基于TLR2/MyD88/NF-κB信號通路探討加味少腹逐瘀湯對寒濕瘀結證子宮內膜異位癥痛經小鼠腹腔炎癥微環境干預作用

黃燦燦,毛海燕,吉秀家,連小龍,張作良,陳元歡,岳斌,張小花,申劍,武權生

(1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院,2.甘肅省人民醫院,甘肅 蘭州 730000;3.青海大學醫學部,青海 西寧 810016)

子宮內膜異位癥(endometriosis,EMT)是指具有生長功能的子宮內膜組織(腺體和間質)出現在子宮體腔以外部位的一種疾病。EMT的核心病理機制是隨著卵巢功能周期性的變化,異位內膜發生周期性剝脫及出血,規律且進行性加重的痛經及慢性盆腔疼痛是EMT最主要的臨床表現[1]。目前造成EMT痛經的機制尚不清楚且臨床缺乏理想的根治手段[2],因此,探究EMT的致痛機制,尋求合理高效的治療方案一直是臨床防治EMT痛經的重點。EMT被認為是一種慢性炎癥性疾病,研究表明慢性炎癥反應可能造成EMT痛經最為直接的關鍵因素,異位內膜的侵襲和種植、性激素異常(雌激素優勢、孕激素抵抗等)、免疫功能紊亂等因素均可以加重局部的炎癥反應并刺激大量致痛因子的釋放,進而加重EMT的疼痛狀態,同時內異癥患者血清炎癥因子與盆腔粘連程度和痛經程度呈正相關[3]。故探尋相關炎癥通路和靶向干預效應蛋白一直是EMT防治的熱點。Toll樣受體2 (Toll-like receptor 2,TLR2) /髓樣分化因子88(myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88)/核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)作為一條重要的炎癥通路,其可介導心絞痛、骨關節痛、三叉神經痛、盆腔炎性疼痛等多種疼痛的發生[4-5],因此,靶向TLR2/MyD88/NF-κB信號通路或可成為EMT痛經防治的新方向。中醫學認為,EMT痛經屬于“經行腹痛”“癥瘕”范疇,其基本病機可概括為兩個方面:一為氣血不通,胞脈瘀滯而作痛;二為陽虛不足,溫煦失司而為痛。針對這兩大病機,課題組前期提出“溫腎暖宮以除冷積、化瘀通滯以消癥瘕”的治療原則,運用加味少腹逐瘀湯治療,收效顯著[6]。然而加味少腹逐瘀湯是否通過調控TLR2/MyD88/NF-κB信號通路發揮拮抗EMT痛經的作用,目前尚未見相關報道。故本研究以加味少腹逐瘀湯對EMT小鼠模型進行干預,旨在探討該方是否通過對TLR2/MyD88/NF-κB信號通路相關蛋白及腹腔微環境的調控發揮拮抗EMT痛經的干預效應,為加味少腹逐瘀湯防治EMT痛經的推廣運用提供分子生物學依據。

1 材料

1.1 動物選用6～8周齡BALB/c雌性小鼠共74只,體質量(18～20) g,購自斯貝福(北京)生物技術有限公司(SCXK(京)2019-0010),飼養于甘肅中醫藥大學SPF級動物房(許可證號:SYXK(甘)2021-0004)。所有小鼠適應性飼養1周。實驗操作均嚴格遵照動物倫理相關規定執行并通過甘肅中醫藥大學動物中心倫理委員會批準(2022-056)。

1.2 藥物與試劑加味少腹逐瘀湯(川芎6 g,五靈脂6 g,赤芍6 g,小茴香1.5 g,官桂3 g,干姜3 g,延胡索3 g,沒藥6 g,當歸9 g,生蒲黃9 g,三棱3 g,莪術9 g、土鱉蟲3 g、紫石英9 g)購自甘肅中醫藥大學附屬醫院,以1 ∶10藥水比將藥物浸泡于蒸餾水中2 h,按常法煎煮2次,每次30 min,濾出藥液加熱濃縮至每1 mL藥液含生藥1 g,高溫滅菌冷卻后置4 ℃冰箱備用,使用時稀釋至所需濃度;孕三烯酮(上海麥克林生化科技有限公司,批號:C10681333);預染Marker(YESEN,20351ES72);RIPA裂解液(R0010)、BCA蛋白定量試劑盒(PC0020),購自北京索萊寶公司;抗TLR2(Bioss公司,bs-1019R),山羊抗兔IgG(RS0002)、抗MyD88(YT2928)、抗NF-κB(YT3108)、抗p-NF-κB(YP0191)、抗GAPDH均購自Immunoway公司。白介素6(Interleukin 6,IL-6)試劑盒(JC00632)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)試劑盒(JC00325)、前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)試劑盒(JC00745)、雌二醇(Estradiol,E2)試劑盒(YJ001962)、孕激素(Progesterone,P)試劑盒(YJ057778)均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 儀器Western blot電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司,型號:JY-SCZ2+),實時定量PCR儀(西安天隆科技有限公司,型號:Gentier 96R),酶標儀(美國Thermo公司,型號:Multiskan Mk3)。

2 方法

2.1 模型構建適應性喂養后隨機選取8只作假手術組(Sham)。其余66只小鼠按照1 ∶2的比例隨機分為受體組44只,供體組22只,每只供體小鼠,構建2只模型小鼠。采用異體種植腹腔注射法構建EMT痛經模型[7]:造模前,所有小鼠頸背部皮下注射苯甲酸雌二醇(150 μg·kg-1),每4 d 1次以統一動情周期,共用兩次,頸椎脫臼處死供體小鼠,迅速取出小鼠子宮于4 ℃生理鹽水中清洗后沿中線等分為二,分別置于盛有0.5 mL 1×PBS培養皿中,將培養皿置于冰上將子宮縱向剖開并剪碎為體積約1 mm3的碎片,采用1 mL注射器配20 mL針頭將0.5 mL子宮碎片于尿道口正上方約0.5 cm處注入受體小鼠下腹部,注射后輕按針孔后涂抹紅霉素預防感染。假手術組亦于造模當日腹腔注射等體積PBS;同時模型各組采用冷水浴法構建寒濕瘀結證模型[8]:于造模第1天下午3點將小鼠置于冷水中水浴,水溫保持(5±1)℃,持續10 min,連續干預21 d。造模第21天,隨機選取4只小鼠,頸椎脫臼處死,開腹觀察異位病灶,確定造模成功與否。

2.2 分組及藥物干預建模成功后將模型小鼠分為5組,B組:模型組(Model)、C組:中藥低劑量組(JWSFZYT-L)、D組:中藥中劑量組(JWSFZYFT-M)、E組:中藥高劑量組(JWSFZYT-H)、F組:陽性藥物組(Gestrinone),每組8只。持續灌胃干預15 d。假手術組及模型組每日蒸餾水灌胃,給藥濃度按照人與小鼠體表面積等效計量換算得出,以等效劑量作為中劑量給藥濃度,兩倍計量為高劑量給藥濃度,二分之一劑量為低劑量給藥濃度,得出中藥高、中、低劑量組每天分別給予19.8、9.9、5.0 g·kg-1劑量的加味少腹逐瘀湯灌胃1次,共干預15 d。陽性對照組給予孕三烯酮組(0.325 mg·kg-1)灌胃,每3 d 1次,共15 d。第15日給藥后,給予縮宮素注射,觀察各組小鼠扭體反應次數。

2.3 標本制備與采集給藥結束,禁食24 h后取材。經0.3%戊巴比妥鈉10 mL·kg-1劑量行腹腔注射麻醉后,立刻打開腹腔,仔細檢查腹腔粘連程度及病灶?？瞻捉M取子宮,其余各組剝離全部內異灶組織用生理鹽水沖洗干凈并稱重(干重)。取一部分組織固定于10%多聚甲醛溶液中,一部分置于凍存管中,放入-80℃冰箱中凍存,用于指標檢測。

2.4 觀察指標

2.4.1自主活動檢測 藥物干預第15天上午灌胃結束后30 min,檢測各組小鼠自主活動能力,于自主活動儀中適應3 min后檢測5 min內站立次數。

2.4.2糞便含水率檢測 于藥物干預第15天下午,將小鼠禁食水2 h后,收集4 h糞便,稱取濕重后置于(60 ℃)干燥恒溫箱內干燥24 h,稱取干重。稱重后將糞便再次烘干1 h后二次稱重,兩次重量之差控制于3 mg之內,即可計算糞便含水量。糞便含水率=(糞便濕重-糞便干重)/糞便濕重×100%。

2.4.3熱板試驗 藥物干預第15天上午自主活動能力檢測后30 min,將各組小鼠置于熱板儀(溫度55 ℃)上記錄兩次舔足時間的平均值為熱痛潛伏期。

2.4.4組織病理學評價 于藥物干預后的第16天上午取材,當天進行腹腔粘連程度評價;異位病灶取出后測量異位灶的體積和總重量;子宮及異位病灶用4%多聚甲醛溶液固定,石蠟包埋。切片后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色。HE染色觀察異位病灶的細胞形態,免疫組化染色檢測NF-κB表達情況,圖像分析使用ImageJ軟件。

2.4.5實時熒光定量PCR檢測 取新鮮的內異灶組織(假手術組取子宮組織)于離心管中,使用TRIzol法進行組織總RNA的提取,超微光分光光度計檢測樣品濃度。按步驟進行逆轉錄和擴增,擴增后將得到的Ct值采用2-ΔΔCT法計算目的基因的mRNA相對表達量。具體引物見Tab1。

Tab1 Information of primer sequences

2.4.6Western blot檢測 取異位病灶組織,剪碎后裂解,冰上研磨30 min,離心后取上清液,加緩沖液,加熱變性后采取BCA法測定蛋白濃度;配膠、上樣、電泳、轉膜后封閉。一抗孵育過夜(4 ℃):TLR2、MyD88、NF-κB、p-NF-κB(均以1 ∶1 000稀釋)、GAPDH(1 ∶2 000);TBST洗膜后加山羊抗兔IgG二抗(1 ∶3 000);ECL法顯影,ImageJ測量灰度值及目標蛋白表達量。

2.4.7ELISA檢測 戊巴比妥鈉麻醉后,采用眼球取血法取小鼠外周血1 mL,離心取上清,按照試劑盒說明書步驟操作,檢測小鼠外周血IL-6、TNF-α、PGE2、E2、P含量。

3 結果

3.1 加味少腹逐瘀湯可以改善模型小鼠證候表現

3.1.1自主活動檢測 與假手術組相比,模型組小鼠自主活動次數明顯減少(P<0.01);與模型組相比,加味少腹逐瘀湯高劑量組可以明顯增加模型小鼠自主活動次數(P<0.01);其余各組與模型組之間無統計學差異(P>0.05)。見Tab2。

Tab2 Comparison of autonomous activity,fecal water content,

3.1.2糞便含水率檢測 與假手術組相比,模型組小鼠糞便含水量明顯增加(P<0.01);與模型組相比,加味少腹逐瘀湯高劑量組可以顯著降低模型小鼠糞便含水量(P<0.01);其余各組與模型組之間無統計學差異(P>0.05)。見Tab2。

3.1.3熱痛潛伏期比較 與假手術組相比,模型組小鼠熱痛潛伏期明顯縮短(P<0.01),與模型組相比,除中藥低劑量組外,干預各組小鼠熱痛潛伏期均較模型組有所延長(P<0.05,P<0.01),且以中藥高劑量組和陽性藥物組明顯(P<0.01)。見Tab2。

3.2 加味少腹逐瘀湯可以減小異位病灶及異位子宮的大小取材時模型小鼠腹腔內可見形態不規則大小不等的異位灶,病灶多呈半透明的囊性包塊,包塊常與周圍組織粘連且囊壁充滿新生小血管;異位灶多位于大網膜,還可能侵犯腹壁、子宮、腸壁、卵巢等部位(Fig1)。病灶直徑范圍1～9 mm不等,其中模型組病灶直徑較大,中藥高劑量組及陽性對照組病灶直徑較小(Fig2)。測量各組小鼠子宮體積并對各組異位病灶進行稱重比較異位病灶總重量,結果顯示:與模型組相比,藥物干預后各組小鼠子宮體積及異位灶均較模型組有所減小,且以陽性對照組和中藥高劑量組減小明顯(P<0.01)。見Fig2、Fig3。

Fig1 Location and morphology of ectopic lesions in mice

Fig2 Comparison of uterine volume of mice in each

Fig3 Comparison of volume and total weight of ectopic lesions in each

3.3 加味少腹逐瘀湯可以緩解模型小鼠病理損傷假手術組取子宮組織,其結構層次正常,病理可見單層柱狀上皮,偶見點狀壞死,固有層子宮腺數量豐富,可見少量淋巴細胞散在浸潤;模型組小鼠異位組織可見與假手術組相似的單層柱狀上皮及間質,且結構明顯異常,內膜腺體周邊可見明顯炎癥細胞浸潤;腺體下可見核下空泡;治療后,除低劑量組外,其余各治療組異位灶病理顯示損傷有顯著好轉,其中以中藥高劑量組和陽性藥物組改善最為明顯。見Fig4。

Fig4 Comparison of pathological features of ectopic lesions in each group of mice(×200)A:Sham;B:Model;C:JWSFZYT-L;D:JWSFZYT-M; E:JWSFZYT-H; F:Gestrinone.

3.4 加味少腹逐瘀湯可以降低模型小鼠異位病灶NF-κB的表達與假手術組相比,模型組小鼠異位灶組織、胞質、胞核中NF-κB的表達明顯增高,與模型組相比,各給藥組異位灶組織、胞質、胞核中NF-κB的表達有所降低,以陽性藥物組和中藥高劑量組表達降低最為明顯。見Fig5。

Fig5 Comparison of expression of NF-κB in heterotopic lesions of mice in each group A:Sham;B:Model;C:JWSFZYT-L;D:JWSFZYT-M; E:JWSFZYT-H; F:Gestrinone.

3.5 加味少腹逐瘀湯對TLR2/MyD88/NF-κB信號通路mRNA的影響與假手術組相比,模型組小鼠異位組織TLR2、MyD88、NF-κB mRNA表達量明顯增加(P<0.01),與模型組相比,除中藥低劑量組外,各給藥組TLR2、MyD88、NF-κB mRNA的表達量降低,以陽性藥物組和中藥高劑量組下降最為明顯(P<0.01)。見Fig6。

Fig6 Comparison of mRNA relative expression levels of TLR2,MyD88 and NF-κB in heterotopic lesions of mice in each

3.6 加味少腹逐瘀湯對TLR2/MyD88/NF-κB信號通路蛋白的影響與假手術組相比,模型組小鼠異位組織TLR2、MyD88、p-NF-κB 表達量明顯增加(P<0.01),與模型組相比,各給藥組TLR2、MyD88、p-NF-κB的表達量降低(P<0.05,P<0.01),以陽性藥物組和中藥組高劑量組下降最為明顯(P<0.01)。各組小鼠異位灶中NF-κB蛋白表達無明顯差異。見Fig7。

Fig7 Comparison of heterotopic lesions TLR2,MyD88,NF-κB,P-NF-κB in each

3.7 加味少腹逐瘀湯對血清炎癥因子的影響與假手術組相比,模型組小鼠血清IL-6、TNF-α、PGE2水平明顯增高(P<0.05),與模型組相比,各給藥組血清IL-6、TNF-α、PGE2水平均有所降低(P<0.05,P<0.01),以陽性藥物組和中藥高劑量組下降最為明顯(P<0.05)。見Fig8。

Fig8 Comparison of serum levels of IL-6,TNF-α and PGE2 in each

3.8 加味少腹逐瘀湯對血清E2、P的影響與假手術組相比,模型組小鼠血清E2水平升高(P<0.05)、P水平下降(P<0.05),與模型組相比,給藥后各組血清E2水平有所降低、P水平有所升高,但僅陽性藥物組和中藥高劑量組變化有統計學差異(P<0.05)。見Fig9。

Fig9 Comparison of serum E2 and P levels in each group of

4 討論

EMT作為一種婦科常見病,常伴隨著嚴重的慢性疼痛,該病疼痛以漸進性加重的痛經和慢性盆腔痛最為典型,目前EMT痛經發病機制尚不完全清楚,研究證實,炎癥反應在EMT病程進展中發揮著重要作用,慢性炎癥刺激亦是引起EMT局部免疫細胞聚集、致痛因子分泌、新血管生成、組織纖維化粘連的重要因素,而這些病理過程均可促進慢性疼痛的發生[9]?，F代醫學對于EMT痛經的治療主要以口服藥物為主,常選擇非甾體類抗炎鎮痛藥、性激素制劑,疼痛嚴重者可選擇手術治療;然而口服西藥僅能短暫緩解疼痛,手術治療存在復發率高的缺點[10],因此,尋求理想控制EMT痛經的方案已成為臨床亟待解決的問題。研究表明中醫藥在防治EMT痛經方面表現出獨特的優勢。大量臨床證據顯示溫腎化瘀法可以有效緩解EMT患者的慢性疼痛[11],并改善中醫證候。課題組前期致力于中醫藥防治婦科血瘀證的研究,臨床運用加味少腹逐瘀湯治療EMT痛經療效顯著[12],本次實驗結果亦證實,加味少腹逐瘀湯在改善自主活動次數、大便含水量及熱痛潛伏期等證候表現方面有較好的作用,但該方作用機制有待進一步探索。

IL-6是由多種細胞分泌的具有免疫調節功能的細胞因子,其具有調節免疫細胞功能、刺激局部炎癥反應,促進組織粘連和纖維化等作用[13],其還參與慢性炎癥的形成。研究表明TNF-α是一種多能性的細胞因子,其與神經性疼痛、炎性疼痛 、癌痛等多種疼痛有直接關系;在炎性疼痛形成過程中TNF-α可引起血管內皮損傷和局部微血栓形成,而刺激局部組織的出血、壞死,同時,TNF-α還可以促進中性粒細胞黏附和吞噬功能,加重局部炎癥狀態,促進炎性致痛因子分泌,進而加劇炎性疼痛[14]。PGE2是一種常見的致痛炎癥因子,研究表明,PGE2與痛經嚴重程度呈正相關,這可能與PGE2誘發超敏反應增加末梢神經元的興奮性有關,PGE2還可以通過激活TRPV1、CaV1.4及Nav1.8 等離子通道,增加神經元的敏感性,介導慢性疼痛的發生[15]。本研究結果顯示,加味少腹逐瘀湯可以降低血清中致痛炎癥因子IL-6、TNF-α、PGE2水平,這可能是改善EMT痛經的直接原因。

NF-κB信號通路是炎癥反應的主要調節通路之一,研究表明該信號通路在EMT病變中過度活躍,并參與介導了EMT的發作、進展和復發,EMT病灶的形成,會激活NF-κB相關通路誘導產生免疫細胞監視,長時間的作用下進而形成慢性炎癥反應,促進IL-6、TNF-α、PGE2等致痛因子的高表達[16]。此外,EMT作為一種雌激素依賴性疾病,疾病發生過程中還會出現雌激素受體-β和孕激素受體的畸變,這些受體改變亦會加重NF-κB介導的局部炎癥反應,進而促進炎性疼痛的加劇,本研究結果顯示,模型組小鼠外周血存在雌激素水平增高及孕激素水平下降的現象,加味少腹逐瘀湯可以降低血清中E2水平并恢復P水平;而NF-κB表達降低與外周血E2及P水平的恢復呈正相關,因此,靶向NF-κB信號通路防治EMT痛經已逐漸成為研究的熱點。Toll樣受體 (Toll-like receptors,TLRs)是最早被發現的天然免疫模式識別受體,其中TLR2可以在局部炎癥浸潤、超敏反應、病原體侵襲等條件下被激活,從而發揮免疫監視及清除病原體的作用[17]。銜接蛋白MyD88與TLR2相結合后可激活下游NF-κB信號通路從而促進炎癥反應的發生[18],因此,TLR2/MyD88/NF-κB信號通路或可稱為防治EMT痛經的關鍵靶點,本研究結果顯示加味少腹逐瘀湯可顯著TLR2/MyD88/NF-κB相關基因和蛋白的表達,從而發揮拮抗慢性炎癥反應的作用。

本研究發現陽性對照藥物孕三烯酮作為臨床指南推薦的治療EMT的非甾體類孕激素藥物,亦可以調控TLR2/MyD88/NF-κB信號通路,改善模型小鼠的炎癥反應。其作用機制可能是通過結合異位灶孕激素受體,進而降低外周血E2水平,同時抑制下丘腦-垂體-靶腺軸降低雌激素水平,抑制異位病灶的生長,從而降低局部炎癥反應而實現的。

綜上所述,加味少腹逐瘀湯可以通過抑制TLR2/MyD88/NF-κB信號通路,改善局部炎癥微環境,降低炎癥因子IL-6、TNF-α、PGE2的表達,調節性激素水平,從而達到改善證候表現及痛經狀態。