Smad、核因子-κB(NF-κB)和PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)等信號通路的表達,影響內皮祖細胞、成纖維細胞、上皮細胞的增殖、遷移,促進血管及肉芽組織的新生,從而參與創面愈合的調控[3]。

活化T細胞核因子(nuclear factor of activated T cells,NFAT)是鈣調神經磷酸酶(calcineurin,CaN)信號通路的下游效應因子[4],可結合白細胞介素-2(interleukin-2,IL-2)啟動子激活T細胞[5]。CaN/NFAT通路在免疫系統、神經系統及心血管系統疾病治療機制的研究較多[6-8],而在創面愈合中的作用尚未明確。本研究通過構建糖尿病大鼠創面模型,運用蘇木精-伊紅(HE)染色、免疫熒光染色和實時熒光定量逆轉錄PCR(RT-qPCR)技術,探討MEBT/MEBO對CaN/NFAT信號通路的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

48只健康8周齡無特定病原體(SPF)級Wistar 雄性大鼠,重量220～250 g,購自長沙天勤公司[許可證號SCXK(湘)2019-0013],分籠喂養于SPF級實驗室,每籠4只,給予充足的高壓滅菌食物和飲用水,每天12 h光照時間,適應性喂養1周后用于后續實驗。

動物實驗經右江民族醫學院倫理委員會批準(2022052701),飼養條件符合SPF實驗標準,實驗過程及各項操作均符合動物實驗倫理審查要求。

1.1.2主要儀器與試劑

濕潤燒傷膏(美寶):汕頭市美寶制藥有限公司生產,批號2101603A;重組牛堿性成纖維細胞生長因子凝膠(貝復新):珠海億勝生物制藥有限公司生產,批號042302A06;Cy3標記驢抗兔二抗、RNA提取液、SYBR Green、枸櫞酸緩沖修復液:武漢賽維爾生物科技有限公司生產,貨號GB21403、G3013、G3326、G1201;鏈脲佐菌素(Streptozotocin,STZ)、抗熒光淬滅封片劑(含DAPI):北京索萊寶公司生產,貨號S8050、S2110;NFAT、CaN、IL-2一抗:北京博奧森公司生產,貨號bs-4246R、bs-11246R、bs-1191R;逆轉錄試劑盒:美國Thermo Fisher Scientific公司生產,貨號M16315。

MDF-U72V型超低溫冰箱:日本Sanyo公司生產;低溫高速離心機、移液器:德國Eppendorf公司生產;熒光正置顯微鏡:日本Nikon公司生產;超微量紫外分光光度計:瑞士Mettler Toledo公司生產;實時熒光定量PCR儀:美國Roche公司生產;離心機:湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1分組與造模

使用隨機數字表法,將48只大鼠分為對照組、模型組、美寶組、貝復新組4組,每組12只。各組大鼠均禁食12 h,模型組、美寶組、貝復新組大鼠進行糖尿病大鼠造模,腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋的STZ(稀釋濃度1∶100)[9],稱量體重后按50 mg/kg注射;注射3 d后,取大鼠尾靜脈血檢測其空腹血糖,血糖大于 11.1 mmol/L認為造模成功[10];如不成功,再禁食12 h后,腹腔再次注射1%的STZ溶液10 mg/kg。對照組大鼠為控制變量等劑量注射緩沖液。

糖尿病造模成功后,使用剃毛刀及脫毛膏對大鼠進行備皮,后用3%異氟烷吸入麻醉,依據全層皮膚缺損法[11]和沈氏改良塑料環肉芽腫定量法[12]對大鼠進行創面造模,以無菌操作沿大鼠脊椎方向在脊背兩側制成兩個對稱且直徑為20 mm的全層皮膚缺損創面。

1.2.2給藥

各組創面制備完成后,先用呋喃西林液(稀釋濃度1∶5 000)清潔創面[13],對照組和模型組創面外敷兩層生理鹽水紗布,美寶組創面外敷兩層美寶紗布(0.2 g/cm2),貝復新組創面外敷兩層貝復新紗布(60 U/cm2),隨后所有組別大鼠均加蓋兩層消毒干紗布,以膠布固定,每日上午和晚上進行換墊料、換藥操作[14-15]。

1.2.3取材

各組按上述方法制備完成后,分別于3、7、14 d 共3個時間點隨機取4只大鼠拍照記錄其創面愈合情況,斷頸處死,從深筋膜下層切取距離創緣0.5 cm的整個創面及周圍組織[12],一半用稱量紙包裹以防止組織收縮,置于包埋盒,并放入10%甲醛中性緩沖液中,24 h后再放入70%乙醇中,存儲于4 ℃冰箱,固定好的組織經脫水、包埋后形成蠟塊再保存于4 ℃冰箱,用于HE染色組織學觀察和免疫熒光染色。另外一半置于凍存管中,放入液氮罐中備用,再移入-80 ℃冰箱內保存。

1.3 檢測方法

1.3.1創面愈合率

使用Image J測定大鼠的創面面積,分別計算3、7、14 d時各組的創面愈合率以評估大鼠創面愈合情況。創面愈合率=(造模時創面面積-該時間點創面面積)/造模時創面面積[16]。

1.3.2HE染色

實驗時從4 ℃冰箱取出組織蠟塊,用石蠟切片機切片、烤片,37 ℃烘干過夜、65 ℃烤片1.5 h,在通風櫥中用二甲苯脫蠟20 min,依次過100%、90%、80%、70%無水乙醇各5 min后用超純水過濾,以蘇木精、伊紅染料染色,再經無水乙醇5 min脫水共2次、二甲苯3 min浸潤共2次,于通風櫥風干0.5 h后封片,熒光正置顯微鏡下以明場觀察創面肉芽組織形態。

1.3.3免疫熒光染色

從4 ℃冰箱取石蠟切片重復上述步驟烤片、脫蠟、依次過100%、90%、80%、70%、50%無水乙醇各5 min后用超純水過濾,用枸櫞酸鹽溶液在高壓鍋內水浴加熱修復抗原,冷卻后甩干玻片。用免疫組織化學筆沿組織邊緣描圈,圈內點上以1%牛血清白蛋白(BSA)稀釋的驢血清(稀釋濃度1∶10),在37 ℃烘箱內封閉0.5 h,甩干玻片,再加入1% BSA稀釋的一抗(稀釋濃度1∶500),4 ℃冰箱內過夜孵育一抗。第2天室溫復溫后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次,每次10 min,此后所有操作均避光進行。室溫孵育Cy3標記驢抗兔二抗1 h,再用PBS洗滌3次,每次10 min。洗滌完成后甩干玻片,用擦鏡紙擦干圈外多余水滴,加入含DAPI的抗熒光淬滅劑封片,蓋上蓋玻片后用指甲油在玻片兩端封層以固定蓋玻片。玻片避光保存于4 ℃冰箱內,待DAPI孵育完成后用正置熒光顯微鏡觀察各組大鼠CaN、NFAT、IL-2的表達情況。

1.3.4RT-qPCR

從-80 ℃冰箱內取出凍存的創面組織,以Trizol法[17]提取組織RNA,再用超微量紫外分光光度計測量其濃度和純度后,按說明書步驟添加逆轉錄盒內試劑并設置相應程序行逆轉錄,再以無酶水將所得樣品進行稀釋,按照SYBR Green說明書在100 μL八聯管中依次加樣后,于實時熒光定量PCR儀中設定相應反應程序進行實驗,測得相應Ct值,再用2-ΔΔCt法[18]對得到的數據進行處理、分析,以此檢測NFAT的mRNA基因轉錄水平。NFAT引物由南寧捷尼斯生物公司生產合成,其具體序列為正向:5′-CAG GTG TTT GTG GGC AAT GAC-3′、R:5′-GCA CGG AGT TGT GTT TCG C-3′。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 各組大鼠創面愈合率對比

3、7、14 d 3個時間點,與模型組相比,對照組、美寶組和貝復新組大鼠創面愈合情況更好,見圖1。

圖1 各組大鼠不同時間點創面愈合情況

3 d時,對照組大鼠創面愈合率(0.51±0.02)優于模型組(0.48±0.02),差異有統計學意義(P<0.05),其余各組組間差異無統計學意義(P>0.05);7、14 d時,與模型組相比,對照組、美寶組和貝復新組大鼠的創面愈合率更高,差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠創面愈合率

2.2 HE染色結果

3、7 d時,對照組、美寶組和貝復新組大鼠創面組織有少量出血、部分壞死細胞、散在炎性細胞浸潤,而模型組有大量出血、整個視野炎性細胞浸潤甚至有壞死帶的出現;14 d時,對照組、美寶組、貝復新組大鼠創面組織有大量新生毛細血管生成,也觀察到皮脂腺等皮膚附件的形成,而模型組仍有大量炎性細胞及細胞壞死帶。且在3、7、14 d時,可觀察到對照組、美寶組和貝復新組大鼠創面組織中炎性細胞浸潤和壞死細胞呈逐漸減少趨勢,模型組則無明顯減少,見圖2。

圖2 各組大鼠創面組織病理學結果(HE染色,200×)

2.3 NFAT、CaN、IL-2表達情況

3、7、14 d時,對照組、美寶組和貝復新組創面組織中NFAT、CaN表達水平明顯高于模型組;3、7、14 d時,模型組IL-2表達水平高于對照組、美寶組、貝復新組(P<0.05),見圖3。

a:P<0.05,與相同時間點對照組比較;b:P<0.05,與相同時間點模型組比較。

2.4 各組大鼠創面組織中NFAT mRNA表達水平

3 d時,對照組、美寶組和貝復新組創面組織中NFAT mRNA表達水平高于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05);7 d時,對照組、美寶組創面組織中NFAT mRNA表達水平高于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05),但貝復新組和模型組組間差異無統計學意義(P>0.05);14 d時,對照組創面組織中NFAT mRNA表達水平仍高于模型組,但美寶組和貝復新組表達水平低于模型組,差異均有統計學意義(P<0.05),見圖4。

a:P<0.05,與相同時間點對照組比較;b:P<0.05,與相同時間點模型組比較。

3 討 論

MEBT/MEBO應用于治療糖尿病慢性難愈合創面,成本低廉、預后較好,受到廣泛關注,但其具體作用機制仍不明確。創面的愈合往往與新生血管關系密切,已有研究表明,MEBT/MEBO可能通過增加血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達來促進創面成纖維細胞的分裂增殖及新生毛細血管的增殖,促進肉芽組織形成加速創面愈合[19]。而有實驗證明VEGF誘導血管生成需要激活NFAT,這種轉錄因子作為刺激信號和抑制信號在血管生成調節中的收斂點起著關鍵作用[20],NFAT信號通路的核因子在VEGF啟動后參與血管生成,許多血管生成基因與NFAT通路相關[21]。同時也有研究表明,鈣依賴的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶CaN可使NFAT去磷酸化,從而使核轉位和靶基因轉錄[22],且CaN/NFAT信號通路在促進IL-2等細胞因子的表達中起著至關重要的作用[23]。這提示MEBT/MEBO影響VEGF表達加快創面愈合的機制可能與CaN/NFAT通路相關。故本研究探討MEBT/MEBO在治療糖尿病創面時的部分作用機制,觀察了MEBT/MEBO對大鼠糖尿病創面組織CaN、NFAT、IL-2表達水平的影響。

前期有實驗研究[24]表明,NFAT在大鼠全層創緣組織中第1天時高表達,第3天表達水平有所下降,第5～7天低表達,在第7天之后幾乎不表達。血管的新生為愈合中的組織提供了氧、生長因子和免疫支持,而血管在大量生成及成熟之后則會發生受控性消退,因此在治療第14天創面組織CaN/NFAT表達降低,可能與創面基本完成愈合有關。根據免疫熒光結果,在治療第14天時,美寶組及貝復新組的NFAT、CaN、IL-2表達水平都明顯下降,與文獻報道[24]相似,這提示CaN/NFAT信號通路可能僅在治療前期發揮作用。

本研究結果顯示,在治療3、7 d時,與對照組相比,模型組糖尿病創面組織中NFAT、CaN表達水平降低,同時從表型觀察結果比較,模型組創面愈合明顯慢于對照組,且病理染色切片顯示新生血管較少,愈合中后期仍存在大量炎性細胞及壞死細胞。而模型組與對照組的治療方法完全一致,區別僅在于模型組大鼠為糖尿病模型,這提示CaN/NFAT通路在糖尿病大鼠創面中的表達可能受到抑制。根據免疫熒光和RT-qPCR結果,3、7 d時與模型組比較,MEBT/MEBO治療的美寶組創面組織中NFAT、CaN表達水平都較高,而IL-2表達水平較低,且NFAT mRNA表達水平也明顯高于模型組,提示MEBT/MEBO激活并上調了糖尿病創面中受抑制的CaN/NFAT通路。

綜上所述,MEBT/MEBO治療前期可能通過上調CaN/NFAT信號通路的表達,促進新生血管形成,加速糖尿病大鼠慢性難愈合創面愈合。但本研究僅從治療結果觀察CaN、NFAT、IL-2表達水平而得出結論,未探究生物體內普遍存在的負反饋調節對以上因子表達可能造成的影響,有待增加相應免疫抑制組進一步展開研究。