宏基因組二代測序在下呼吸道感染患者支氣管肺泡灌洗液中的病原學(xué)診斷價值

程長昆 姜長舟

下呼吸道感染是指喉以下的氣管、支氣管、肺泡等部位發(fā)生的感染性疾?。?］。下呼吸道感染的病原體十分復(fù)雜，以細(xì)菌和真菌為主要致病因素［2］。及時準(zhǔn)確地鑒定下呼吸道感染的病原體，對于指導(dǎo)臨床合理用藥、降低耐藥率、改善患者預(yù)后具有重要意義［3］。目前，臨床上常用的下呼吸道感染病原體檢測方法主要有傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)、分子生物學(xué)檢測和宏基因組二代測序（metagenomics next-generation sequencing，mNGS）等［4-7］。近年來，mNGS在下呼吸道感染的病原學(xué)診斷中逐漸展現(xiàn)出其優(yōu)勢和潛力［8-10］。支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）是利用支氣管鏡對肺段或亞肺段進(jìn)行灌洗后采集到的肺泡表面液體，是目前最能反映下呼吸道感染的病原體分布情況的標(biāo)本，具有較高的代表性和準(zhǔn)確性［11］。因此，本研究采用mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測方法對下呼吸道感染患者BALF中的病原體進(jìn)行分析，探討2種方法的優(yōu)缺點和一致性，以及mNGS檢出陽性與患者臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供有價值的參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性收集2020年4月至2023年3月安慶市望江縣醫(yī)院內(nèi)科130例下呼吸道感染患者的臨床資料。根據(jù)mNGS是否檢出病原體，將患者分為檢出組100例和未檢出組30例。兩組患者年齡、性別和基礎(chǔ)疾病比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。本研究符合倫理原則，經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（倫理編號：2023-LC-003）。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲者；②以《諸福棠實用兒科學(xué)》（第8版）［12］中下呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，包括社區(qū)獲得性肺炎、醫(yī)院獲得性肺炎、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎等者；③入院后24 h內(nèi)進(jìn)行支氣管鏡檢查并采集BALF樣本者；④BALF樣本同時進(jìn)行mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他部位的感染性疾病者；②BALF樣本不符合質(zhì)量要求，如回收率低于30%、細(xì)胞總數(shù)低于104/mL、中性粒細(xì)胞比例高于80%等者；③BALF樣本在運輸或保存過程中發(fā)生污染或損壞者；④患者或其家屬不同意參與本研究者。

1.3 方法 所有患者均在入院后24 h內(nèi)進(jìn)行支氣管鏡檢查，按照標(biāo)準(zhǔn)操作程序采集BALF樣本，每個肺段或亞肺段灌注生理鹽水20～40 mL，回收率不低于30%，回收液體立即分裝為2份，一份用于mNGS檢測，另一份用于常規(guī)培養(yǎng)檢測。

1.3.1 mNGS檢測 采用QIAamp DNA Mini Kit（Qiagen，德國）提取BALF樣本中的總核酸，采用NEBNext Ultra Ⅱ DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，美國）構(gòu)建文庫，采用Illumina NovaSeq 6000平臺進(jìn)行雙端150 bp高通量測序。測序數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量控制、去除人源序列、去除低質(zhì)量序列、去除重復(fù)序列等步驟后，與NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對分析，根據(jù)比對結(jié)果確定病原體種類和相對豐度。設(shè)定檢出閾值為每百萬條reads中至少有5條reads與目標(biāo)序列匹配。

1.3.2 常規(guī)培養(yǎng)檢測 將BALF樣本接種于血瓊脂培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基、MacConkey瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基等不同培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落生長情況，按照常規(guī)方法進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗。同時將BALF樣本接種于液體培養(yǎng)基中，置于自動血培養(yǎng)儀中培養(yǎng)5 d，觀察是否有陽性信號產(chǎn)生，如有陽性信號，則進(jìn)行菌種鑒定和藥敏試驗。另外，將BALF樣本制成涂片，在油鏡下觀察是否有真菌或寄生蟲存在。

1.4 觀察指標(biāo) 主要觀察指標(biāo)為mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測的陽性率、檢測病原體的分布、病原體檢測的一致性。次要觀察指標(biāo)為mNGS檢出組和未檢出組患者的臨床指標(biāo)、治療方案、預(yù)后情況及影響mNGS檢出陽性的因素。其中，臨床指標(biāo)包括外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計數(shù)及血清中細(xì)胞因子的濃度。預(yù)后情況包括住院時間、轉(zhuǎn)入ICU的比例、機(jī)械通氣的比例及病死率等。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料均符合正態(tài)分布以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，兩組間比較采用χ2檢驗。mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果的一致性采用Kappa系數(shù)進(jìn)行評價，Kappa值在0.01～0.20為無一致性，0.21～0.40為較低一致性，0.41～0.60為中等一致性，0.61～0.80為較高一致性，0.81～1.00為完全一致性。影響mNGS檢出陽性的因素采用logistic多因素回歸分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果比較 mNGS檢測結(jié)果顯示，130例下呼吸道感染患者BALF中共檢出病原體100株，未檢出寄生蟲。mNGS檢出陽性率為76.9%（100/130）。常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果顯示，130例下呼吸道感染患者BALF中共檢出病原體56株，未檢出非典型病原體和寄生蟲。mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測的陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=31.026，P＜0.001）。見表2。以《諸福棠實用兒科學(xué)》（第8版）中下呼吸道感染的診斷標(biāo)準(zhǔn)為金標(biāo)準(zhǔn)，分別以常規(guī)培養(yǎng)及mNGS檢測結(jié)果為檢驗變量，繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線。ROC曲線顯示，mNGS檢測的曲線下面積（area under the curveAUC）為0.84，而常規(guī)培養(yǎng)檢測的AUC為0.76。見圖1。

圖1 mNGS與常規(guī)培養(yǎng)的ROC曲線分析

表2 mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測的陽性率和病原體分布比較

2.3 兩組患者臨床指標(biāo)和預(yù)后比較 mNGS檢出組與未檢出組在外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計數(shù)及血清中細(xì)胞因子濃度差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。mNGS檢出組患者的住院時間、轉(zhuǎn)入ICU的比例、機(jī)械通氣的比例、病死率等預(yù)后指標(biāo)均高于未檢出組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者臨床指標(biāo)比較

2.4 影響mNGS檢出陽性的多因素logistic回歸分析將mNGS檢出陽性作為因變量，將年齡、性別、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計數(shù)及血清中細(xì)胞因子等作為自變量。連續(xù)變量（年齡、外周血細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計數(shù)、血清中細(xì)胞因子）以原始數(shù)值表示，二分類變量：性別（0=女性，1=男性）和基礎(chǔ)疾?。?=無，1=有）。采用逐步回歸法進(jìn)行多因素logistic回歸分析，結(jié)果顯示，年齡、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白是影響mNGS檢出陽性的危險因素。見表4。

表4 影響mNGS檢出陽性的多因素logistic回歸分析

3 討論

下呼吸道感染是一種常見的呼吸系統(tǒng)疾病，其病原體復(fù)雜多樣，及時準(zhǔn)確地鑒定病原體對于指導(dǎo)臨床合理用藥、降低耐藥率、改善患者預(yù)后具有重要意義。本研究采用mNGS和常規(guī)培養(yǎng)檢測方法對下呼吸道感染患者BALF中的病原體進(jìn)行分析，探討兩種方法的優(yōu)缺點和一致性，以及mNGS檢出陽性與患者臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，為臨床提供有價值的參考。

本研究結(jié)果顯示，mNGS檢出陽性率高于常規(guī)培養(yǎng)檢測，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），與張彩霞等［13］的研究結(jié)果一致。這可能與mNGS能夠同時檢測樣本中所有類型的核酸序列，從而鑒定出多種已知或未知的微生物有關(guān)，而常規(guī)培養(yǎng)檢測受限于培養(yǎng)條件、培養(yǎng)時間、抗生素干擾等因素，不能檢測非培養(yǎng)性或難培養(yǎng)性微生物。

本研究結(jié)果顯示，mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果在細(xì)菌、真菌和非典型病原體方面具有中等一致性（Kappa=0.42～0.54），在病毒和寄生蟲方面具有較低一致性（Kappa=0.12～0.25）。可能與以下原因有關(guān)：①mNGS能夠檢測出常規(guī)培養(yǎng)檢測難以發(fā)現(xiàn)的病原體，如非培養(yǎng)性或難培養(yǎng)性微生物、新發(fā)現(xiàn)的微生物等；②mNGS能夠區(qū)分不同菌屬或菌種之間的微小差異，而常規(guī)培養(yǎng)檢測可能將其歸為同一類；③mNGS可能檢測到一些非致病性或低致病性的微生物，如皮膚或口腔的正常菌群，而常規(guī)培養(yǎng)檢測可能忽略其存在；④mNGS可能檢測到一些已經(jīng)死亡或被抑制的微生物的核酸殘留，而常規(guī)培養(yǎng)檢測只能檢測活性的微生物［14-15］。因此，mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果之間存在一定的差異，不能完全替代或否定彼此，而應(yīng)結(jié)合臨床綜合判斷。

本研究結(jié)果顯示，mNGS檢出陽性與患者年齡、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白等因素相關(guān)，提示mNGS可作為下呼吸道感染患者病情評估和預(yù)后判斷的輔助手段。mNGS檢出組患者的外周血白細(xì)胞、C反應(yīng)蛋白、降鈣素原、中性粒細(xì)胞計數(shù)及血清中細(xì)胞因子等炎癥指標(biāo)均高于未檢出組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明mNGS檢出陽性反映了患者體內(nèi)存在較強(qiáng)的炎癥反應(yīng)［16-17］。mNGS檢出陽性提示患者預(yù)后不良［18-19］。多因素logistic回歸分析顯示，年齡、基礎(chǔ)疾病、外周血白細(xì)胞和C反應(yīng)蛋白是影響mNGS檢出陽性的危險因素，表明這些因素與患者體內(nèi)病原體負(fù)荷和感染嚴(yán)重程度有關(guān)［20］。

本研究有以下局限性：①本研究為回顧性對照研究，存在選擇偏倚和混雜因素的可能；②本研究納入的患者數(shù)量較少，可能影響結(jié)果的穩(wěn)定性和可信度；③本研究未對mNGS檢測到的非致病性或低致病性微生物進(jìn)行進(jìn)一步驗證，可能導(dǎo)致結(jié)果的過度解釋或誤解。

綜上所述，mNGS在下呼吸道感染患者BALF中的病原學(xué)診斷中具有較高的敏感性和廣譜性，能夠檢測出常規(guī)培養(yǎng)檢測難以發(fā)現(xiàn)的病原體，對于指導(dǎo)臨床合理用藥和改善患者預(yù)后有重要意義。mNGS與常規(guī)培養(yǎng)檢測結(jié)果之間存在一定的差異，不能完全替代或否定彼此，而應(yīng)結(jié)合臨床綜合判斷。