UCHL1調控NF-κB信號通路在單核細胞馴化免疫中的作用

王洪民,馬子涵,潘雅穎,高曉明,龔方苑

(蘇州大學基礎醫學與生物科學學院,江蘇 蘇州 215123)

固有免疫和適應性免疫是兩類相對獨立又互相協同的免疫應答方式。經典的免疫學理論認為免疫記憶是適應性免疫區別于固有免疫的重要特征之一。然而,近年來研究發現,固有免疫細胞在接受病原體及其代謝產物刺激產生初次免疫應答后,可以通過表觀遺傳和代謝重編程等方式改變細胞表型及功能,當再次接觸不同病原體時,可以產生更強的非特異性免疫反應,這種現象被稱之為馴化免疫[1]。馴化免疫是由固有免疫細胞(包括單核/巨噬細胞、中性粒細胞和NK細胞等)所介導的,獨立于T細胞和B細胞的記憶樣功能。馴化免疫中固有免疫細胞的應答反應性增強,會產生類似免疫記憶樣的特性,這對于機體發揮宿主防御及抗感染等功能具有重要意義[2]。

在我們的前期研究中發現,免疫復合物可以誘導單核細胞產生敏感性增強狀態,即固相化-IVIG(coated-IVIG, c-IVIG)處理的單核細胞再次接受LPS刺激時其敏感性明顯增強[3]。通過差異富集分析c-IVIG處理的單核細胞組及對照組的轉錄組測序(RNA-seq)結果,發現差異基因主要在泛素-蛋白酶體系統(ubiquitin proteasome system, UPS)明顯富集。因單核細胞在馴化免疫中的反應性增強主要體現為炎性細胞因子如TNF-α,IL-6等的分泌水平增加,由NF-κB通路所介導;而UPS通路同樣與NF-κB信號通路密切相關[4],因此,我們認為NF-κB信號通路中的UPS可能影響了c-IVIG處理的單核細胞的馴化作用。

UPS是所有細胞中蛋白質質量控制的基本調節器,其通過對底物蛋白的多聚泛素化并經蛋白酶體降解影響或調節多種細胞活動,如轉錄、免疫反應、炎癥過程及腫瘤生長等[5]。UPS由El泛素活化酶、E2泛素偶聯酶、E3泛素連接酶和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes,DUBs)組成,而DUBs作為UPS中的重要組成部分,可通過切割多聚泛素鏈或者從修飾的底物蛋白中去除泛素來逆轉泛素化過程,發揮去泛素化作用,逆向調節蛋白降解過程,從而影響細胞內蛋白質的功能。DUBs的存在使泛素化修飾成為一個被嚴格調控的可逆過程。在細胞中DUBs發揮維持游離泛素水平穩態的作用,而穩定的游離泛素水平是UPS正常調節的重要前提[6]。基于上述我們認為的NF-κB信號通路的泛素-蛋白酶體系統途徑可能影響了c-IVIG馴化作用的推測,我們進一步分析了單核細胞馴化處理后基因表達改變量較大的DUBs,發現去泛素化酶UCHL1在單核細胞馴化免疫中的作用最為明顯。

UCHL1是一個由223個氨基酸組成的半胱氨酸水解酶,也稱為PGP9.5蛋白,在大腦的神經元細胞中大量表達,其同時具有水解酶和連接酶的活性,這種雙重功能使UCHL1與其他DUBs區別開來,并使其成為UPS功能的特殊靶點[7]。UCHL1主要細胞功能被認為與其阻止多肽蛋白酶體降解的單體泛素結合有關,其通過維持細胞內可用的泛素池,調節多種細胞泛素依賴性的生物過程,如細胞周期、信號轉導、物質代謝、發育分化等[8]。已有的研究還表明,UCHL1參與了一些炎癥反應,UCHL1在多種炎癥性腎小球疾病中的表達明顯升高;抑制UCHL1可減少小鼠心臟炎癥細胞浸潤;UCHL1通過NF-κB和MAPK信號調節LPS活化的巨噬細胞誘導的炎癥反應等[9-11]。因此,UCHL1可能是治療多種炎癥性疾病的潛在靶點。

馴化免疫誘導增強的非特異性免疫應答更多的是炎癥反應。越來越多的證據表明,訓練有素的免疫在廣泛的(病理)生理條件下發揮著重要作用,目前已經在多種自身免疫性疾病中發現了馴化免疫的參與。在自身免疫性疾病患者體內存在大量自身抗體,可以參與免疫病理過程。通常,自身抗體可識別組織抗原形成抗原-抗體復合物,或直接沉積于炎癥部位,如在類風濕性關節炎患者滑膜內[12]。因此,探究免疫復合物誘導馴化免疫的機制對自身免疫病的預防及治療尤為重要。本研究我們采用c-IVIG模擬自身免疫疾病中自身抗體的堆積效應對單核細胞進行馴化處理,通過在293T細胞中構建NF-κB信號通路模型,探究c-IVIG誘導單核細胞馴化作用的機制,以期為解釋自身免疫病發病的機制提供新的依據,為疾病的預防和治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與質粒 293T細胞系由本實驗室保存;單核細胞從人外周血分離得到;NF-κB質粒購自碧云天公司;UCHL1、USP2a、USP2b、OTUB2、OTUD4、PSMD14由蘇州大學免疫系鄭慧教授惠贈;pSuper質粒由蘇州大學免疫學王帥副教授惠贈;pcDNA3.1、RL-TK、GFP質粒由本實驗室保存;UCHL1-S18Y、UCHL1-H161Q由本實驗室構建。

1.1.2試劑 人TNF-α酶聯吸附測定試劑盒(eBioscience);人單核細胞CD14磁珠(Miltenyi Biotec);HP Total RNA Kit (Omega);1st-Strand cDNA 合成試劑及TB Green? Premix Ex TaqTM(TliRNaseH Plus)(TaKaRa);DUBs廣譜抑制劑PR619、UCHL1特異性抑制劑LDN57444 (Selleck);LongTrans轉染試劑(Ucallm);兔抗UCHL1多克隆抗體(Thermo Scientific);GAPDH單克隆抗體(Santa Cruz);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(原平皓生物)。

1.1.3儀器 StepOne Plus Q-PCR儀(Life Technologies);Spark多功能酶標儀(Tecan);AttuneTMNxT 聲波聚焦流式細胞儀(Thermo Scientific)。

1.2 方法

1.2.1單核細胞的獲取 收集健康人外周血,將外周血與PBS按 1 ∶1進行稀釋,然后將稀釋的外周血緩慢加入等體積的淋巴細胞分離液上層,500×g離心30 min;離心結束后,離心管內液面由上至下依次為血漿層、單個核細胞層、分離液層與紅細胞層;用無菌吸管吸取單個核細胞層的細胞置于新的離心管中,加入PBS緩沖液,以400×g離心10 min洗滌去除血小板和死細胞等成分,獲得的細胞即為單個核細胞。將收集到的單個核細胞按107細胞數加80 μL預冷的分選緩沖液的比例進行重懸,按107細胞數加20 μL抗CD14磁珠標記抗體的比例加入抗體,冰上孵育15～30 min,孵育結束加入20 mL分選緩沖液以500×g離心10 min對細胞進行洗滌。將細胞沉淀重懸于500 μL分選緩沖液中,LS柱置于磁珠分離架上,細胞懸液過柱,并用分選緩沖液沖洗分離柱以去除未結合的細胞,而后將LS柱從分離架上移開,將吸附在磁場中的細胞推出經流式鑒定即可獲得純度達90%以上的單核細胞。

1.2.2細胞培養 富集得到的人單核細胞采用RPMI 1640(含5%自體血清、1%雙抗)完全培養基進行培養;293T細胞采用DMEM高糖(含10%胎牛血清、1%雙抗)完全培養基培養。細胞置于37 ℃ CO2培養箱中培養。

1.2.3單核細胞的馴化處理 將從人外周血中分離得到的單核細胞以1×105個接種于96孔板中,先經c-IVIG處理24 h,吸出上清,加10 μg·L-1LPS刺激,48 h收集細胞上清進行后續檢測。

1.2.4293T細胞轉染 轉染前1 d將5×104個細胞接種于48孔板中,待細胞融合度達到80%以上時進行轉染。轉染前30 min更換成300 μL新鮮的完全培養基。將0.25 μg的質粒DNA稀釋到15 μL無血清的DMEM培養基中,混勻;將0.75 μL LongTrans轉染試劑稀釋到15 μL無血清的DMEM培養基中,混勻;然后將DNA懸液加入LongTrans懸液中,輕輕混勻后室溫靜置15 min。將混合液加入孔板中然后置于培養箱中培養。轉染12 ～ 18 h后,去除含LongTrans和DNA復合物的培養基,替換為0.5 mL完全培養基對細胞進行換液。轉染24 h后用50 μg·L-1TNF-α作為激活劑進行刺激,48 h收集細胞進行后續檢測。

1.2.5實時熒光定量PCR(Q-PCR) 收集細胞,使用HP Total RNA Kit 提取試劑盒提取細胞總RNA,按照1st-Strand cDNA 逆轉錄試劑盒進行合成cDNA;采用TB Green?Premix Ex TaqTM和引物進行擴增反應。引物序列為:GAPDH:上游5′-GAACGGGAAGCTCACTGG-3′,下游5′-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3′;UCHL1:上游5′-GAAGGCCAATGTCGGGTAGA-3′,下游5′-GCCATGGTTCACCGGAAAAG-3′;USP2a:上游5′-TTCGACTCGTCCATACTCCA-3′,下游5′-TGGCACTCAGTGGGGACT-3′;USP2b:上游5′-GCTGCTCTCCACCTTCGT-3′,下游5′-GACCCTGGGCACTCTTAGAA-3′;OTUB2:上游5′-GCACTCACGAAGTAGAGCCC-3′,下游5′-CTTTGCCCAAAAGGCTGCAC-3′;OTUD4:上游5′-TGCTTTGCGTCTGAAAGGTG-3′,下游5′- TGTCCTACCCATTCCTGTGGA-3′;PSMD14:上游5′-CACAGTCAGGAACAGGTGTCA-3′,下游5′-CAAAGCCAGGGTGACTGTGA-3′。擴增體系為:上下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL,cDNA 1 μL,TB Green 5 μL,ROX 0.2 μL,RNase Free ddH2O 3.4 μL。反應條件:95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,55 ℃ 1 min,循環40次。采用2-ΔΔCT法計算目的基因mRNA相對表達量。

1.2.6酶聯免疫吸附ELISA分析 收集細胞上清液,檢測細胞分泌TNF-α的水平。包被抗體(TNF-α),4 ℃過夜;PBST洗板3次;用5% BSA封閉液37 ℃封閉2 h;加入稀釋的樣品或標準品,100 μL每孔,4 ℃過夜;PBST洗板3次,每次1 min;每孔加入100 μL稀釋后的 Biotin-標記檢測抗體,37 ℃ 1 h; PBST 洗滌 3次;每孔加入100 μL 稀釋后的 Avidin-HRP,37 ℃ 30 min;PBST 洗滌5次;每次洗滌后靜置2 min;每孔加入100 μL底物,置于室溫15 min;每孔加入50 μL終止液進行終止;酶標儀檢測吸光值,選擇450 nm和570 nm 雙波長進行檢測。

1.2.7雙熒光素酶報告基因試劑盒檢測 將收集的細胞加入報告基因細胞裂解液進行充分裂解,15 000×g離心5 min,收集細胞上清用于后續測定;設置多功能酶標儀測定時間為10 s,取100 μL螢火蟲螢光素酶檢測試劑加入測試管底部,然后加入20 μL 待測樣品,混勻后放入儀器進行檢測。測定完成后,取100 μL海腎螢光素酶檢測工作液加入上述測定管中,輕輕混勻后進行檢測。

1.2.8Western blot檢測 收集細胞,加入適量的RIPA裂解液(含體積分數為1%的蛋白酶抑制劑),置于冰上搖動裂解30 min,4 ℃ 12 000×g離心15 min之后收集細胞總蛋白。用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行定量測定。用10%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE,電泳結束后將蛋白轉移到PVDF膜上,5% BSA在室溫對膜進行封閉2 h,加入適當濃度的一抗:UCHL1或GAPDH,4 ℃孵育過夜。孵育結束后,用TBST洗4次,每次10 min,加入HRP標記的相應兔或鼠二抗,室溫孵育1 h后,TBST洗4次,每次10 min,加入ECL發光試劑顯色,在全自動凝膠成像系統中顯影成像。

2 結果

2.1 單核細胞馴化對去泛素化酶表達的影響我們對前期研究的coated-IVIG處理單核細胞組(c-IVIG)與對照組(Medium)細胞的RNA-seq測序結果進行分析,顯示差異基因在泛素-蛋白酶體途徑通路明顯富集。對該途徑相關基因表達分析得到表達變化較大的幾種去泛素化酶(USP2、UCHL1、OTUB2、OTUD4和PSMD14)(Fig1A)。接下來我們提取經過馴化處理的單核細胞RNA,通過Q-PCR對上述基因的表達做了進一步的驗證,得到與RNA-seq一致的結果,即經馴化處理的單核細胞,去泛素化酶USP2(USP2b)、UCHL1、OTUB2和OTUD4的表達水平明顯升高,差異具有統計學意義(Fig1B)。

Fig1 c-IVIG enhanced expression of deubiquitinase-related genes in trained monocytes

2.2 去泛素化酶對單核細胞馴化作用的影響在c-IVIG處理階段或LPS刺激階段加入不同濃度的去泛素化酶廣譜抑制劑PR619處理單核細胞;收集上清檢測TNF-α的分泌水平,分析去泛素化酶對單核細胞馴化免疫作用的影響。在c-IVIG處理階段加入抑制劑的結果顯示(Fig2A),TNF-α的分泌水平隨抑制劑濃度的增加而明顯降低,差異具有統計學意義,且抑制作用呈劑量依賴性。在LPS刺激階段加入抑制劑的結果顯示(Fig2B),TNF-α的分泌水平也明顯降低,差異具有統計學意義,但抑制作用并未呈現出劑量依賴性,結果說明,去泛素化酶主要在c-IVIG處理階段發揮作用。

Fig2 Deubiquitinating enzyme inhibitor inhibited trained immunity of monocytes

2.3 去泛素化酶對NF-κB信號通路的影響在經典的NF-κB信號通路中,單核細胞經LPS刺激后產生TNF-α。因此,我們以TNF-α作為激活劑,在293T細胞中過表達結果2.1中幾種去泛素化酶,構建了NF-κB信號通路模型。雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測NF-κB信號通路的激活情況。結果如Fig3所示,與對照組(Medium)相比,幾種去泛素化酶的過表達均可明顯激活NF-κB信號通路,差異具有統計學意義,其中UCHL1對NF-κB信號通路的激活效果最為明顯。因此,后續我們將圍繞UCHL1進行研究。

Fig3 Deubiquitinating enzymes activated NF-κB signaling pathway

2.4 UCHL1的表達對NF-κB信號通路的影響我們在293T細胞中對UCHL1進行干擾和過表達,TNF-α作為激活劑,雙熒光素酶報告基因檢測系統檢測UCHL1的表達對NF-κB信號通路激活的影響。結果顯示:干擾UCHL1可明顯抑制UCHL1的表達,并且干擾UCHL1的表達可明顯降低NF-κB信號通路的激活,差異具有統計學意義(Fig4A、4B);而過表達UCHL1后,NF-κB信號通路的激活明顯增強,差異具有統計學意義,且隨著UCHL1表達量的增加,對NF-κB信號通路的激活作用也相應增強(Fig4C、4D)。結果表明,UCHL1正向調控NF-κB信號通路的激活。

Fig4 UCHL1 enhanced activation of NF-κB signaling

2.5 UCHL1與NF-κB通路中關鍵信號分子之間的作用我們在過表達或者干擾UCHL1的情況下,同時過表達NF-κB通路中的關鍵信號分子(IκB-α、IKK-α、IKK-β、IKK-ε、p65),通過雙熒光素酶報告基因檢測系統測定NF-κB信號通路的激活情況,從而確定UCHL1作用于NF-κB信號通路中的步驟。結果如Fig5A、5B所示,當過表達幾種信號分子時,均能激活NF-κB信號通路;但在過表達p65或IKK-ε的情況下,過表達或干擾UCHL1對NF-κB信號通路的激活無明顯影響;而在過表達IκB-α、IKK-α、IKK-β的情況下,過表達UCHL1可明顯激活NF-κB信號通路,干擾UCHL1則可明顯抑制NF-κB信號通路的激活,差異具有統計學意義。表明UCHL1的表達可明顯促進由IκB-α、IKK-α或IKK-β介導的NF-κB的活化,但不影響p65或IKK-ε誘導的NF-κB激活。

Fig5 UCHL1 expression promoted activation of NF-κB induced by IKK-α, IKK-β or

2.6 UCHL1酶活性對NF-KB信號通路的影響UCHL1同時具有泛素水解酶和泛素連接酶活性,我們將其連接酶位點(S18Y)或水解酶位點(H161Q)進行突變,雙熒光素酶報告基因檢測分析UCHL1表達對NF-κB信號通路的激活是否依賴于其酶活性。結果如Fig6A所示,與對照組相比,突變體UCHL1-S18Y及UCHL1-H161Q對NF-κB信號通路的激活效果與UCHL1相一致,且上調作用更為明顯;但突變體UCHL1-S18Y及UCHL1-H161Q在未經TNF-α刺激的情況下,本底也明顯升高,差異具有統計學意義,因此我們將各組TNF-α激活后的熒光素酶活性與本底做比進行分析,結果如Fig6B,顯示UCHL1-H161Q突變體的相對熒光素酶活性值明顯低于UCHL1,即UCHL1水解酶活性受到抑制的情況下,UCHL1對NF-κB信號通路的調控水平會也受到明顯抑制。因此,我們認為,UCHL1的泛素水解酶活性在調節NF-κB信號通路中起重要作用。

Fig6 Regulation of NF-κB signaling pathway by UCHL1 depended mainly on activity of ubiquitin hydrolase (H161Q site)

2.7 UCHL1對單核細胞馴化免疫的影響基于上述UCHL1對NF-κB通路的明顯激活作用,我們推測UCHL1可能是單核細胞馴化免疫調控的關鍵分子。通過在c-IVIG處理階段或LPS刺激階段加入不同濃度的UCHL1特異性抑制劑LDN-57444對單核細胞進行處理,收集細胞上清,ELISA檢測TNF-α的分泌水平,分析馴化作用受UCHL1的影響。Fig7A結果顯示,在c-IVIG處理階段加入UCHL1抑制劑,TNF-α的分泌水平隨抑制劑濃度的增加而明顯降低,差異具有統計學意義,但是抑制效果并未呈現出劑量依賴性;在LPS刺激階段加入UCHL1抑制劑的結果顯示(Fig7B),TNF-α的分泌水平也明顯降低,差異具有統計學意義,且抑制效果呈現出劑量依賴性,表明在LPS刺激階段加入UCHL1抑制劑比在c-IVIG處理階段加入的抑制作用更有效。

Fig7 UCHL1 inhibitor inhibited trained

3 討論

馴化免疫可發生于多種固有免疫細胞中,在接種過卡介苗的健康志愿者外周鑒定出具有馴化免疫特征的單核細胞,當這群細胞再次受到刺激時,可以增強其炎性細胞因子的分泌能力,發揮對機體的保護作用;在暴露過低毒力白色念珠菌的小鼠巨噬細胞上,再次接受病原體感染時其固有免疫反應性增強,可以發揮免疫保護作用;病毒感染誘導的自然殺傷細胞的訓練免疫也顯示出類似于T細胞記憶反應的受體依賴性病原體特異性記憶效應;注射白色念珠菌的小鼠顯示出與退行性疾病惡化相關中性粒細胞胞外誘捕網的增加,這種記憶反應可能歸因于訓練的中性粒細胞[13]。馴化免疫進化為提供抗感染的保護,但過度激活的馴化免疫可誘導有害炎癥并促進炎癥性疾病的發展。

目前,已經在多種疾病中發現了馴化免疫的參與:在慢性炎癥性心臟代謝疾病如動脈粥樣硬化中,訓練有素的免疫可能起到有害作用;在炎癥性腸病中,先天免疫記憶兼具有益或有害的雙重作用;在神經退行性疾病如阿爾茨海默病中,小膠質細胞的免疫記憶被認為是神經炎癥的潛在原因;癌癥和某些感染也是由馴化免疫缺陷引起的疾病[2]。除上述疾病外,自身炎癥性疾病或過敏的患者在馴化免疫的情況下也會遭受過度炎癥的有害影響,以類風濕關節炎(rheumatoid arthritis, RA)為例:RA 患者中分離的單核細胞表現為馴化免疫表型,這些高度敏感的單核細胞可以在受到刺激時產生TNF-α,IL-6和IL-1β等大量炎性細胞因子;馴化免疫相關的通路,如PI3K-mTOR和MAPK通路都被激活[14];這種細胞高反應性可以導致機體長期處于慢性炎癥狀態下,產生慢性病發作,且有證據表明,RA患者外周單核細胞具有較正常人群更高的反應性。巨噬細胞作為先天免疫的重要組成部分在炎癥和宿主防御中亦發揮重要作用,其主要來源于單核細胞。研究表明,巨噬細胞同樣可以被訓練并持久發揮作用:經過訓練的巨噬細胞在對抗原暴露的反應中也可獲得記憶樣的特性,進而靶向自身免疫性風濕病如系統性硬化病的治療;訓練的巨噬細胞也可促進炎癥性動脈粥樣硬化病變的發展等;RA患者滑膜中的巨噬細胞在炎癥時同樣會分泌大量TNF-α和IL-6等炎性細胞因子,其反應性也呈現出較高的敏感態[15]。在RA和SLE等自身免疫性疾病患者體內存在大量自身抗體,可以在局部病灶(如骨關節處)發生沉積,導致局部微環境改變。結合免疫復合物及自身抗體多參與自身免疫病的事實,進一步研究免疫復合物誘導的單核細胞馴化作用機制可為解釋相關疾病的發病機制提供新的依據。

在本實驗室的前期研究中,我們采用固相化-IgG(c-IVIG)模擬自身免疫病中自身抗體的堆積效應誘導單核細胞發生馴化免疫。通過差異基因富集及蛋白互作網絡對coated-IVIG處理的單核細胞組及對照組的轉錄組測序(RNA-seq)結果進行分析發現,馴化免疫的差異基因主要富集在泛素-蛋白酶體系統途徑通路;蛋白網絡互作分析結果也提示,泛素化是USP2、OTUB2、UCHL1等多種去泛素化酶差異基因的關鍵調控節點。以上結果提示我們泛素化在參與調控馴化免疫中發揮重要作用。通過在RNA-seq結果中篩選出表達量變化較大的幾種DUBs(USP2、OTUB2、OTUD4、PSMD14、UCHL1)并在單核細胞上進行了驗證。通過在單核細胞馴化過程中加入UDBs的廣譜抑制劑,發現馴化作用受到明顯抑制,說明DUBs在單核細胞馴化免疫中發揮著重要的作用。研究表明,單核細胞馴化處理后其炎性因子的釋放顯著增加為NF-κB通路介導,而NF-κB信號通路的作用主要通過影響其上游因子的泛素化過程來實現[16-17]。因此,我們推測 NF-κB 信號通路的UPS在c-IVIG 的馴化作用中可能發揮重要作用,并且我們的實驗結果也驗證了這一假設,即在NF-κB信號通路體系中,以TNF-α為NF-κB信號通路激活劑,DUBs(USP2、OTUB2、UCHL1、PSMD14)對NF-κB信號通路的激活均有明顯促進效果,其中UCHL1的影響效果最為突出。

接下來我們通過對UCHL1進行干擾或者過表達,發現干擾或過表達UCHL1可抑制或促進NF-κB信號通路的激活,表明UCHL1正向調控NF-κB信號通路。通過對NF-κB信號通路中與泛素化相關的分子(IκB-α、IKK-α、IKK-β、IKK-ε、p65等)進行分析,發現UCHL1的表達對由IKK-α、IKK-β或IκB-α介導的NF-κB的活化具有明顯促進作用,而對p65及IKK-ε介導的NF-κB激活卻沒有影響。因此,我們認為UCHL1 對NF-κB信號通路的調控作用可能通過p65 NF-κB因子上游和NEMO/IKK復合體下游相關信號分子的泛素化而影響NF-κB信號通路的激活。研究表明[18]UCHL1同時具有泛素水解酶和泛素連接酶活性,其H161催化位點發揮水解酶作用,18號位點發揮連接酶作用,將H161位點突變(H161Q)或18號位點突變(S18Y)后其水解酶活性或連接酶活性受到抑制。因此,我們還探究了UCHL1的酶活性對NF-κB信號通路的調控影響。通過對結果的分析發現,在H161Q位點突變的情況下,UCHL1對NF-κB信號通路的調控受到明顯抑制。因此,我們認為UCHL1的泛素水解酶活性在調節NF-κB信號通路中起重要作用。此外,我們還用UCHL1的特異性抑制劑LDN-57444抑制c-IVIG模擬的自身抗體效應誘導的單核細胞馴化免疫,結果顯示抑制UCHL1可明顯減弱單核細胞的馴化作用。

綜上,我們認為自身免疫性疾病患者體內的免疫復合物可以通過去泛素化酶UCHL1調節NF-κB信號通路的激活從而馴化單核細胞,增強其敏感性,進而導致疾病的發生與進展。通過抑制UCHL1可降低單核細胞的馴化免疫,以此來減少自身免疫相關炎癥性疾病的發生。此研究可為自身免疫病的預防和治療提供一定的理論依據和新靶點。