鐵死亡在骨代謝中的調控機制

文皓楠,王 凱,海云翔,董萬濤,宋志靖,宋 敏,3

(1.甘肅中醫藥大學中醫臨床學院,甘肅 蘭州 730000,2.甘肅中醫藥大學附屬醫院運動醫學科,甘肅 蘭州 730020;3.甘肅中醫藥大學附屬醫院老年骨科,甘肅 蘭州 730020)

骨質疏松癥(osteoporosis,OP)是一種由于各種因素導致的骨代謝平衡遭到破壞的慢性、全身性骨病,以骨密度降低和骨骼脆性增加為主要病理表現,目前,OP已經成為我國五十歲上人群的要健康問題,后期可導致脆性骨折,給家庭和社會帶來了沉重的負擔[1]。鐵死亡(ferroptosis)是一種以鐵依賴性脂質過氧化物積累為其特性的新型程序性細胞死亡模式,近年來受到醫學領域的廣泛關注。研究發現,鐵死亡在調節OP發生、發展過程中發揮著關鍵作用。本文以“Ferroptosis”、“Bone metabolism”、“Osteoporosis”為關鍵詞檢索英文數據庫PubMed、Cochrane、Embase、Web of Science,以“鐵死亡”、“骨質疏松癥”、“骨代謝”為關鍵詞檢索中文數據庫萬方(WANFANG DATA)、中國知網(CNKI)、維普(VIP),檢索2012年至今的相關文獻,對鐵死亡在骨代謝領域取得的突破進行綜述,探討鐵死亡的潛在機制以及其在不同骨穩態相關細胞中的調節作用,以期揭示OP的潛在治療機制,拓展臨床防治思路。

1 鐵死亡特征及概述

鐵死亡正式命名于2012年,stockwell等在前期研究的基礎上,根據其鐵依賴和氧化損傷的特性,將Erastin和RAS選擇性致死化合物3(RAS-selective lethal 3,RSL3)誘導的非凋亡性細胞死亡(non-apoptotic cell death process)正式命名為鐵死亡,其與其他細胞死亡的區分主要提現在以下方面:線粒體脊減少甚至消失是其主要的形態學特征,細胞內谷胱甘肽(glutathione,GSH)減少,谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)活性降低造成的細胞抗氧化能力減弱以及Fe2+在細胞內過度積累導致芬頓反應(Fenton Reaction),使活性氧(reactive oxygen species,ROS)和脂質過氧化物堆積發生過氧化反應是其主要的生化特征[2]。當Fe2+通過芬頓反應催化生成不穩定的羥自由基,參與多不飽和脂肪酸的脂質氧化,產生共軛二烯,進一步導致脂質過氧化產物4-羥基壬烯酸(4-hydroxynonenal,4-HNE)和丙二醛(malondialdehyd,MDA)等的生成,使得整個細胞膜的脆性增加,造成細胞功能減退,最終觸發細胞鐵死亡[3]。

2 鐵死亡的調控機制

2.1 System xc-/GSH/GPX4/ROS軸調控氧化應激(oxidative stress,OS)是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態,當機體在遭受各種有害刺激時,體內高活性分子如ROS產生過多,可導致氧化系統和抗氧化系統失衡,最終導致組織損傷[4],而鐵死亡因其鐵依賴性的脂質過氧化特性,與氧化應激關系密切,一些學者甚至認為鐵死亡是一種特殊的氧化應激損傷模式。System xc-是細胞內重要的抗氧化體系,為細胞表面的異二聚體-谷氨酸/胱氨酸轉運體,其主要作用是實現胞內谷氨酸(glutamat,Glu)和胞外胱氨酸(cystin,Cys2)的互換,Cys2在谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase,GCL)和谷胱甘肽合成酶(glutathione synthetase,GSS)的催化作用下合成GHS和GPX4,二者均是細胞內抗氧化系統的重要組成部分[2]。因此,System xc-的活性的抑制會降低GSH水平和GPX4活性,導致細胞抗氧化能力下降,從而誘導鐵死亡的發生。

2.2 鐵代謝——轉運蛋白與“鐵過載”調控鐵是維持人體正常生命活動的重要微量元素,而鐵代謝異常引發的“鐵過載”是鐵死亡發生的核心環節。在人體內,食物中Fe3+在腸道被還原為Fe2+后被小腸上皮細胞吸收,Fe2+在膜鐵轉運蛋白(ferroportin 1,FPN1)的作用下被運輸至細胞外并被氧化為Fe3+,與轉鐵蛋白(transferrin,TF)結合形成TF-Fe3+復合物后進入血液循環,在到達靶細胞后,TF-Fe3+復合物與細胞膜上的轉鐵蛋白受體1(transferrin receptor 1,TFRC1)結合,通過胞吞的作用進入細胞內并被金屬還原酶STEAP3還原為Fe2+[5]。胞內鐵代謝平衡由Fe2+的儲存和釋放來維持,鐵蛋白溶質載體家族40成員1(solute carrier family 40 member 1,SLC40A1)和鐵蛋白重鏈1(ferritin heavy chain 1,FTH1)和輕鏈1(ferritin light chain 1,FTL1)以轉運和儲存的形式防止胞內鐵過載,而核受體共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)在缺鐵的條件下結合鐵蛋白通過鐵自噬防止胞內缺鐵,若鐵代謝紊亂,過量Fe2+在胞內聚集,發生芬頓反應,產生大量ROS,并與細胞膜上的多不飽和脂肪酸PUFA發生一系列過氧化反應造成細胞膜解體,最終引起鐵死亡[6]。

2.3 脂代謝——多不飽和脂肪酸PUFAs過氧化調控脂質氧化物代謝失調也是造成鐵死亡發生的核心因素。被酯化的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFAs)構成了生物膜的膜磷脂,是鐵死亡中脂質過氧化物積累的關鍵底物,一些含有雙烯丙基氫原子的物質,尤其是花生四烯酸(arachidonoyl,AA)和腎上腺素酸(adrenoyl,AdA),易與ROS發生反應并引起脂質過氧化,產生的脂質過氧化物可破壞磷脂雙分子層的穩定性導致細胞膜的解體[7]。當長鏈脂酰輔酶A合成酶4(long train acyl CoA synthetases 4,ACSL4)催化游離的AA或AdA與輔酶A(coenzyme A,CoA)結合形成衍生物AA-CoA或AdA-CoA,被溶血卵磷脂酰基轉移酶3(recombinant lysophosphatidylcholine acyltransferase 3,LPCAT3)酯化為多不飽和脂肪酸磷脂(poly-unsaturated fatty acids,PL-PUFA),并經過脂氧合酶(arachidonic acid lipoxygenase,ALOXs)或細胞色素P450氧化還原酶(cytochrome P450oxidoreductase,POR)氧化后,則會形成有害的脂質過氧化產物,誘導細胞鐵死亡[8]。

2.4 NADPH/FSP1/CoQ10信號通路System xc-/GSH/GPX4/ROS軸被廣泛認為是鐵死亡的主要調控系統,但有研究發現,存在平行于該系統獨立調控鐵死亡的機制,NADPH/FSP1/CoQ10是首先被發現并最具代表性的調控信號通路。CoQ10是體內唯一能夠自由合成的脂類抗氧化劑。2019年,Doll[9]等發現了一種線粒體凋亡誘導因子2(apoptosis inducing factor,mitochondria associated 2,AIFM2),因其過表達可顯著抑制GPX4沉默誘導的鐵死亡被命名為鐵死亡抑制蛋白1(ferroptosis suppressor protein 1,FSP1)。Kirill Bersuker[10]等發現,FSP1從線粒體轉位到細胞膜后,通過還原性輔酶Ⅱ(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)的酶促反應氧化還原CoQ10為CoQH2從而發揮其拮抗脂質過氧化物的功能,進而抑制細胞鐵死亡,該研究為調控鐵死亡拓展了新的路徑。具體機制見Fig1。

Fig1 Schematic diagram of ferroptosis regulation mechanism

3 鐵死亡參與骨代謝的調控

OP的發病機制受到年齡、激素、內分泌等多方面因素影響,但其發病因素主是由于成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨破壞之間的平衡被打破,最終導致骨密度、骨質量下降和骨脆性增加。早期研究顯示,鐵過載及其產生的ROS積累可同時造成抑制骨形成和促進骨吸收的雙向病理過程[11],近年來的大量研究證實,鐵死亡對骨代謝的調控起到了關鍵作用。

3.1 鐵死亡對骨髓間充質干細胞的影響骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)是存在于骨髓基質中具有多種分化潛能的細胞亞群,BMSCs的成骨、成脂分化失調是OP的重要病因。近年來一些研究已經證明,BMSCs鐵死亡可降低其成骨分化能力從而誘發OP。Balogh等[12]證實鐵過載可通過下調BMSCs成骨相關特異性基因RunX-2和成骨相關特異性基因和OCN的表達降低BMSCs的成骨分化,而過氧化氫和地塞米松(Dexamethasone,Dex)也被發現可誘導BMSCs鐵死亡并降低其成骨分化能力[13]。調控BMSCs鐵死亡也成為了OP治療的新靶點,維生素E水解產物生育酚被發現可通過激活PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制過氧化氫誘導的BMSCs鐵死亡并促進成骨分化[14],可見通過抑制各種原因導致的BMSCs鐵死亡以促進其成骨分化可能是治療OP的潛在機制。

3.2 鐵死亡對成骨細胞的影響成骨細胞(osteoblast,OB)由骨髓間充質干細胞分化而來,在骨基質合成,分泌和礦化中發揮重要作用,大量研究證實OB鐵死亡會導致其分化和成骨能力下降,說明鐵死亡是OP發病的重要機制之一。Luo等[15]發現在鐵過載誘導鐵死亡OB中發現促進骨形成的經典Wnt信號下調,而Wnt激動劑則能在不改變鐵過載的前提下恢復OB分化。糖皮質激素及高糖均可誘導OB鐵死亡,Lu等[16]研究發現10 μmol·L-1劑量的Dex即可通過下調GPX4和System xc-系統激活OB鐵死亡。Ma等[17]發現高糖誘導可通過下調GPX4、升高ROS誘導MC3T3-E1鐵死亡。這些都表明,通過各種途徑抑制OB鐵死亡以促進骨形成具有廣闊的運用前景。

3.3 鐵死亡對破骨細胞的影響破骨細胞(osteoclast,OC)是由單核巨噬細胞系或BMSCs經NF-κB配體受體激活劑(RANKL)的誘導形成多核大細胞,執行骨吸收功能。研究顯示OC鐵死亡能降低其活性導致骨吸收減少[18],而與之矛盾的是,大量研究表明引發鐵死亡通路的鐵過載和過量ROS生成均可促進OC生成,鐵過載可促進骨細胞凋亡并增加RANKL誘導的破骨細胞分化,RANKL可增強鐵自噬作用導致胞內鐵離子增加,而隨著鐵離子增加通過芬頓反應產生的ROS可促進破骨細胞分化[19],上述機制以RANKL為軸交互作用,形成“鐵過載-RANKL增加-鐵蛋白自噬-加重鐵過載-骨吸收增加”的惡性循環,該矛盾的產生可能與OC分化過程中獨特的嗜鐵性以及ROS在OC分化中充當細胞間途徑中有效的多功能信號分子有關,其機制有待進一步探究。而通過不同途徑打破該循環成為調控破骨細胞分化治療OP的靶點。青蒿琥酯可通過p62/Nrf2信號通路抑制ROS的產生抑制OC生成[20],使用鐵螯合劑去鐵氧胺(DFO)可在體外通過MAPK通路抑制破骨細胞生成[21]。此外,誘導OC鐵死亡也成為治療OP的靶點,HIF-1α特異性抑制劑2-甲氧基雌二醇(2-methoxyestradiol,2ME2)可通過增加鐵自噬誘導OC鐵死亡以改善卵巢切術后(Ovariectomy,OVX)小鼠OP[22],雙膦酸鹽作為治療OP的常用藥物,在近期被發現可通過觸發FBXO9介導的p53泛素化和降解來誘導破骨細胞鐵死亡以改善OP的新機制[18]。總之,調節破骨細胞的鐵死亡可能是治療骨質疏松癥的一個選擇。

綜上,鐵死亡在骨代謝中因其作用的細胞不同而發揮著相應的生物學作用,BMSCs鐵死亡可抑制其成骨分化,OB鐵死亡可降低骨形成,OC鐵死亡則抑制骨吸收(如Fig2所示)。深入研究鐵死亡在骨穩態中與OB、OC耦聯的機制,從多靶點,多環節抑制鐵死亡在OP發病過程中的作用,是以鐵死亡作為切入點防治OP的前景所在。

Fig2 Schematic diagram of regulatory mechanism of ferroptosis on bone metabolism

4 鐵死亡在骨質疏松治療中的運用

4.1 鐵死亡與糖尿病性骨質疏松糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis,DOP)是常見的繼發性骨質疏松之一,近年來,大量的研究證實了鐵死亡是DOP發病的重要環節,高糖環境被證實可通過誘導BMSCs鐵死亡并抑制其成骨分化[23],靶向抑制鐵死亡逐漸成為DOP治療的研究熱點。Ma等[17]發現,褪黑素可通過激活Nrf2/HO-1通路降低高糖誘導的MC3T3-E1細胞鐵死亡水平,并增強其成骨能力。線粒體鐵蛋白(ferritin in mitochondria,FtMt)是一種存在于線粒體中,具有儲存鐵離子功能的蛋白質。Wang等[24]發現,過表達FtMt可減少高糖狀態下OB的鐵死亡,而沉默FtMt可激活ROS/PINK1/Parkin信號通路激活線粒體自噬并釋放鐵離子,促進成骨細胞鐵死亡,提示FtMt可能是治療DOP的潛在靶點。Zhang等[25]通過研究發現,由多不飽和脂肪酸產生的內源性促分解脂質介質(maresin1,MaR1)在體內和體外均能激活Nrf2通路,抑制高糖高脂誘導的OB鐵死亡。通過鐵死亡途徑干預糖尿病導致的骨形成減弱是目前新興的DOP治療途徑,鐵死亡對DOP調控的分子機制以及鐵死亡如何影響DOP的發病仍有待進一步研究。

4.2 鐵死亡與激素性骨質疏松糖皮質激素(glucocorticoid,GC)作為抗炎和免疫抑制劑,在臨床上運用廣泛。大量、長期使用GC對骨骼和肌肉組織造成不可逆的損傷,從而導致糖皮質激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis,GIOP)。研究顯示,GC誘導的OB鐵死亡所導致的骨形成減少是導致GIOP的重要機制之一[16]。大量研究者基于該機制拓展了GIOP的治療途徑,Sun等[26]在研究中發現,Dex通過抑制MC3t3-E1細胞SLC7a11/GPX4的表達,降低細胞內GSH活性并增加ROS含量誘發鐵死亡,而敲減SLC7a11的上游基因p53可逆轉Dex對MC3t3-E1細胞中SLC7a11/GPX4表達的抑制并防止鐵死亡的產生,該實驗從基因層面拓展了GIOP的治療思路。Lu等[27]研究中證實,骨髓來源的內皮祖細胞中提取的胞外囊泡(bone marrow EPCs,BM-EPCs)可通過上調SLC3A2,SLC7A11和GPX4逆轉Dex導致的骨細胞鐵死亡,該實驗證實了通過干預骨細胞鐵死亡以治療GIOP是可行的方向。綜上,通過抑制GC造成的脂質過氧化和鐵過載造成的BMSCs及OB鐵死亡,是目前通過干預鐵死亡治療GIOP的主要手段,明確節點通路和關鍵靶點并從不同途徑抑制GC對骨代謝的影響,是GIOP的治療方向之一。

4.3 鐵死亡與原發性骨質疏松PMOP是由絕經后婦女雌激素缺乏引起的原發性骨質疏松,其主要病因是由于雌激素缺乏導致骨吸收增強,骨形成減弱,最終導致骨量減少和骨脆性增加,早期研究顯示,絕經后婦女血清游離鐵含量高于正常人群,鐵代謝紊亂可能參與了PMOP的發病過程[28]。Ni等[22]證實2ME2可通過增強骨髓源巨噬細胞(bone marrow-derived macrophages,BMDMs)的鐵自噬誘導鐵死亡,進而降低OVX小鼠骨吸收以改善OP,表明以HIF-1α和鐵蛋白為靶點誘導破骨細胞的鐵死亡可能是治療PMOP新方法。

雖然眾多研究已證明絕經后的低雌激素水平可能與鐵死亡相關,但目前仍無證據說明二者間的直接關系,其影響機制有待進一步研究。

老年性骨質疏松癥(senile osteoporosis,SOP)是一種增齡相關的全身性骨病,研究顯示,在衰老過程中鐵代謝逐漸失衡,非血紅素鐵積累造成細胞內環境穩態的破壞是一系列衰老相關疾病的病因[29]。Xu[30]等發現,D-半乳糖(D-gal)誘導的衰老小鼠SOP可能與鐵死亡有關,而維生素D受體激活劑1, 25(OH)D可通過Nrf2/GPX4通路抑制SOP小鼠體內鐵死亡水平并增加骨形成,該實驗初步驗證了SOP與鐵死亡的相關性,并說明通過干預維生素D代謝調控鐵死亡可能是治療SOP的新方向。總之,調控骨代謝相關細胞鐵死亡可能是治療OP的新策略所在。具體機制見Tab1。

Tab1 Mechanism of ferroptosis in preventing and treating osteoporosis

5 總結與展望

鐵死亡作為一種新型的程序性細胞死亡,其在OP發病過程的作用機制被逐漸揭示,已成為防治OP的研究熱點。內分泌、激素、絕經及高齡等因素通過鐵死亡影響骨代謝的機制已被初步明確,通過抑制上述原因造成的骨形成相關細胞鐵死亡或激活骨吸收相關細胞鐵死亡成為目前通過鐵死亡途徑防治OP的主要思路。調控骨代謝相關細胞鐵死亡以恢復骨吸收和骨形成之間的平衡具有廣闊的挖掘空間。但鐵死亡與骨代謝的研究仍然處于起步階段,仍存在一些問題以亟解決:①目前對鐵死亡對OP的調控研究多集中于鐵過載和脂質過氧化兩種機制,隨著鐵死亡的新路徑不斷被揭示,是否存在其他調控機制以及觸發因素仍待探索。②在骨穩態的調節中,鐵死亡與其他形式的程序性死亡如焦亡、自噬之間的互作關系仍未明確,需要進一步深入研究。③受制于動物模型的因素,對于老年性OP與鐵死亡的研究仍然較少,需要建立科學的動物模型以明確鐵死亡與原發性OP的關系;④鐵死亡如何通過BMSCs、OB和OC之間的耦聯及對骨穩態進行精密的調控機制仍需深入挖掘;⑤中藥單體、復方及針刺治療OP具有多靶點、多途徑、多效應的調控特色,可通過進一步研究來明確中醫藥介導鐵死亡治療OP的途徑,拓展中醫藥治療OP的新靶點。⑥炎癥與免疫原性作為影響骨代謝的重要因素,與鐵死亡的關系在其他疾病中已經被揭示,然而目前尚未有研究說明二者是否通過鐵死亡與骨代謝的調控相關。⑦選擇性的在體內控制骨代謝相關鐵死亡的機制和方法仍然難以捉摸,在特定組織、細胞和或疾病背景下選擇性激活或抑制鐵死亡是將目前的研究轉化為臨床應用的關鍵。