基于Keap1/Nrf2/HO-1信號通路研究當歸醇提物對多囊卵巢綜合征大鼠的保護作用

莫思懿,曹后康,張可鋒,晉 玲,鐘明利,韋日明,高 雅

(1. 桂林醫學院高發病防治藥理學重點實驗室,廣西 桂林 541199;2. 甘肅中醫藥大學藥學院,甘肅 蘭州 730000)

多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是一種以雄激素水平升高、排卵功能障礙和形態異常為特征的疾病[1]。在全球范圍內,PCOS的發病率在2%至26%之間[2],而在我國育齡期婦女患病率為5.6%[3]?；加蠵COS的女性,除了生殖系統問題外,往往還會伴隨其他代謝方面的異常,例如糖耐量下降、二型糖尿病風險增加、血脂水平異常、高血壓風險升高等,這些因素長期累積可能會增加代謝綜合征和心血管疾病的風險。西醫主要以對癥治療為主,且需要進行長期的健康管理。大多數西藥都含有單一的活性成分,能進行靶向性治療,但是PCOS的發病機制相對復雜,西藥治療PCOS具有很多局限性[4]。中醫藥在治療上具有多靶點、多途徑和多環節的明顯特點,因此,如何運用中醫藥改善PCOS患者的卵巢病變,調節激素分泌和維持代謝平衡,是重點研究方向之一。

中藥材當歸來源于傘形科植物當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。有研究發現,當歸含有黃酮類、香豆素類和酚酸類等物質,具有抗炎、抗氧化、調節腸道菌群等多種功能,能夠防治代謝性疾病[5-6]。臨床用藥規律分析表明,當歸是治療PCOS中藥處方中的核心藥物,使用頻率很高[7]。研究表明[8-9],PCOS疾病及相關并發癥與卵巢氧化應激失衡密切相關,而Keap1/Nrf2/HO-1通路是調控氧化應激的重要信號通路[8-9]。因此,本實驗用來曲唑聯合高脂飲食誘導大鼠PCOS模型,檢測當歸醇提物(ethanol extract ofAngelicaeSinensisRadix,EEA)對PCOS大鼠激素、血脂和氧化應激相關指標的影響,同時關注Keap1/Nrf2/HO-1信號通路相關蛋白和基因表達,闡明EEA改善PCOS的潛在機制,為EEA用于臨床治療PCOS提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物本研究SD雌性大鼠(180±20 )g購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司,生產許可證號為SCXK(湘)2020-0006。本實驗獲得桂林醫學院動物倫理委員會批準,批準號GLMC20210039。

1.2 材料與試劑

1.2.1實驗藥物 來曲唑(K26O10H101137)購自上海源葉生物科技有限公司;二甲雙胍(1115-70-4)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。本研究所用當歸采自甘肅岷縣,經桂林醫學院藥物研究所張可鋒教授鑒定為當歸Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根。EEA提取方法:將當歸粉末與60%乙醇按1 ∶10(kg·L-1)的比例混合。將混合物浸入圓底燒瓶中4 h,進行2 h的熱回流萃取,過濾混合物以收集濾液,使用相同的方法再次提取殘渣。合并濾液旋轉蒸發濃縮至1.0 kg·L-1的生藥濃度(當歸粉末的重量除以溶液的體積)。使用安捷倫1260 Infinity II液相色譜儀和Waters ACQUITY UPLC?BHE C18色譜柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm),應用標準品對EEA的組成進行鑒定,結果表明,EEA中含有綠原酸、阿魏酸、洋川芎內酯Ⅰ、洋川芎內酯Ⅱ、洋川芎內酯Ⅲ、阿魏酸松柏酯、藁本內酯和丁烯基苯酞(Fig1)。

Fig1 UPLC chromatograms of standard (A) and EEA (B)

1.2.2實驗試劑 睪酮(testosterone, T)(MM-0577R1)、卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)(MM-0566R1)、黃體生成素(Luteinizing hormone, LH)(MM-0624R1)、雌二醇(estradiol, E2)(MM-0575R1)的ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業有限公司;超氧化物歧化酶(superoxide Dismutase, SOD)(20210126)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)(20210320)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)(20210222)試劑盒購自南京建成生物工程研究所;甘油三酯(triglyceride, TG)(A110-1-1)、總膽固醇(total cholesterol, TC)(A111-1-1)、低密度脂蛋白膽固醇(Low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)(A112-1-1)和高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)(A113-1-1)的測試盒購自南京建成生物工程研究所;30%丙烯酰胺(A1010)、過硫酸銨(A1030)、十二烷基硫酸鈉(S1010)、封閉液(SW3015)、Marker(PR1920)和發光液(SW2040)購自上海碧云天生物技術有限公司;TRIzol試劑(P118)、cDNA第一鏈合成試劑盒(A214)和預混實時熒光定量快速PCR反應體系(A301)購自北京康潤誠業生物科技公司。一抗Keap1(18496-1-AP)、Nrf2(16396-1-AP)、HO-1(19937-1-AP)、GAPDH(10016192)購自Proteintech公司。二抗辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠(ZB-2305)和山羊抗兔(ZB-2301)購自中杉金橋公司。

1.3 儀器FRESCO 21高速冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司);HM315R型切片機(德國MICROM);POWERPAC BASIC POWER SUPPLY型電泳儀電源、Mini-Protean Tetra Cell型蛋白電泳系統和轉印系統(BIO-RAD公司);BX51顯微鏡(日本OLYMPUS);Epoch型酶標儀(美國Bio-Tek);Tanon 3500全自動數碼凝膠成像分析系統(上海天能公司)。

2 方法

2.1 實驗分組與處理大鼠適應性喂養1周,隨機分為正常組、模型組、二甲雙胍組(300 mg·kg-1)、EEA低、中、高劑量組(200、400、800 mg·kg-1)(以生藥量計,給藥劑量是將臨床成人劑量轉換為大鼠劑量獲得),每組10 只。第1～4 周,正常組標準飲食,每天灌胃1%羧甲基纖維素鈉(carboxymethylcellulose sodium, CMC-Na)溶液,其余各組喂食高脂飲食,每天灌胃含有來曲唑(1 mg·kg-1)的1% CMC-Na溶液;第5～8周,給藥組灌胃對應藥物,正常組和模型組給予等體積的蒸餾水。禁食不禁水16 h,麻醉大鼠后采集血液并收集卵巢。將左側卵巢保存到-80 ℃液氮中,右側卵巢用4%多聚甲醛溶液固定。

2.2 蘇木精-伊紅(HE)染色檢查大鼠卵巢組織病變在多聚甲醛溶液中固定48 h后的卵巢組織,依次經過脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精和伊紅染色,中性樹膠封片后在顯微鏡下觀察病理情況。

2.3 酶聯免疫吸附法(ELISA)檢測血清中T、FSH、LH和E2的含量將采集的血液常溫靜置1.5 h后,用低溫離心機以5 000 r·min-1離心12 min,收集血清后按照試劑盒說明書指示,檢測并計算血清中T、FSH、LH和E2含量。

2.4 生化法檢測血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量收集血清后按照試劑盒說明書指示,檢測并計算血清中TG、TC、LDL-C和HDL-C含量。

2.5 生化法檢測卵巢組織中SOD、GSH-Px、MDA的活性或含量用組織勻漿機加生理鹽水制備10%卵巢組織勻漿,離心后取上清液,按照試劑盒說明書步驟檢測并計算此3種因子的活性或含量。

2.6 蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測Keap1、Nrf2和HO-1的蛋白表達選取正常組、模型組和EEA高劑量組卵巢組織進行檢測,首先使用配置好的裂解液(PMSF:RIPA=1 ∶100)制備5%卵巢組織勻漿,制備蛋白樣本,將蛋白樣本進行電泳分離,在300 mA恒定電流下轉膜1 h,然后進行轉膜和封閉,在一抗中孵育過夜,一抗孵育濃度分別為:HO-1(1 ∶5 000)、Nrf2(1 ∶5 000))、Keap1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶ 2000)。最后,二抗(稀釋比1 ∶4 000)孵育2 h后進行化學發光顯影。采用ImageJ軟件標定蛋白條帶的灰度值,以GAPDH為內參,得到目的蛋白的相對表達值;本實驗數據相對表達值均以正常組為標準做歸一化處理。

2.7 實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測Keap1、Nrf2和HO-1的mRNA表達用TRIzol試劑裂解卵巢組織,在4 ℃離心后,獲得總RNA。定量后根據試劑盒說明書進行逆轉錄,最后根據SYBR試劑盒的反應條件在Quant Studio3 PCR儀上擴增。根據CT值計算2-ΔΔCT,并以GAPDH為參照,對各組的表達進行歸一化處理,計算相對表達。PCR引物為Keap1:上游5′-TGCCCCTGTGGTCAAAGTG-3′,下游5′-GGTTCGGTTACCGTCCTGC-3′;Nrf2:上游5′-TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT-3′,下游5′-GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC-3′;HO-1:上游5′-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3′,下游5′-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3′;內參GAPDH:上游5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。

3 結果

3.1 EEA對PCOS大鼠病理形態的影響陰道涂片結果顯示(Fig2),正常組大鼠表現為有規律的動情周期,依次為動情前期、動情期、動情后期和動情間期;而造模14 d后模型組大鼠基本處于動情間期(Tab1),提示動情周期出現紊亂。卵巢形態可以看出(Fig3),與正常組相比,模型組能明顯觀察到卵巢多囊樣變;與模型組相比,治療組多囊樣變得到改善。HE染色結果顯示(Fig4),與正常組比較,模型組大鼠卵巢組織中顆粒細胞層明顯減少,囊狀擴張明顯,黃體數量明顯減少;與模型組比較,二甲雙胍組、EEA中、高劑量組囊狀擴張得到改善,顆粒細胞層數明顯增加,且黃體數目增加。為了確定EEA在改善PCOS的同時是否對其他器官有毒性,對EEA高劑量組的腦、心、肺、肝、脾和腎進行了HE染色。結果顯示(Fig5)EEA高劑量組腦、心、肺、肝、脾和腎組織細胞結構清晰,無明顯病理學變化,這證實EAA可改善PCOS,且對大鼠主要器官無明顯毒副作用。

Tab1 Effect of EEA on letrozole-induced estrous cycle grading in PCOS rats(number)

Fig2 Rat vaginal smear during estrous cycle(Pap staining, ×100)

Fig3 Morphology of rat ovaries

Fig4 Effect of EEA on ovarian pathology in PCOS rats induced by letrozole(HE staining, ×40)

Fig5 Effect of EEA on pathology of important organs in PCOS rats(HE staining, × 100)

3.2 EEA對PCOS大鼠模型血清中T、FSH、LH和E2的影響與正常組相比,模型組血清中LH、LH/FSH和T含量升高,E2含量明顯減少(P<0.05或P<0.01);與模型組相比,二甲雙胍組、EEA中劑量組和EEA高劑量組大鼠血清中LH、LH/FSH和T含量下降,且E2含量明顯增加(P<0.05或P<0.01)(Tab2)。

Tab2 Effect of EEA on levels of T, E2, LH, and FSH in serum of PCOS rat n=10)

3.3 EEA對PCOS大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C含量的影響與正常組相比,模型組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量明顯升高,而HDL-C含量明顯降低;與模型組相比,二甲雙胍組和EEA中、高劑量組大鼠血清中TG、TC、LDL-C含量明顯降低,而HDL-C含量明顯升高(P<0.01)(Tab3)。

Tab3 Effect of EEA on serum levels of TG, TC, LDL-C and HDL-C in PCOS n=10)

3.4 EEA對PCOS大鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px、MDA活性或含量的影響與正常組相比,模型組大鼠卵巢組織中SOD、GSH-Px活性明顯降低、MDA含量明顯升高;與模型組相比,二甲雙胍組和EEA中、高劑量組卵巢組織中SOD、GSH-Px活性明顯升高,MDA含量明顯降低(P<0.01)(Tab4)。

Tab4 Effect of EEA on SOD, GSH-Px activity, and MDA content in ovarian tissue of PCOS rat n=10)

3.5 EEA對PCOS大鼠卵巢中Keap1、Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達的影響與正常組相比,模型組大鼠卵巢組織中Keap1蛋白和mRNA表達明顯上調,而Nrf2和HO-1 蛋白和mRNA表達明顯下調(P<0.01);與模型組比較,二甲雙胍組、EEA中劑量組和EEA高劑量組中Keap1蛋白和mRNA表達明顯下調,而Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達明顯上調(P<0.01)(Fig6,Tab5和Tab6)。

Tab5 Effect of EEA on expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 proteins in ovarian tissue of PCOS n=3)

Tab6 Effect of EEA on mRNA expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 in ovarian tissue of PCOS n=3)

Fig6 Effect of EEA on expression of Keap1, Nrf2, and HO-1 proteins in ovarian tissue of PCOS rats

4 討論

PCOS的發生率約為10%,是導致排卵異常的最常見原因,且通常伴有胰島素抵抗,并與糖尿病和卵巢癌癥等疾病的高風險相關。PCOS對育齡婦女的身心健康有嚴重影響,青少年PCOS患者更易出現抑郁和焦慮[10]。然而,PCOS病因復雜,其潛在機制尚不明確,目前尚無根治PCOS的特效藥物。

來曲唑通過抑制芳香化酶的活性,阻斷雄激素向雌激素的轉化,導致體內雄激素,特別是卵巢內雄激素水平升高,高濃度的雄激素影響卵巢功能,引起排卵障礙和卵巢多囊癥的發生[11]。T通過影響卵泡內顆粒細胞的分化和功能發揮,如類固醇分泌等,從而干擾卵泡發育的正常過程,可能導致卵泡異?；虬l育不全[12]。本研究中,在來曲唑聯合高脂飲食誘導的大鼠中觀察到模型組大鼠動情周期紊亂,T、LH和LH/FSH明顯增加,E2含量明顯降低,而TG、TC、LDL-C含量明顯升高,HDL-C含量明顯降低,這與同類研究相一致[13],說明建模成功?；钚匝醯钠胶庠谂陨诚到y的幾個過程中發揮著重要的生理作用,包括卵子成熟、排卵和受精等[14]。各種研究表明,氧化應激是影響PCOS患者的另一個系統性問題[15]。當機體內的氧化還原平衡被破壞時,活性氧產生增多,導致SOD和GSH-Px活性下降,無法及時清除產生的活性氧,MDA水平升高累積,高濃度的MDA對組織細胞產生毒性傷害,從而影響機體的正常功能[16]。本實驗研究結果顯示,經過EEA治療后,PCOS大鼠動情周期恢復正常,肉眼也可治療組大鼠多囊樣變減輕,顯微鏡下觀察發現卵巢組織顆粒細胞層數增多,卵泡囊狀擴張明顯好轉;T、LH和LH/FSH水平降低,E2含量明顯升高,TG、TC、LDL-C含量明顯降低,HDL-C含量明顯升高,SOD、GSH-Px的活性明顯升高,MDA含量明顯降低。因此,我們推測EEA緩解大鼠PCOS的作用可能與調節血脂和抑制氧化應激有關。

目前研究表明,機體對抗氧化應激的保護機制主要來源于兩方面:一方面是抗氧化酶可以清除活性氧;另一方面是Nrf2/HO-1抗氧化信號通路的激活,它可以增強細胞自身抗氧化能力來抵御氧化損傷,這兩種途徑共同構成了機體抵御氧化應激的主要保護機制[17]。在正常生理條件下,Nrf2與Keap1結合;當細胞受到氧化應激刺激時,Nrf2被激活,從Keap1分離,從細胞質轉移到細胞核,并誘導HO-1的表達,激活HO-1可以增強細胞自身的抗氧化能力,清除活性氧,從而發揮抑制氧化應激的積極作用[18]。本研究Western bolt和qRT-PCR結果表明,與正常組相比,模型組大鼠卵巢組織中Keap1蛋白和mRNA表達明顯上調,而Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達明顯下調;在經過EEA治療后,PCOS大鼠卵巢組織中Keap1蛋白和mRNA表達明顯下調,而Nrf2和HO-1蛋白和mRNA表達明顯上調。這表明EEA可以發揮抗氧化應激的保護作用,從而緩解PCOS大鼠卵巢組織損傷。

綜上,EEA能夠有效緩解大鼠PCOS,抑制卵巢組織氧化應激,其作用機制可能與Keap1/Nrf2/HO-1信號通路有關(Fig7)。本研究可為EEA的臨床應用提供新思路。

Fig7 EEA improved PCOS through Keap1/Nrf2/HO-1 signaling pathway