穿山龍薯蕷皂苷通過調控自噬治療膠原誘導性關節炎小鼠模型的機制

江 濤,由 涌,夏東帥,薄思涵,王永為,高亞賢,宋鴻儒

(承德醫學院基礎醫學院 1.免疫學教研室、2.解剖學教研室,河北 承德 067000;3.河北北方學院醫學檢驗學院免疫學教研室,河北 張家口 075000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種難治性慢性的全身性自身免疫性疾病,其病理改變為多發和對稱性的滑膜異常增生、關節軟骨與骨破壞,常侵犯全身小關節[1-2],從而引發關節畸形和功能的喪失。目前普遍認為遺傳因素、環境及免疫失調與之相關[3]。

自噬是將細胞質中的物質運送到溶酶體進行降解,在細胞、組織和有機體的穩態中起著重要作用[4],有相關研究表明自噬與風濕性疾病的病理改變存在密切聯系,例如橘皮素和5-羥基6,7,8,3′,4′-五甲基甲黃酮被證明通過AKT/mTOR信號傳導抑制自噬,從而抑制大鼠與牛Ⅱ型膠原誘導的關節炎相關的病理變化[5]。相比于臨床上治療類風濕藥物的非甾體抗炎藥(NSAIDs)[1]、糖皮質激素(GC)等,中藥具有多靶點、毒副作用小等特點。同時隨著網絡藥理學興起,越來越多的中醫藥從經驗醫學向循證醫學體系轉化[6]。課題組前期經大量實驗研究證實中藥穿山龍治療RA效果肯定[7-10],并且不良反應少,因此本實驗通過建立CIA小鼠模型,探討穿山龍主要藥效成分穿山龍薯蕷皂苷[2]是否通過自噬治療CIA小鼠。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 SPF級DBA1小鼠:雄性,鼠齡6～7周。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號:LAC2021034]

1.1.2實驗藥物 穿山龍薯蕷皂苷來自中國南京秋實生物科技有限公司,稱取1 g羧甲基纖維素鈉加入100 mL超純水中,充分溶解,配成1 %的羧甲基纖維素鈉溶劑。稱取1.2 g穿山龍薯蕷皂苷加入30 mL溶劑中充分混勻制成40 g·L-1的母液。按母液 ∶溶劑為1 ∶1比例稀釋得到20 g·L-1的中劑量組混懸液,按母液 ∶溶劑為1 ∶3比例稀釋得到10 g·L-1的低劑量組混懸液。

陽性對照藥物:雷公藤甲素來自華潤三九(黃石)藥業有限公司,根據說明書人的雷公藤甲素每日劑量為72 μg,按照人與鼠體表面積比值計算的小鼠的每日劑量為12 μg·kg-1,體質量約為20 g的小鼠,每次灌胃100 μL計算的濃度為2.4 mg·L-1,每片雷公藤片含雷公藤甲素12 μg。將4片雷公藤片研磨成粉末,加入20 mL羧甲基纖維素鈉溶劑中,充分混勻制成混懸液。

1.1.3主要試劑 雞Ⅱ型膠原(美國Chondrex公司)弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)BCA蛋白濃度測定試劑盒(美國Thermo公司),反轉錄試劑盒、擴增試劑盒(中國SparkJade公司),LC3A/B、Beclin-1(美國Cell Signaling Technology),p62(英國Abcam)。

1.2 實驗方法

1.2.1造模與分組 CIA模型建立:適應性飼養DBA1小鼠1周,溫度(24 ± 2)℃,濕度(50 ± 10)%,將雞II型膠原與弗氏完全佐劑等體積混合于無菌的EP管中,用玻璃注射器反復抽吸至乳化完全,以滴入水中不分散形成邊緣規則的圓點為乳化成功標準。初次免疫:尾根部皮內注射100 μL完全弗氏佐劑與雞Ⅱ型膠原1 ∶1混合乳劑免疫,其中10只尾根部皮內注射100 μL生理鹽水作為對照組,第21天依照上述方法和劑量加強免疫[11]。加強免疫后將膠原免疫的50只小鼠隨機分組為CIA模型組、雷公藤組和穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組,每組10只。從加強免疫后1 d開始連續灌胃14 d,雷公藤組灌胃給予雷公藤片混懸液100 μL(按雷公藤甲素計每天12 μg·kg-1),穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組灌胃分別給予每天50、100、200 mg·kg-1穿山龍薯蕷皂苷混懸液100 μL,對照組和CIA模型組給予等體積溶劑。

1.2.2CIA小鼠造模后一般情況及關節炎指數(arthritis index, AI)測定 在初次免疫21 d對CIA小鼠進行二次免疫后,對小鼠的精神狀態、飲食狀況、毛發光亮程度進行觀察,并且每隔3 d對小鼠進行體質量、足爪厚度、及AI值測量記錄。用AI值作為衡量足爪腫脹情況的標準。AI評分如下[12]:0級:無明顯腫脹(0分);I級:趾關節有輕微紅腫(1分);Ⅱ級:紅腫蔓延足趾關節以下(2分);Ⅲ級:紅腫蔓延踝關節以下(3分);Ⅳ級:全足爪腫脹(含踝關節,4分),AI值即四肢骨節腫脹分數合計(0～16)。AI指數值與關節癥狀嚴重度呈正比關系。AI評分大于4分即表明小鼠CIA模型已成功創建。

1.2.3取材 小鼠加強免疫后15 d處理小鼠,處死小鼠后自膝關節以下取小鼠足爪去除皮膚和肌肉組織,放入提前配好的4%多聚甲醛溶液,另取小鼠的脾臟,淋巴結放入液氮中保存。

1.2.4蘇木精-伊紅(HE)染色 在對小鼠膝關節和足爪進行固定和脫鈣后,將組織進行脫水、透明、浸蠟、包埋處理,隨后對包埋好的組織進行切片,60 ℃烘箱烤片2 h,將切片進行二甲苯透明和常規乙醇梯度脫水后進行HE染色,再進行乙醇梯度脫水和二甲苯透明,中性樹膠封片后顯微鏡下觀察,采集圖像進行分析。

1.2.5qPCR檢測Beclin-1、p62、LC3的RNA表達 按不同分組分別取小鼠脾和淋巴結進行研磨的檢測RNA純度和濃度(OD260/280介于1.8～2.0),逆轉錄為cDNA置-20 ℃冰箱內,封存備用。qPCR引物如下:Beclin-1-F:5′-CTTTTCTGGACTGTGTGCAGC-3′;Beclin-1-R:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′;p62-F:5′-CGTGGGGTCCCTCAGATTG-3′;p62-R:5′-TCAGCTTCTTGGACCATGCG-3′; LC3-F:5′-CCAAGTTCCTGGTGCCTGAC-3′;LC3-R:5′-CTTCGGAGATGGGAGTGGAC-3′;GAPDH-F:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′;GAPDH-R:5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。使用2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒,采用PCR循環(兩步法),94 ℃預變性2 min,94 ℃變性5 s,退火60 ℃30 s,循環40次。所測數據運用2-ΔΔCT方法測量mRNA的相對表達量,ΔΔCT=(實驗組目的基因ΔΔCT均值-實驗組內參基因ΔΔCT均值)-(對照組目的基因ΔΔCT均值-對照組內參照基因ΔΔCT均值)。2-ΔΔCT表示不同組織中靶基因的相應表達水平。

1.2.6Western blot法檢測小鼠脾、淋巴結組織Beclin-1、p62、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白相對表達量 將100 mg左右脾、淋巴結組織放入2 mL離心管中,每個離心管放入3粒3 mm大小的鋼珠,再加入含PMSF的裂解液,隨后放入勻漿儀中進行充分勻漿,裂解至無明顯組織碎片后,4 ℃靜置30 min,在4 ℃下12 000 r·min-1離心15 min,取上清液即脾、淋巴結組織總蛋白,BCA法測定和調整濃度后,在100 ℃,5 min條件下進行蛋白變性。取20 μL樣本上樣,經10% SDS-PAGE凝膠電泳(80～120 V)、轉膜(200 mA)、室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h,TBST洗膜3次,隨后將膜在稀釋后的一抗(1 ∶1 000)中4 ℃孵育過夜。TBST洗5次,每次5 min。二抗(1 ∶10 000)中室溫孵育1 h,TBST洗3次,每次5 min。配制適量ECL顯色液均勻滴加在PVDF膜上,放入超敏全自動成像分析儀器中曝光成像,最后將膠片進行掃描并保存。通過ImageJ軟件讀取分析條帶灰度值,計算每個樣本中目標蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 小鼠足爪AI評分對照組中小鼠足爪無紅腫表現,因此AI在本實驗中為0;CIA模型組的AI指數對比對照組和穿山龍薯蕷皂苷高劑量組差異具有統計學意義,見Fig1。

Fig1 Mouse paw AI score n=4)

2.2 小鼠足爪厚度差值比較與對照組相比,CIA模型組小鼠足爪厚度增加;與CIA模型組相比,雷公藤組及穿山龍薯蕷皂苷組足爪厚度降低,見Fig2,3。

Fig2 Comparison of mouse paw thickness differences

Fig3 Comparison of swelling degree of mouse paws

2.3 小鼠體質量變化與對照組相比,其余各組體質量均下降,CIA模型組體質量下降明顯;雷公藤組及穿山龍薯蕷皂苷低、高劑量組體質量明顯回升,見Fig4。

Fig4 Mouse weight comparison

2.4 足爪踝關節HE染色與對照組相比,CIA模型組關節間隙變窄且有大量炎性細胞浸潤,骨組織明顯被破壞。與CIA模型組相比,雷公藤組及穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組有不同程度緩解,并且穿山龍薯蕷皂苷的中、高劑量組對骨質破壞和細胞浸潤情況治療作用較為明顯,見Fig5。

Fig5 Histopathological effects of mouse ankle joint (×200)

2.5 膝關節滑膜HE染色與對照組相比,CIA模型組出現滑膜組織增生并且有大量炎性細胞浸潤。與CIA模型組相比,穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組和雷公藤組減輕了炎性細胞浸潤情況,且兩組間對比無明顯差異,見Fig6。

Fig6 Histopathological effects of mouse knee joint synovium (×200)

2.6 各組小鼠脾和淋巴結中的Beclin-1,p62,LC3的mRNA水平比較與對照組相比,CIA模型組小鼠脾、淋巴結組織的LC3,Beclin-1的mRNA表達升高,p62的mRNA表達下降;與CIA模型組比較雷公藤組和穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組中LC3,Beclin-1的mRNA表達有不同程度下降,p62的mRNA表達水平有不同程度升高,見Fig7,8。

Fig8 Expression of Beclin-1, p62, and LC3 mRNA levels in mouse lymph node n=3)

2.7 各組小鼠脾和淋巴結中的Beclin-1,p62,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白水平比較與對照組相比,CIA模型組小鼠脾、淋巴結組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,Beclin-1蛋白表達顯著升高,p62蛋白表達下降;與CIA模型組比較雷公藤組和穿山龍薯蕷皂苷低、中、高劑量組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ,Beclin-1蛋白表達均有不同程度下降,p62蛋白表達水平有不同程度升高,Fig9,10。

Fig9 Expression of Beclin-1, p62, and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ protein levels in mouse spleen tissue n=3)

Fig10 Expression of Beclin-1, p62, and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ protein levels in mouse lymph node n=3)

3 討論

類風濕性關節炎是一種常見的系統炎癥性自身免疫性疾病,嚴重損害患者身體功能和降低生活質量[13]。 而膠原誘導性CIA小鼠作為常用的動物模型[14]主要病理表現為增生性滑膜炎、關節軟骨破壞、骨侵蝕以及關節腔內炎性細胞浸潤,其病理表現與人類類風濕關節炎相似[15],并且課題組前期對小鼠CIA動物模型建立過程中的小鼠一般情況、足爪腫脹度、足爪AI值及關節組織病理學進行過動態觀察[9-10],因此被選作為本試驗中的模型。本研究中DBA1小鼠首先采用雞Ⅱ型膠原乳劑初次免疫,第21天再次給予相同劑量加強免疫一次。經觀察,初次免疫至加強免疫之前小鼠的一般狀態良好與正常組之間無明顯區別,關節無明顯變化,加強免疫后2～3 d,小鼠的進食減少,體質量開始減輕,小鼠的背部及尾根部形成多處小潰瘍,被毛無光澤,隨后有小鼠潰瘍愈合,形成皮下結節。加強免疫第7 d,CIA小鼠精神狀態差,運動遲緩,體質量增長緩慢,95%小鼠后足出現充血紅腫,皮溫升高,足墊增厚,逐漸累及后膝關節及前肢,加強免疫第14 d足及膝關節腫脹達高峰,嚴重的關節不能負重,體質量下降明顯?；谇捌诖罅繉嶒灮A,在本實驗研究中,DBA1小鼠在第21 d再次給予相同劑量刺激加強免疫后,開始給予穿山龍薯蕷皂苷藥物治療干預治療,通過對小鼠一般狀況、體質量、足爪厚度、及AI值等測量記錄,與對照組相比,模型組及各治療組出現不同程度的足趾腫脹,足關節、膝關節滑膜HE染色顯示炎癥細胞浸潤等,表明模型建立成功,且穿山龍薯蕷皂苷治療組能夠不同程度的緩解足爪腫脹及炎癥浸潤。

自噬是真核細胞中一種常見的正常生理降解機制,有關于自噬的研究表明其對細胞的生存具有兩面性,一方面發揮降解蛋白質或細胞器的功能,從而維持代謝平衡起到促進細胞存活的功能[16];另一方面,過度的自噬會導致細胞功能的受損,引起自噬性死亡[17]。目前研究表明,自噬水平與RA的病程進展以及病理表現密切相關,RA的細胞炎癥水平與相關自噬分子呈正相關。研究有關自噬的重要標志物有LC3、Beclin-1、p62[18-19]。LC3是研究最充分的自噬分子之一,該蛋白具有4個亞型(LC3A、LC3B、LC3B2和LC3C);通過被蛋白內切酶活性的ATG4剪切后的LC3,生成的LC3-Ⅰ與ATG3和ATG7發生泛素化反應,繼而生成了持續附著在自噬體膜上的LC3-Ⅱ,并且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達與自噬水平呈正相關[20]。Beclin-1是最早發現和自噬相關的標志蛋白,是募集自噬效應分子的關鍵調控節點,也是干預修飾自噬通量的可能點[21],其表達的水平可以反應自噬的活性[22]。p62/SQSTM1是一種自噬接頭蛋白,可以運輸泛素化物質[23],通過和泛素結合結構域結合促進了泛素化集合體的合成與降解。由于p62在自噬過程中不斷降解,因此其表達水平與自噬呈負相關[24]。

在此,為了探討穿山龍薯蕷皂苷能否通過調控自噬的相關分子的表達從而減輕膠原誘導性關節炎小鼠的癥狀,從而起到治療和預防的作用。本實驗選擇檢測LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62這三個與自噬相關的重要標志物的表達來反應自噬水平的高低。實驗結果顯示,與正常組相比,CIA模型組的小鼠體質量下降,足爪厚度腫脹明顯增加,膝關節滑膜和足爪踝關節HE染色顯示有大量炎癥細胞增生。CIA模型組與正常組相比,脾和淋巴結組織中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的mRNA和蛋白水平明顯升高,p62的mRNA和蛋白水平降低,表明類風濕性關節炎的發生發展與自噬水平的升高相關聯。CIA小鼠經過陽性藥物(雷公藤)和高、中、低劑量的穿山龍薯蕷皂苷治療后,與CIA模型組相比,小鼠的一般情況得到改善,體質量回升明顯,足爪腫脹程度明顯緩解,脾和淋巴結中的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的mRNA和蛋白水平降低,p62的mRNA和蛋白水平升高,表明CIA小鼠通過穿山龍薯蕷皂苷的治療能夠降低自噬的水平。

本研究基于自噬探討穿山龍薯蕷皂苷對CIA小鼠的治療作用,實驗發現CIA小鼠的滑膜組織的炎性浸潤和增生可能與自噬水平升高有密切關系,并且穿山龍薯蕷皂苷可以通過抑制自噬,使自噬相關蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表達下調和p62水平上調,減輕CIA小鼠關節炎癥和滑膜增生的情況,使其RA癥狀得到改善。本實驗為尋找新的治療靶點,豐富中藥治療RA提供了重要的理論與實際意義。但本次研究沒有涉及自噬相關機制研究,今后將進一步探討穿山龍薯蕷皂苷通過抑制自噬治療RA的作用機制。