宮頸脫落細(xì)胞HPVE6/E7 mRNA檢測在宮頸癌早期篩查與HPV分型診斷中的應(yīng)用

任玉峰 王兆輝 段秀芳 徐娜 張妍

宮頸癌是婦科常見三大惡性腫瘤之一，近年來，年輕女性宮頸癌的發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢。臨床研究結(jié)果顯示，醫(yī)學(xué)干預(yù)可有效預(yù)防宮頸癌的發(fā)生，及早篩查和診斷癌前病變且配合治療，治愈率在90%以上［1］。宮頸癌癌前病變早期缺乏特異性臨床表現(xiàn)，不易察覺，早期篩查對患者的診斷顯得尤為重要。人乳頭瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，尤其是高危型人乳頭瘤病毒感染（highrisk human papilloma virus， HR-HPV）患者，癌變風(fēng)險顯著增加［2］。HPV內(nèi)部的E6/E7癌基因表達(dá)產(chǎn)生E6/E7癌蛋白，E6蛋白通過抑制P53而阻斷凋亡，E7蛋白抑制pRB使細(xì)胞周期失控，致使宮頸癌的發(fā)生。而HPV E6/E7 mRNA是E6/E7癌基因表達(dá)的直接產(chǎn)物，也是E6/E7癌蛋白合成的模板，是宮頸病變開始和進(jìn)展為宮頸癌的必要條件。因此，HPV E6/E7 mRNA檢測是宮頸癌風(fēng)險程度的重要評估方法［3］。HPV E6/E7 mRNA 陽性率及拷貝數(shù)與宮頸癌中HPV的分型有無相關(guān)性，尚不明晰。本研究收集安康市婦幼保健院268例宮頸癌疑似患者的臨床病歷資料，探討宮頸脫落細(xì)胞E6/E7 mRNA對宮頸癌與HPV分型的診斷價值，旨在為臨床進(jìn)一步病理活檢和早期臨床干預(yù)提供依據(jù)。報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年3月至2020年3月安康市婦幼保健院收治的268例疑似患者作為研究對象。年齡22～65歲，平均（40.72±9.147）歲；身體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）為（20.35±1.92）kg/m2。宮頸癌診斷標(biāo)準(zhǔn)以組織學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)病理診斷意見分為宮頸癌組（n=140）和非宮頸癌組（n=128）；268例患者根據(jù)HPV分型結(jié)果分為高危型組（n=212）和非高危型組（n=56，包括低危型組15例，低危混合組41例）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者可見接觸性出血，絕經(jīng)患者可見陰道不規(guī)則出血或白帶帶血；②B超或CT檢測發(fā)現(xiàn)宮頸贅生物；③白帶增多；④患者及家屬知情同意，并自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者術(shù)前進(jìn)行過放化療史；②合并急性婦科炎癥者；③合并其它惡性腫瘤者。本研究通過倫理委員會審批（審批文件號：2018031）。

1.2 檢查方法 宮頸脫落細(xì)胞收集：收集前3 d禁止性生活，并用生理鹽水沖洗陰道。采用內(nèi)窺器擴(kuò)張陰道，暴露宮頸。將宮頸細(xì)胞專用刷插入宮頸口，順時針旋轉(zhuǎn)5周，采集脫落宮頸細(xì)胞。留置在專用杯中，編號，冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

HPV E6/E7 mRNA檢測：采用支鏈DNA技術(shù)（b-DNA）檢測HPV E6/E7mRNA。取備用宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本，離心取上清液送檢。以200 μL裂解液+400 μL雙蒸水+5 μL蛋白酶K對標(biāo)本進(jìn)行裂解。將裂解后的標(biāo)本液50 μL加入樣本檢測孔，并加入50 μL標(biāo)本緩沖液，加載好后封閉，55℃孵育3.5 h。完成后以洗脫液洗板，依次加入預(yù)放大和放大分子、探針標(biāo)記物各100 μL，每孔，期間均行55℃雜交處理。完成后46℃孵育0.5 h。采用冷光檢測儀讀取HPV E6/E7 mRNA拷貝數(shù)，以E6/E7＞1.0為結(jié)果陽性［4］。

HPV分型檢查：采用YN-H18型全自動核酸分子雜交儀檢測HPV E6/E7 mRNA，相應(yīng)試劑盒購自亞能生物技術(shù)有限公司，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。參照標(biāo)準(zhǔn)記錄HPV分型［5］，以HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、82型為高危型HPV，以HPV 6、11、42、43、44、81型為低危型HPV。高危型病毒單獨感染及存在高危型病毒的混合感染定義為高危組；低危型病毒單獨感染定義為低危組；低危混合型為低危型病毒混合感染；低危型和低危混合型總歸于非高危組。

1.3 確診方法 宮頸癌需要兩名主治醫(yī)師及以上職稱進(jìn)行病理診斷采用雙盲法進(jìn)行確診，對于安康市婦幼保健院及寧夏第五人民醫(yī)院兩家醫(yī)院意見不一致者，由第三家醫(yī)院棗莊市立醫(yī)院做診斷，最后對結(jié)果進(jìn)行討論，最終結(jié)果作為宮頸癌確診病例。

1.4 觀察指標(biāo) 記錄268例研究對象一般資料（年齡、BMI、文化程度、孕次、產(chǎn)次、吸煙史、初次性生活時間、性伴侶個數(shù)、陰道分泌物情況、甲狀腺疾病、CA125、SCC、HPV分型）及HPVE6/E7 mRNA 拷貝數(shù)并進(jìn)行分組比較。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 選用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以表示，組間行獨立樣本t檢驗，不符合正態(tài)分布時以M（P25，P75）表示，組間行秩和檢驗；計數(shù)資料以例和率表示，組間行χ2檢驗，多因素分析采用logistic回歸分析，判斷準(zhǔn)確性采用受試者工作曲線（receiver operator characteristics， ROC）分析，結(jié)果以曲線下面積（area under the curve， AUC）表示，組間比較行Z檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者基本情況比較 宮頸癌組與非宮頸癌組年齡及BMI的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 宮頸癌和非宮頸癌組年齡及BMI比較（）

表1 宮頸癌和非宮頸癌組年齡及BMI比較（）

組別宮頸癌組非宮頸癌組t值P值例數(shù)140 128年齡（歲）40.03±8.665 41.47±9.625 0.319 0.750 BMI（kg/m2）20.43±2.051 20.12±1.892 0.259 0.796

2.2 不同患者HPV E6/E7 mRNA比較 宮頸癌與非宮頸癌組不同HPV分型組HPVE6/E7 mRNA陽性率和拷貝數(shù)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2、3。

表2 宮頸癌組和非宮頸癌組HPV E6/E7 mRNA比較

表3 高危型HPV組、低危型HPV組及低危混合型HPV組HPVE6/E7 mRNA 的比較

2.3 logistic多因素回歸分析 納入單因素分析中差異有統(tǒng)計學(xué)意義的變量進(jìn)入多元模型（變量賦值見表4），采用逐步向前選擇變量，以宮頸癌為因變量（否0，是1），結(jié)果顯示：文化程度初中及以下、孕次≥3次、初次性生活時間＜18歲、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCC）＞2 ng/mL及HPVE6/E7 mRNA陽性是宮頸癌的高危因素（P＜0.05）。見表5。以高危型HPV為因變量（否0，是1），結(jié)果顯示：年齡（35～65歲），孕次≥3次、性伴侶≥3個、陰道分泌物異常及HPVE6/E7 mRNA陽性是高危型HPV的獨立危險因素（P＜0.05）。見表6。

表4 變量賦值表

表5 宮頸癌logistic回歸分析

表6 高危型HPV logistic回歸分析

2.4 單項與聯(lián)合檢測宮頸癌的價值分析 以宮頸癌為狀態(tài)變量，孕次、初次性生活時間、SCC、HPVE6/E7 mRNA和多項聯(lián)合為檢測變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示：孕次、初次性生活時間、SCC、HPVE6/E7 mRNA 及多項聯(lián)合的AUC分別為0.625、0.671、0.691、0.632和0.826，最佳截值分別為1.14次、47.76歲、1.96 ng/mL、47 969拷貝數(shù)、1.210。孕次、初次性生活時間、SCC、HPVE6/E7 mRNA 和多項聯(lián)合具有良好的靈敏度和特異度，Z檢驗顯示聯(lián)合檢測概率的AUC顯著高于其他單項檢測指標(biāo)（P＜0.05）。見表7，圖1。

圖1 單項及聯(lián)合檢測判斷宮頸癌的ROC曲線

表7 單項及聯(lián)合檢測宮頸癌的價值分析

2.5 單項與聯(lián)合檢測高危型HPV的價值分析 以高危型HPV為狀態(tài)變量，年齡、孕次、性伴侶、陰道分泌物、HPVE6/E7 mRNA和多項聯(lián)合為檢測變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示年齡、孕次、性伴侶、陰道分泌物、HPVE6/E7 mRNA 及多項聯(lián)合的AUC分別為0.639、0.662、0.642、0.648、0.631和0.880，最佳截值分別為49.92歲、1.207次、3.025個、陰道分泌物異常、51735拷貝數(shù)、1.137。年齡、孕次、性伴侶、陰道分泌物、HPVE6/E7 mRNA 和多項聯(lián)合具有良好的敏感度和特異性，Z檢驗顯示聯(lián)合檢測概率的AUC顯著高于其他單項檢測指標(biāo)（P＜0.05）。見表8和圖2。

圖2 單項與聯(lián)合檢測判斷高危型HPV的ROC曲線

表8 單項及聯(lián)合檢測判斷高危型HPV的價值分析

3 討論

目前，宮頸癌是婦科僅次于乳腺癌的第二大惡性腫瘤。HPV是具有雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA病毒，當(dāng)HPV感染宿主后以整合狀態(tài)存在宿主細(xì)胞DNA后，可引起基因表達(dá)缺失或突變，同時影響抑癌基因正常表達(dá)［6］，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［7］，成為宮頸癌變的誘因。本研究顯示年齡35～65歲是高危型HPV高發(fā)群體，可能是因該階段患者性生活活躍，受孕、流產(chǎn)次數(shù)較多，造成的機(jī)械性損傷使高危型HPV感染機(jī)率增加［8］。臨床也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)高齡婦女因雌激素水平降低，機(jī)體免疫功能減退，使HPV防御能力下降，而年輕女性因?qū)π孕袨檎J(rèn)知的不同，性伴侶多，性行為時不注意安全衛(wèi)生，高危型HPV感染率也在上升［9］。綜上所述，筆者認(rèn)為年齡在高危型HPV感染中的影響無直接相關(guān)性，是多種復(fù)雜因素協(xié)同的結(jié)果，年輕患者主要與性伴侶多有關(guān)，這與本文中的研究結(jié)果一致。另外，本研究發(fā)現(xiàn)孕次、陰道分泌物異常也是高危型HPV的獨立影響因素，這與既往報道一致［10］。因而，改變不良生活習(xí)慣，注意身體衛(wèi)生有助于降低HPV風(fēng)險。但上述因素涉及個人隱私，可控性與穩(wěn)定性較差［11］，臨床有待更多的實驗室指標(biāo)檢測及實驗病例的擴(kuò)充，以精準(zhǔn)檢測HPV分型和宮頸癌變風(fēng)險。

宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查作為宮頸癌的早期篩查方法已在臨床廣泛應(yīng)用，成為共識［12］。而E6、E7是HPV早期編碼區(qū)的基因，報道證明E6可能利用泛素-蛋白酶體系降解PDZ蛋白，進(jìn)而加快棘細(xì)胞層細(xì)胞惡性增殖，而E7可競爭性結(jié)合pRb CR2區(qū)特殊結(jié)構(gòu)結(jié)合位點，抑制pRb抑瘤活性，誘導(dǎo)細(xì)胞惡變［13］。武振宇［14］研究顯示，F(xiàn)IS1 mRNA、HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平與宮頸病變程度存在顯著相關(guān)性，宮頸病變程度越嚴(yán)重，F(xiàn)IS1mRNA表達(dá)量呈降低趨勢，而HPV E6/E7 mRNA表達(dá)量呈上升趨勢，與本文研究結(jié)果一致。相關(guān)研究顯示，HPV E6/E7 mRNA 聯(lián)合液基細(xì)胞學(xué)檢查在宮頸癌篩查中有重要作用［15-17］。此外，還有報道顯示E6、E7參與了高危型HPV 病毒免疫監(jiān)視和免疫逃逸途徑，使機(jī)體長期處于高危型HPV感染狀態(tài)［18］，增加癌變機(jī)率。朱行行等［19］研究發(fā)現(xiàn)，高危型-HPV E6/E7 mRNA檢測在新疆維吾爾族婦女宮頸病變分層管理中有著重要應(yīng)用價值，可當(dāng)作二線篩查指標(biāo)。王小紅等［20］研究發(fā)現(xiàn)，高危型HPV E6/E7 mRNA 表達(dá)水平有助于篩查宮頸癌變和HPV分型。這與本研究也發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA是宮頸癌與高危型HPV感染共同的高危因素，可能與此有關(guān)結(jié)果相一致。這也說明監(jiān)測宮頸脫落細(xì)胞中HPV E6/E7 mRNA表達(dá)水平有助于篩查宮頸癌變和HPV分型。

本研究通過logistic多因素回歸分析探討宮頸癌與高危型HPV的獨立影響因素，比較HPV E6/E7 mRNA單項與多項聯(lián)合檢測對檢測宮頸癌與HPV分型的價值，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA多項聯(lián)合檢測較單項檢測AUC顯著提高，提示HPV E6/E7 mRNA多項聯(lián)合檢測有助于提高判斷宮頸癌與HPV分型的準(zhǔn)確性，其在篩查宮頸癌與檢測HPV分型方面具有可行性。

綜上所述，基于HPV E6/E7 mRNA檢測的多項聯(lián)合檢測概率可用于宮頸癌篩查和高危型HPV的診斷。