硝化應(yīng)激在肺動脈高壓中的研究進(jìn)展

冀 磊,楊 進(jìn),蘆殿香

(1.青海省人民醫(yī)院,青海 西寧 810007;2.成都大學(xué)附屬醫(yī)院,四川 成都 610081)

肺動脈高壓(pulmonary hypertension,PH)是一種以血管過度收縮和閉塞重構(gòu)為特征的破壞性疾病,最終因右心衰竭而過早死亡。構(gòu)成肺血管的主要細(xì)胞成分如內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等多種細(xì)胞處在高血壓環(huán)境中導(dǎo)致細(xì)胞行為發(fā)生改變,促進(jìn)PH的發(fā)生發(fā)展。內(nèi)皮細(xì)胞是與血液接觸的第一層細(xì)胞,也是第一個暴露于任何氧氣水平變化中的細(xì)胞。內(nèi)皮依賴性的血管張力調(diào)節(jié)依賴于多種血管活性因子,包括一氧化氮(nitric oxide,NO)、前列環(huán)素和內(nèi)皮源性超極化因子,而血管收縮因子主要是內(nèi)皮素-1、血栓素和血管緊張素II。在這些物質(zhì)中,NO是心血管功能、代謝、神經(jīng)傳遞、免疫等的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,而異常的NO信號是許多疾病的核心特征。NO既可以作為活性舒血管物質(zhì)發(fā)揮抗動脈粥樣硬化、抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、血小板聚集和白細(xì)胞黏附等多種功能,也可以參與活性氮(reactive nitrogen species,RNS)產(chǎn)生,而RNS的過量產(chǎn)生在PH的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用[1]。

本文圍繞RNS以及由此引發(fā)的硝化應(yīng)激在PH中的作用進(jìn)行綜述,以期在PH中以靶向抗硝化治療的臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 RNS的種類

Tab1 Reactive nitrogen species

2 PH中RNS的來源

NO是一種快速擴(kuò)散的氣體,生理狀態(tài)下主要由eNOS在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中合成,一旦合成,NO能迅速擴(kuò)散通過細(xì)胞膜,傳遞至血管平滑肌細(xì)胞,NO和血管平滑肌內(nèi)可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)中的鐵原子結(jié)合,使三磷酸鳥苷變?yōu)榄h(huán)磷酸鳥苷(cyclic guanosine monophosphate,cGMP),繼而激活環(huán)磷酸鳥苷依賴蛋白激酶G(protein kinase G,PKG),使胞質(zhì)Ca2+外流或回收至胞內(nèi)鈣儲存庫中,導(dǎo)致胞質(zhì)內(nèi)游離Ca2+下降,抑制鈣調(diào)蛋白介導(dǎo)的肌球蛋白輕鏈磷酸化,抑制肌球蛋白與肌動蛋白的結(jié)合,從而使血管平滑肌舒張。NO作為肺循環(huán)中強(qiáng)有力的血管擴(kuò)張劑,其合成減少可以導(dǎo)致肺血管收縮,進(jìn)而促進(jìn)PH的發(fā)生發(fā)展。

NO的作用主要取決于其濃度,低水平時刺激sGC,引起血管舒張,高水平時以硝化應(yīng)激為主要途徑,引起血管內(nèi)皮廣泛損傷。NO作為自由基參與硝化應(yīng)激,其來源主要有以下幾種途徑。

2.3 誘導(dǎo)型一氧化氮合酶和神經(jīng)元型一氧化氮合酶的誘導(dǎo)表達(dá)生理狀態(tài)下,除eNOS在肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中合成NO外,iNOS和nNOS也可以合成少量NO。但在病理狀態(tài)下,如低氧誘導(dǎo)的PH,與常氧大鼠相比,低氧暴露增加了大鼠肺中iNOS基因和蛋白水平,抑制iNOS可減輕低氧誘導(dǎo)的大鼠PH[5],表明iNOS來源的NO在低氧誘導(dǎo)的PH中起到致病作用。另一項(xiàng)研究顯示,低氧暴露后,大鼠肺中nNOS基因和蛋白表達(dá)水平也有類似的增加[6]。

2.4 飲食來源飲食是人類亞硝酸鹽的主要來源,包括綠葉蔬菜的攝入以及食品添加劑和防腐劑。唾液腺將硝酸鹽從血漿中濃縮并分泌到口腔,口腔中的共生細(xì)菌將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽,進(jìn)入胃腸道,進(jìn)而被吸收到循環(huán)血中,或者在胃里被還原為NO。亞硝酸鹽生成NO,包括酶促和非酶促兩種反應(yīng)。銅、抗壞血酸和多酚類物質(zhì)可促進(jìn)NO的非酶促生成,而含金屬的蛋白質(zhì)如碳酸酐酶、血紅蛋白和肌紅蛋白可促進(jìn)NO酶促生成。然而,關(guān)于飲食中亞硝酸鹽衍生的NO在硝化應(yīng)激誘導(dǎo)的PH發(fā)病機(jī)制中的作用知之甚少。有研究表明[7],霧化吸入亞硝酸鈉可以改善射血分?jǐn)?shù)保留的肺動脈高壓患者的肺血管順應(yīng)性,減輕肺血管阻力,緩解右心衰竭。

3 硝化應(yīng)激對PH發(fā)生發(fā)展的影響

3.2 Cav-1作為硝化應(yīng)激成員對PH發(fā)生發(fā)展的影響在敲除脯氨酸羥基化酶(Egl-9 family hypoxia inducible factor 1,Egln1)基因的小鼠肺血管病變中RNS和NT增多,提示存在顯著的硝化應(yīng)激,這是由于HIF-2α和eNOS的激活導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞Cav-1缺陷,肺血管內(nèi)皮功能障礙所致,在給予CRISPR-Cas9介導(dǎo)的eNOS敲低或轉(zhuǎn)基因表達(dá)Cav-1干預(yù)后,可抑制硝化應(yīng)激反應(yīng),改善閉塞性肺血管重塑,并減輕小鼠PH[1]。在低氧誘導(dǎo)的PH模型中也發(fā)現(xiàn)Cav-1基因和蛋白水平均降低,在給予抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸干預(yù)后,可減輕低氧誘導(dǎo)PH大鼠右心室收縮壓及肺血管重構(gòu)[11]。可見,Cav-1作為eNOS的互作蛋白,Cav-1缺失可導(dǎo)致eNOS活性增加,由此生成的NO參與了硝化應(yīng)激反應(yīng),促進(jìn)了PH的發(fā)生發(fā)展。

3.3 eNOS作為硝化應(yīng)激成員對PH發(fā)生發(fā)展的影響目前對于PH中肺內(nèi)eNOS表達(dá)的結(jié)果存在不同的報道。這些eNOS在PH中表達(dá)的差異可能是由于使用了不同的研究模型和不同的實(shí)驗(yàn)方法以及疾病進(jìn)展階段不同,但不管何種原因,研究者普遍認(rèn)為NO信號在PH中受損。PH時NO生物利用度和活性受損是由于eNOS輔因子可用性降低或eNOS解偶聯(lián)導(dǎo)致的,而不是eNOS水平本身的降低[12]。eNOS、鋅指結(jié)構(gòu)、鈣調(diào)蛋白以及各種輔因子共同構(gòu)成了多聚體蛋白復(fù)合物,eNOS作為該蛋白復(fù)合物中的一員,不僅調(diào)節(jié)該復(fù)合物整體活性,還影響該復(fù)合物的完整性。eNOS衍生的NO除了作為血管擴(kuò)張劑外,還可以促進(jìn)血管生成。叢狀病變是重度PH的一個標(biāo)志,研究表明,在叢狀病變中發(fā)現(xiàn)了高水平的eNOS,而eNOS來源的NO,已被證明在血管重構(gòu)過程中發(fā)揮了促進(jìn)血管生成的作用[13]。由此可見,eNOS輔因子的缺乏,導(dǎo)致eNOS解偶聯(lián),此時生成的NO作為RNS參與了硝化應(yīng)激反應(yīng),進(jìn)而導(dǎo)致PH的發(fā)生發(fā)展。

3.4 NO-cGMP-PKG異常作為硝化應(yīng)激成員對PH發(fā)生發(fā)展的影響在PH動物模型,隨著NO的減少,內(nèi)皮依賴性的血管舒張功能受損,這并不是由于sGC表達(dá)減少導(dǎo)致的,因?yàn)樵谔匕l(fā)性PH(idiopathic pulmonary arterial hypertension,IPAH)患者及PH動物模型中sGC水平是升高的,在ROS和RNS升高的情況下,NO的受體sGC被氧化,使其對NO信號不敏感,從而降低了NO舒張血管的能力,sGC激動劑的應(yīng)用可以有效改善PH[14]。5型磷酸二酯酶(phosphodiesterase type 5,PDE5)主要表達(dá)于血管平滑肌,可以降解cGMP,PDE5在PH中表達(dá)增加,靶向PDE5的藥物,如西地那非在PH動物模型和PH患者中具有改善PH的作用[15],這也間接支持cGMP消耗增加導(dǎo)致NO依賴性血管舒張受損。cGMP可以激活PKG影響平滑肌細(xì)胞的功能。PKG基因缺失可以誘導(dǎo)PH的發(fā)生。

3.6 硝化應(yīng)激影響PH發(fā)生發(fā)展的臨床證據(jù)通過對PH患者中硝化應(yīng)激標(biāo)記物的觀察性研究,或靶向硝化應(yīng)激信號通路療法對臨床結(jié)果影響的研究,表明硝化應(yīng)激在PH發(fā)病機(jī)制中起到了重要作用。酪氨酸硝化是硝化應(yīng)激的標(biāo)志物,通過對原發(fā)或者繼發(fā)PH患者肺組織進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果顯示硝基酪氨酸明顯升高,提示PH患者的肺部處于硝化應(yīng)激狀態(tài)[18]。eNOS作為NO的主要來源,在IPAH肺叢狀病變中大量表達(dá),也有研究表明,與健康對照者相比,eNOS蛋白水平在IPAH患者的肺中雖然沒有顯著變化,但活性顯著增加,導(dǎo)致ONOO-生成增多,誘導(dǎo)肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞損傷[4]。這些研究均表明PH患者體內(nèi)硝化應(yīng)激增加,提示抗硝化治療在臨床上可能是有益的。

4 靶向RNS的治療方法

目前靶向RNS在PH中的治療方法主要有:增加NO含量、他汀類藥物調(diào)節(jié)炎癥和氧化酶活性、補(bǔ)充BH4、抗氧化劑清除ROS/RNS、NOX酶抑制劑減少ROS生成等幾個方面,最終達(dá)到減少ROS/RNS,恢復(fù)NO和蛋白質(zhì)正常功能,改善PH的目的。具體如下:

4.1 增加NO含量目前臨床上治療PH的藥物主要是針對肺血管進(jìn)行調(diào)控,如抑制血管收縮或促進(jìn)血管擴(kuò)張,主要包括前列環(huán)素類似物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、PDE5抑制劑和sGC抑制劑、鈣通道阻滯劑[19],其中,只有PDE5抑制劑直接靶向NO信號通路。作為PDE5抑制劑,西地那非、他達(dá)拉非和伐地那非已批準(zhǔn)用于PH患者的治療。研究表明,上述藥物可以改善動脈性PH(pulmonary arterial hypertension,PAH)患者6米步行時間、WHO功能分級,西地那非還可以改善中國PAH患者運(yùn)動耐量及血流動力學(xué),與傳統(tǒng)治療相比,西地那非可改善PAH患者1年、2年和3年的生存率[20]。

吸入NO早在1999年就被批準(zhǔn)用于治療新生兒持續(xù)PH,對于緩解成人PH也部分有效。然而,這種治療并沒有降低呼吸衰竭危重患兒的死亡率。此外,高達(dá)40%的嬰兒對吸入的NO沒有反應(yīng)[21],原因可能是與吸入的NO從治療作用轉(zhuǎn)化成有害的活性氮有關(guān),如形成NO2或ONOO-。

4.2 他汀類藥物調(diào)節(jié)炎癥和氧化酶活性他汀類藥物在調(diào)節(jié)炎癥和血管氧化酶活性方面具有廣泛的作用,已被證明在動物模型中可以改善PH。他汀類藥物可以通過抑制RAS同源基因家族成員A的激活,也可以通過上調(diào)eNOS的表達(dá)來改變血管張力。然而,在PH患者中使用他汀類藥物的證據(jù)并不像在動物模型研究中那樣有說服力,一項(xiàng)三盲、隨機(jī)對照試驗(yàn)、結(jié)果顯示,瑞舒伐他汀用于慢性阻塞性肺疾病合并PH有降低肺動脈收縮壓趨勢,但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義[22]。另一項(xiàng)研究表明,阿托伐他汀可有效降低慢性阻塞性肺疾病合并PH患者的肺動脈壓力[23]。他汀類藥物對于臨床PH患者的有效性仍需要隨機(jī)臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

4.3 補(bǔ)充BH4BH4是eNOS的重要輔助因子。BH4由三磷酸鳥苷從頭合成,以三磷酸鳥苷水解酶I作為該途徑中的第一個限速酶,過表達(dá)三磷酸鳥苷水解酶的轉(zhuǎn)基因小鼠對PH具有保護(hù)作用。在氧化應(yīng)激條件下,BH4很容易被解偶聯(lián)eNOS衍生的ONOO-氧化為BH2。由此導(dǎo)致的BH4減少是eNOS解偶聯(lián)的主要原因,eNOS解偶聯(lián)進(jìn)一步導(dǎo)致硝化應(yīng)激。補(bǔ)充BH4在PH動物模型和PH患者中取得了一定的成效,動物實(shí)驗(yàn)表明,降低細(xì)胞內(nèi)BH4水平,可以減少內(nèi)皮細(xì)胞和離體血管中NO的合成并增強(qiáng)超氧化物的生成,而給予BH4以劑量依賴性方式抑制超氧化物的生成。外源性補(bǔ)充BH4可以減少eNOS解偶聯(lián),提高NO生物活性,減少超氧化物生成[24],但其有益作用可能并不完全來自于eNOS功能的改善。

4.4 抗氧化劑清除ROS/RNS在PH實(shí)驗(yàn)動物模型中,已表明抗氧化劑可逆轉(zhuǎn)PH的發(fā)生發(fā)展。在PH患者中也表明與氧化應(yīng)激有關(guān)的關(guān)鍵氧化酶活性上調(diào)。盡管大量的實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明,抗氧化劑對PH以及心肌肥厚向右心衰竭的轉(zhuǎn)變具有保護(hù)作用,但PH患者是否應(yīng)該接受藥物和/或膳食抗氧化劑治療尚無明確證據(jù)。抗氧化劑曾被考慮用于治療與PH相關(guān)的疾病,如應(yīng)用N-乙酰半胱氨酸治療特發(fā)性肺纖維化,在潑尼松聯(lián)合硫唑嘌呤的標(biāo)準(zhǔn)治療基礎(chǔ)上加用N-乙酰半胱氨酸可能有利于特發(fā)性肺纖維化的治療。然而,另一項(xiàng)評估特發(fā)性肺纖維化反應(yīng)的研究報告表明,聯(lián)合使用潑尼松、硫唑嘌呤和N-乙酰半胱氨酸會增加患者死亡和住院的風(fēng)險。抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸治療可減輕慢性缺氧誘導(dǎo)的大鼠PH[11]。錳卟啉作為另一種ROS/RNS清除劑,可減輕Cav-1缺陷小鼠的右心室收縮壓和血管重構(gòu)[1],然而,另一種抗氧化劑TEMPOL,在缺氧和SU5416/缺氧誘導(dǎo)的PH大鼠中具有減少右心室收縮壓的作用,但對肺動脈重塑沒有影響[25],因此,抗氧化治療在PH的臨床前模型中是否有效仍存在爭議,這可能是與選擇的藥物、劑量和實(shí)驗(yàn)設(shè)計有關(guān)。例如,根據(jù)濃度和肺細(xì)胞類型,TEMPOL可以是促氧化劑或抗氧化劑[26]。對于PH患者是否應(yīng)給予抗氧化劑治療這一問題,需要進(jìn)一步的研究。

4.5 NOX酶抑制劑減少ROS生成模擬Cav-1支架結(jié)構(gòu)域的多肽是eNOS和NOX酶活性的有效抑制劑,并且在動物模型中被證明可以有效預(yù)防PH。這種方法的臨床實(shí)用性尚未得到證明,Cav-1的多肽是否可以減少PH中過量的ROS和RNS仍有待確定。抑制ROS生成在預(yù)防PH中也有一定的應(yīng)用前景,包括使用夾竹桃麻素抑制免疫細(xì)胞中的NOX 2或使用選擇性的NOX 1或NOX 4抑制劑以減少ROS的生成[27],進(jìn)而抑制硝化應(yīng)激反應(yīng)。

5 結(jié)語和展望

硝化應(yīng)激增加是PH的標(biāo)志。在PH肺組織存在明顯的ONOO-、NT和特定蛋白的硝基化。硝化應(yīng)激導(dǎo)致肺血管細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞毒性,影響蛋白質(zhì)的翻譯后修飾及其功能,并誘導(dǎo)eNOS解偶聯(lián),導(dǎo)致血管擴(kuò)張劑NO的生物利用度減低,最終引起血管收縮和血管重構(gòu)導(dǎo)致PH(Fig1)。

Fig1 Nitrative stress in pathogenesis of pulmonary hypertension

目前,對于PH的研究主要集中在對血管舒縮功能進(jìn)行調(diào)控,針對PAH的靶向治療旨在糾正內(nèi)皮功能障礙。雖然eNOS在PH患者肺組織中的表達(dá)水平與對照組相比有上調(diào)、不變或下調(diào),但目前研究普遍強(qiáng)調(diào)NO對PH的保護(hù)作用。但我們之前的研究發(fā)現(xiàn),NO與PH之間的關(guān)系復(fù)雜,推測在PH中NO作為舒血管活性物質(zhì)發(fā)揮保護(hù)作用與作為自由基發(fā)揮氧化/硝化應(yīng)激損害作用之間可能存在一個閾值[28]。因此,對于PH的治療,抑制硝化應(yīng)激可能會改善PH患者臨床預(yù)后,但是通過吸入或膳食增加NO作為治療PH的方案需要斟酌,推測與疾病發(fā)展階段密切相關(guān),疾病早期增加NO可能有益,疾病晚期或弊大于利。