小兒呼吸機相關肺炎與氣道微生態(tài)關系的研究

劉艷 劉峰

醫(yī)院獲得性肺炎通常在入院48小時后發(fā)生，可分為呼吸機相關性肺炎 （ventilator associated pneumonia，VAP） 或非呼吸機相關性醫(yī)院獲得性肺炎 （NV-HAP），占醫(yī)療保健相關感染的25%。VAP指機械通氣（mechanical ventilation，MV）開始48 h后至拔管后48 h時間段內發(fā)生的院內獲得性肺炎［1］。有研究表明，VAP發(fā)生率為15%～60%，且病死率高達49%～70%［2］。國外早期VAP的平均發(fā)病率為9%～70%［3］。國內一項臨床研究結果顯示，我國VAP的發(fā)病率高達18%～60%，較高的發(fā)病率給患者的家庭以及社會造成極大的負擔［4］。微生態(tài)是指共享人體內空間的共生、共棲病原微生物的生態(tài)共同體，包括細菌、古細菌、真菌和病毒等微生物。近年來隨著分子生物學、生物信息學等技術方法的迅速發(fā)展，基因測序成本的下降和測序精度的提高，使得微生物組學研究逐步開展，越來越多學者認識到氣道微生態(tài)在VAP發(fā)生發(fā)展過程中的重要作用［5］。因此本文就目前國內外關于小兒VAP與氣道微生態(tài)方面的研究做一綜述，以期為小兒VAP的治療提供新思路。

1 氣道微生物與肺炎的關系

研究發(fā)現，微生物與肺炎的復雜性和多樣性有關，目前認為肺部優(yōu)勢菌屬包括鏈球菌屬（Streptococcus spp.）、普雷沃菌屬（Prevotella spp.）、梭桿菌屬（Fusobacteria spp.）和韋榮球菌屬（Veillonella spp.），而嗜血桿菌屬（Haemophilus spp.）和奈瑟菌屬（Neisseria spp.）較少見［6］。肺炎可破壞氣道和肺部微生物平衡，使得部分微生物快速浸潤和增殖，導致機體生態(tài)失調，影響與宿主免疫狀態(tài)密切相關的微生物群豐度、多樣性和組成。

2 小兒VAP的特點

小兒鼻腔相對短小，后鼻道、氣管、支氣管狹窄，肺泡數量少，平滑肌發(fā)育不完善，呼吸深度有限，呼吸儲備量較小，此外，氣道黏膜嬌嫩，血管含量豐富，易受病原菌侵襲，肺泡間質組織含量豐富，發(fā)生間質性肺炎、肺不張等疾病的風險增加，導致兒童VAP的發(fā)生率高［7］。雖然兒童的氣道分泌物相對較少，但是由于免疫系統較弱，患兒更容易感染呼吸道病原體。而且小兒氣道黏膜上皮分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A，SIgA）水平含量低，肺泡巨噬細胞功能不足，這也是小兒易患VAP的重要原因之一［8］。預防VAP的方法包含非藥物措施（如手衛(wèi)生、口腔護理）、通氣集束聲門下分泌物的定位和引流、使用抗生素和益生菌等［9］。VAP通常發(fā)生機械通氣超過48 h并接受有創(chuàng)手術的患者，特點為新發(fā)在放射學影像和癥狀上的肺浸潤如發(fā)熱，膿性分泌物，白細胞增多，氧合障礙，或缺氧加重。精確識別微生物對于后續(xù)干預和治療至關重要。

3 小兒VAP的危險因素及與微生物的關系

與VAP相關的微生物的來源包括位于胃腸道或肺部系統的醫(yī)療設備（例如飼管、胃管和氣管插管）、工作人員之間的微生物轉移（缺乏足夠的手部衛(wèi)生）、宿主或治療定植風險因素（例如抗生素、手術、潛在疾病嚴重程度、侵入性設備）和環(huán)境。細菌是VAP的主要原因。大多數 VAP 細菌病例是由革蘭氏陰性菌引起的，只有 20%～ 30% 的病例是由革蘭氏陽性菌引起的。耐多藥 （multidrug-resistant，MDR） 細菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin resistant staphylococcus，MRSA）在 VAP 中更常見。免疫抑制、抗生素使用和耐藥性以及過去 3 個月內住院治療是發(fā)生 MDR 感染的危險因素。對于插管患者，接受機械通氣的時間越長，發(fā)生 MDR 感染的可能性就越大［10］。由于抗生素的廣泛使用和醫(yī)療衛(wèi)生水平差異，不同地區(qū)的VAP患兒呼吸道病原菌種類與耐藥情況亦存在差異。革蘭陰性菌是導致VAP的主要病原菌之一，其包括銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌、克雷伯桿菌等［11］。這些細菌的耐藥性普遍較高，治療難度較大。革蘭陽性菌也是VAP的常見病原菌［12］，如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、葡萄球菌等。這些細菌的耐藥性相對較低，治療相對容易。郝恒瑞等［13］的研究表明，肺炎克雷伯菌（29.09%）、鮑曼不動桿菌（21.82%）、銅綠假單胞菌（16.36%）是VAP常見的病原菌，部分早發(fā)型VAP患兒致病菌以金黃色葡萄球菌為主，晚發(fā)型VAP存在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等多藥耐藥菌交叉感染現象。近期國內研究發(fā)現，早發(fā)和晚發(fā)VAP患者的革蘭陰性菌、陽性菌菌種、真菌及巨細胞病毒的檢出率比較無明顯差異［14］。兒童VAP經驗性治療VAP需了解其流行病學分布，結合當地藥敏情況覆蓋病原菌，同時需根據ICU常見細菌感染啟動合理的經驗性抗感染治療才能提高VAP患者的存活率，如果病原菌檢驗結果及藥敏試驗提示經驗性抗菌藥物使用不合理，即使再根據結果調整亦不能改善患者預后［15］。

4 微生態(tài)研究技術

微生態(tài)研究技術包括傳統方法和分子生物學方法。傳統方法是通過培養(yǎng)微生物并觀察其生長狀態(tài)和特征來研究微生物群落的分布情況，但該方法存在一定的局限性，只能檢測到可培養(yǎng)的菌種，無法反映微生物群落的整體情況。分子生物學方法則可以不依賴微生物的可培養(yǎng)性，通過特定的DNA序列或RNA序列來鑒定、定位和描述微生物群落的結構、組成及功能。主要的分子生物學方法包括聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction， PCR）、實時熒光定量PCR、454測序、Illumina測序、Metagenomics等。由于微生物培養(yǎng)技術存在的局限性，許多種屬相近的人體微生物無法通過傳統的菌種培養(yǎng)鑒定方法區(qū)分，也無法反映微生物群落的動態(tài)變化。16S rRNA基因測序技術和全基因組測序目前應用最為廣泛，但其本身也存在一定的局限性：①無法明確病毒和真菌在VAP患者氣道的感染情況；②無法獲得細菌功能代謝等有效信息；③基于一兩個高變區(qū)的系統發(fā)育分析對部分種系的分辨效果不佳；④無法對特定菌種進行定量分析［16］。最近的研究利用16S核糖體RNA （rRNA）基因測序來深入研究微生物的代謝分類學，并分析健康和患病個體的細菌群落，甚至包括非典型微生物。在16S核糖體RNA （rRNA）基因測序中有兩個關鍵指標：α多樣性和β多樣性，為了解肺部微生物群的組成和結構提供了關鍵的見解。在氣管插管后僅48小時內即可檢測到的α多樣性減少與通氣時間延長相關，但與VAP的發(fā)生或抗生素的使用不一定相關［17］。具體來說，在插管時，鏈球菌屬、乳桿菌屬和普雷沃菌屬等類群在隨后發(fā)生VAP的患者中豐度降低，而嗜血桿菌屬、莫拉菌屬、緩癥鏈球菌/肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌和產黑普雷沃菌屬等類群在插管時更為普遍。微生物群落在調節(jié)生長、毒力、生物膜形成、群體感應和抗生素耐藥性方面有著重要作用。β多樣性受疾病存在和嚴重程度的影響，也可能影響肺部感染的易感性。氣道生態(tài)失調在發(fā)生VAP的患者中比沒有發(fā)生VAP的患者更明顯，這可能與伯克霍爾德菌屬、芽孢桿菌目（以金黃色葡萄球菌為主要種）和假單胞菌目等屬的相對豐度有關［18］。檢測細菌DNA并不能確認微生物的活性，因為DNA的存在可能由定植、排泄或非感染性的死亡微生物造成［19-24］。

5 氣道微生態(tài)與VAP

氣道微生態(tài)系統十分復雜，其對于呼吸系統正常功能的維持，以及呼吸系統疾病發(fā)生的影響一直是臨床關注的熱點。有研究發(fā)現，成人肺部菌群主要來自口咽，以厚壁菌門以及擬桿菌門為主構成，而兒童上呼吸道解剖結構與成人不同，且鼻咽部分泌物較多，因此其肺部菌群以來自鼻咽及口咽為主，主要為源自上呼吸道的莫拉菌屬、葡萄菌屬、鏈球菌屬以及嗜血桿菌屬等［25］。正常情況下，健康人體呼吸道可檢測到豐富菌群共同維持呼吸道內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，構成呼吸道正常菌群，但當機體免疫力低下、定植菌致病力強、數量多時，發(fā)生氣道微生態(tài)失衡，導致氣道微生態(tài)發(fā)生改變。兒童成長期是呼吸道菌群發(fā)展的關鍵時期，遺傳、分娩方式、喂養(yǎng)方式、生活環(huán)境、抗生素的使用等均可影響呼吸道菌群的組成［26-29］。同時，兒童上呼吸道發(fā)育不成熟，抵抗力較弱，其呼吸道細菌定植、增殖的風險更高，從而影響氣道微生態(tài)平衡。

VAP是氣道微生態(tài)的失調所致的結果之一。插管和呼吸機使用可以改變氣道微生態(tài)，促進有害細菌如綠膿桿菌和金黃色葡萄球菌的生長。這些病原體易于附著于下呼吸道的上皮細胞和呼吸道分泌物中形成生物膜，導致VAP的發(fā)生。維持氣道微生態(tài)的平衡是預防和治療VAP的目標之一。通過調整氣道微生態(tài)，如使用益生菌、氧化劑和消毒劑等，可以減少病原體定植和生長，并增加有益菌種如乳酸菌的數量，從而減少VAP的風險。隨著呼吸機在呼吸道疾病中的開展使用，越來越多的危重患兒得益于技術的發(fā)展存活率逐漸提高，但另一方面，MV的使用也帶來了很多并發(fā)癥，其中以VAP在臨床上最為常見。MV為侵入性操作，破壞口咽部及呼吸道黏膜的正常屏障功能，可對患者氣道菌群定植、病原清除造成不利影響。VAP不同于一般肺炎，其影響因素多且復雜。Abiramalatha等［30］在一項薈萃分析中明確指出，定期更換呼吸機回路能有效減少VAP發(fā)生率，側面證實了氣管導管氣囊周圍分泌物的滯留和下漏易使細菌進入支氣管肺組織，增加VAP發(fā)生的危險。同時，接受MV治療的患兒，自身疾病危重，需要反復使用多種抗菌藥物，導致正常菌群的生長環(huán)境發(fā)生變化，增加條件致病菌和真菌感染的風險，這也是VAP難治的原因之一。Kelly等［31］指出VAP患者氣道微生態(tài)的β多樣性增加，即環(huán)境梯度不同生態(tài)群落之間組中組成的差異增加，抗生素的使用是造成菌群多樣性降低的原因之一。Flanagan等［32］的臨床研究結果顯示，MV患者使用抗生素后氣道上呼吸道菌群Shannon指數由1.48降低為0.59，銅綠假單胞菌成為優(yōu)勢菌群。Zakharkina等［33］使用16sRNA對MV患者氣道樣本測序，對物種多樣性和豐度進行定量分析，結果顯示，VAP患者假單胞桿菌的物種豐度高于未發(fā)生VAP的ICU患者，推測條件致病菌的豐度增加可一定程度推動VAP發(fā)生。Woo等［34］的研究發(fā)現，MV首次拔管成功患者Shannon指數在拔管后一周顯著降低，而拔管失敗患者Shannon指數則無明顯變化，兩組的β多樣性比較差異有統計學意義，棒狀桿菌及別嘌醇菌較高的豐度與28 d死亡率密切相關，提示呼吸微生物組動力學與MV拔管和短期死亡率有一定關聯。患者氣道微生態(tài)與VAP難治存在一定的關聯性，對患者精確而及時氣道微生態(tài)檢測對于VAP的治療非常重要。氣道微生態(tài)的監(jiān)測對預測和診斷VAP也很重要。通過對患者氣道微生態(tài)進行定量和質量分析，可以提前識別有害菌株的存在，評估治療效果，并引導治療策略的制定。因此，氣道微生態(tài)與VAP之間存在緊密的關系。通過了解和調整氣道微生態(tài)，可以有效預防和治療VAP。

6 氣道微生物影響VAP的潛在機制

肺免疫系統包括肺上皮細胞、肺泡巨噬細胞、中性粒細胞、固有淋巴細胞和細胞因子/趨化因子，它們啟動免疫反應并維持肺內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。復雜的肺部微生物群落在調節(jié)免疫系統中起著至關重要的作用，建立了共生關系。雖然肺部微生物組與固有或適應性反應之間的聯系尚不完全清楚，但它在健康和疾病中影響宿主的免疫反應［35］。肺部微生物組在固有免疫細胞中發(fā)揮著不同的作用。樹突狀細胞、抗原呈遞細胞和處理細胞激活T細胞應答。肺微生物組的生態(tài)失調可以改變樹突狀細胞過程，增加刺激促炎細胞因子產生的細胞因子。肺部微生物群的改變也導致Th17和調節(jié)性T細胞的缺乏，而這些細胞調節(jié)內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，維持肺部免疫耐受。此外，模式識別受體（pattern recognition receptors， PRRs），如toll樣受體（Toll-like receptors， TLRs）和NOD型受體（NOD-type receptors， NLRs），在宿主與微生物組的相互作用中發(fā)揮關鍵作用。細菌代謝產物和細菌代謝產物也可能導致氣道炎癥細胞因子水平的變化。肺微生物組和炎癥之間的關系對于保護肺免受病原微生物的侵襲至關重要。然而，肺部微生物組的生態(tài)失調會導致炎癥，而微生物組復雜性的降低會產生雙向的炎癥-生態(tài)失調循環(huán)。肺部微生物組和宿主免疫的相互作用是復雜的，是各種呼吸系統疾病發(fā)生或進展的基礎。理解這些相互作用的潛在機制和后果對于更好地理解VAP等疾病期間宿主微生物群的相互作用至關重要。某些微生物，如變形菌門的微生物，可以引發(fā)過度或不適當的肺部炎癥反應，促進組織損傷和疾病進展。由厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門等不同菌門引起的生態(tài)失調［36］。

7 通過氣道微生物預防VAP發(fā)展的策略

已經有研究通過益生菌來調節(jié)肺部微生物群，以達到治療呼吸系統疾病的目的。然而，目前針對VAP的臨床試驗較少，因此對呼吸道菌群的影響仍有待確定。最近的研究表明，腸道益生菌可能通過局部和全身效應降低VAP的發(fā)生率。它們有可能控制病原菌的生長，調節(jié)腸-肺軸中的細菌移位，降低呼吸道中的微生物負荷，改善胃腸屏障功能。此外，益生菌在下呼吸道具有免疫增強作用，可能通過調節(jié)微生物組成和代謝，改善宿主免疫應答。然而，Johnstone等的一項研究表明，使用益生菌不能降低VAP的風險［37］。目前還沒有臨床研究來評估“呼吸道益生菌”（即向下呼吸道注入或霧化的活微生物群）的作用。仍需要更大規(guī)模、設計良好的臨床試驗來進一步評估。

綜上所述，微生態(tài)作為氣道屏障的組成部分，對宿主的代謝、免疫功能等具有重要影響，可作為VAP等呼吸系統疾病診斷和治療的潛在靶點。VAP是影響MV治療成功與否的關鍵因素。高通量測序技術的發(fā)展為VAP的病原檢測和精準治療開辟了新的方向。VAP是重癥監(jiān)護病房常見的并發(fā)癥，具有較高的發(fā)病率和死亡率。目前已有預防策略，包括通氣集束和適當使用抗生素。由于基于傳統培養(yǎng)的檢測方法的局限性，確定引起VAP的微生物仍然具有挑戰(zhàn)性。目前對于微生物群屬間、微生物與宿主間的相互作用機制，微生物抑制治療對人體的健康影響等問題有待進一步深入研究。