基于HPLC指紋圖譜結合化學模式識別法和薄層色譜生物自顯影評價不同生長期毛菊苣藥材質(zhì)量

羅玉琴，魏哲洋, 2，劉戈宇，阿吉艾克拜爾·艾薩, 2*

基于HPLC指紋圖譜結合化學模式識別法和薄層色譜生物自顯影評價不同生長期毛菊苣藥材質(zhì)量

羅玉琴1，魏哲洋1, 2，劉戈宇1，阿吉艾克拜爾·艾薩1, 2*

1. 中國科學院新疆理化技術研究所 中科院植物資源化學重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011 2. 中國科學院大學，北京 100049

建立不同生長期（花前期、開花期和成熟期）毛菊苣地上部位藥材的HPLC指紋圖譜，結合化學模式識別法和薄層色譜（TLC）生物自顯影技術評價毛菊苣藥材質(zhì)量，為其進一步研究與開發(fā)提供依據(jù)。采用PolyPack C18-AQ色譜柱，以甲醇（A）-乙腈（B）-0.3%磷酸溶液（C）為流動相進行梯度洗脫，檢測波長為254 nm，體積流量為1.0 mL/min。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012）》建立不同生長期毛菊苣地上部位藥材的HPLC指紋圖譜并分析相似度。應用聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）篩選不同生長期下毛菊苣地上部位藥材中具有的差異性化學成分。利用TLC-生物自顯影技術對不同生長期毛菊苣藥材進行體外抗氧化作用研究。不同生長期下20批次藥材HPLC指紋圖譜共匹配出12個共有峰，指認出3號峰為秦皮乙素、6號峰為異槲皮苷、7號峰為3,5--二咖啡酰奎寧酸。CA將20批不同生長期下藥材分為4類；PCA確定了3個主成分因子，累積方差貢獻率為78.143%，PCA結果與CA結果基本一致；PLS-DA結果顯示色譜峰11、2、6（異槲皮苷）、3（秦皮乙素）和5號峰可作為不同生長期毛菊苣藥材質(zhì)量的差異標志物。樣品展開斑點和TLC-生物自顯影說明花前期和開花期藥材相比成熟期藥材具有良好的抗氧化活性作用。利用建立的指紋圖譜可為毛菊苣地上部位藥材規(guī)范化種植以及質(zhì)量評價提供實驗依據(jù)。

毛菊苣；指紋圖譜；秦皮乙素；異槲皮苷；3,5--二咖啡酰奎寧酸；化學模式識別；生物自顯影

菊科植物毛菊苣Boiss. et Huet為一年生草本植物，其地上部分和根收錄在《中國藥典》2020年版一部[1]，具有清肝利膽、健胃消食、利尿消腫之功效，用于濕熱黃疸、胃痛食少、水腫尿少等。毛菊苣在新疆南北部有大面積栽培，為新疆民族醫(yī)習用藥材，對肝損傷有較好的治療作用[2-4]。據(jù)文獻報道[5-7]，毛菊苣主要含倍半萜類、黃酮類、酚酸類、香豆素類、三萜類、生物堿、甾醇等成分，具有很強的生物活性和藥用價值，其中含有的秦皮乙素、異槲皮苷、3,5--二咖啡酰奎寧酸等化學成分具有顯著的抗氧化作用。

課題組前期采用紅外光譜三級宏觀指紋鑒定了毛菊苣與菊苣[8]、程波等[9]研究了毛菊苣及其易混品菊苣的位點特異性PCR鑒別。此外，以蘆丁[10]、菊苣酸[11-12]作為參比峰對毛菊苣根、地上部位進行HPLC指紋圖譜的研究亦有報道；再娜布等[13]、駱旭東等[14]、楊建等[15-16]分別采用HPLC比較了毛菊苣根、莖、種子不同部位中有效成分含量的差異；胡君萍等[17]采用UPLC同時測定毛菊苣和菊苣根中秦皮甲素、秦皮乙素、山萵苣素、菊苣酸、山萵苣苦素等5種成分的含量。為了比較不同生長期下（花前期、開花期和成熟期）毛菊苣地上部位藥材質(zhì)量的差異，本研究采用高效液相色譜技術建立藥材HPLC指紋圖譜，并結合化學模式識別法[聚類分析（cluster analysis，CA）、主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘法-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）]和薄層色譜-生物自顯影技術（TLC- bioautography）進行綜合評價。研究內(nèi)容可為購買的毛菊苣藥材采收期提供判別，也為維藥材規(guī)范化種植以及質(zhì)量評價提供參考依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260型HPLC液相色譜儀（美國安捷倫公司）；高效薄層色譜儀（瑞士CAMAG公司）；Sartorius CPA124s型電子天平（德國賽多利斯，0.1 mg）；YP5102型電子天平（上海光正醫(yī)療儀器有限公司，0.01 g）；SK7210LH型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

對照品秦皮乙素、異槲皮苷、3,5--二咖啡酰奎寧酸（均購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)分別為98.3%、96.3%、95.9%，批號分別為110741-201708、111809-201403、111782-201405）；山萵苣素（質(zhì)量分數(shù)為98.6%，批號為GSB 11-3216-2014，由中科院新疆理化技術研究所研制），山萵苣苦素（自制，經(jīng)HPLC檢測質(zhì)量分數(shù)為98%，通過UV、IR、MS、1H-NMR和13C-NMR波譜確定了結構），乙腈和甲醇為色譜純，水為超純水；薄層色譜用硅膠GF254（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）；其余試劑均為分析純。

20批次藥材中S16～S20由和田墨玉縣種植基地提供，其余均由新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所何江研究員提供，所有藥材經(jīng)何江研究員鑒定均為菊科植物毛菊苣Boiss. et Huet的干燥地上部分，符合《中國藥典》2020年版的有關規(guī)定。藥材采收后置陰涼通風處自然晾干，粉碎，過80目篩后置冷凍冰箱（?20 ℃）中保存?zhèn)溆谩Ｔ敿毿畔⒁姳?。

2 方法

2.1 HPLC指紋圖譜的建立和相似度評價

2.1.1 色譜條件 PolyPak C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相為甲醇（A）-乙腈（B）-0.3%磷酸水溶液（C），梯度洗脫（0～10 min，6% A，2%～6% B；10～20 min，6%～7% A，6%～12% B；20～30 min，7%～10% A，12% B；30～40 min，10%～13% A，12%～15% B；40～80 min，13% A，15%～21% B；80～100 min，13% A，21%～40% B）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長254 nm。

表1 20批次藥材樣品信息

2.1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取秦皮乙素、異槲皮苷、3,5--二咖啡酰奎寧酸、山萵苣素和山萵苣苦素對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配制成質(zhì)量濃度分別為96、80、117、227、54 μg/mL的溶液，搖勻，濾過（0.45 μm），備用。

2.1.3 供試品溶液的制備 取粉碎后藥材約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取（40 kHz、550 W）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過（0.45 μm），取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 指紋圖譜的建立和相似度分析 制備的供試品溶液按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。將得到的20批次藥材指紋圖譜導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版》軟件，設置時間窗寬度為0.50，采用多點校正法對色譜峰進行全譜匹配，建立毛菊苣藥材的共有指紋圖譜，選擇中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），計算相似度。方法學考察中精密度、穩(wěn)定性、重復性試驗均符合要求。

2.2 多元統(tǒng)計分析

將數(shù)據(jù)分別導入SPSS 25.0和Simca 14.1軟件進行CA、PCA和PLS-DA多元統(tǒng)計分析，初步篩選出不同生長期毛菊苣地上部位藥材中具有的差異性化學成分。

2.3 薄層色譜圖的建立及體外抗氧化活性研究

2.3.1 薄層色譜圖的建立 使用高效薄層色譜自動點樣儀，將相同生長期下的供試品溶液（制備方法同“2.1.3”項）分別點于20 cm×10 cm的硅膠GF254板上，以醋酸乙酯-甲酸-冰乙酸-水（16∶1.5∶0.5∶1）為展開劑，展開，取出晾干，置于紫外燈366 nm下觀察，并通過薄層色譜掃描儀進行掃描。

2.3.2 體外抗氧化作用的研究 TLC-生物自顯影技術可對天然提取物中具有抗氧化活性的化合物進行篩選。通過薄層色譜將化合物呈現(xiàn)在薄層板上，當脂溶性自由基DPPH與抗氧化活性化合物結合時，會使抗氧化活性部位呈現(xiàn)出亮黃色的斑點，其它未發(fā)生反應的部位呈現(xiàn)出紫色背景；當與水溶性自由基ABTS結合時，會使抗氧化活性部位呈現(xiàn)出白色斑點，其余未反應部位呈藍色背景。

3 結果與分析

3.1 指紋圖譜的建立和相似度評價

3.1.1 指紋圖譜的建立及共有峰的確認 依據(jù)采收時間和HPLC指紋圖譜中特征成分的相似性，將20批次藥材劃分為花前期（包括S1、S6、S7、S11、S13、S16）、開花期（包括S2、S3、S4、S5、S17、S18）和成熟期（包括S8、S9、S10、S12、S14、S15、S19、S20）3個生長期，不同生長期下HPLC指紋圖譜共有模式及其對照指紋圖譜，見圖1。20批次藥材的HPLC疊加指紋圖譜共有模式及其對照指紋圖譜，見圖2。通過與對照品比對，指紋圖譜共指認出3個對照品，分別為3號峰秦皮乙素、6號峰異槲皮苷、7號峰3,5--二咖啡酰奎寧酸，混合對照品溶液HPLC色譜圖，見圖3。花前期、開花期和成熟期下的藥材分別匹配出22、24和13個共有指紋峰；20批藥材疊加后匹配出12個共有峰，共有峰保留時間和峰面積見表2。

圖1 不同生長期藥材指紋圖譜(A)及其對照圖譜(B)

圖2 20批毛菊苣藥材HPLC指紋圖譜共有模式

3-秦皮乙素；6-異槲皮苷；7-3,5-O-二咖啡酰奎寧酸。

由圖1可以看出，花前期和開花期藥材具有的相似化學成分較多，而成熟期藥材化學成分的相似性差別較大。由表2看出，20批次藥材中12個共有指紋峰的峰面積RSD為33.04%～87.95%，表明每批次藥材質(zhì)量存在一定差距。

3.1.2 相似度分析 通過相似度軟件計算得到的HPLC指紋圖譜相似度分析結果見表3。由表3看出，S1～S9、S11～S13、S15～S20和對照指紋圖譜的相似度范圍為0.918～0.987，相似度較高；S10與對照指紋圖譜的相似度較低，為0.889；S14與對照指紋圖譜的相似度最低，為0.737。

3.2 CA

以20批次藥材HPLC指紋圖譜的12個共有峰峰面積作為變量，導入Origin（2021）軟件，采用組間平均數(shù)聯(lián)結法（between groups linkage），以夾角余弦（cosine）作為樣品相似度的距離公式，按照各類別之間的區(qū)別及聯(lián)系進行CA，見圖4。結果表明，采集的20批次藥材之間的距離值有較大差距，聚類分析樹狀圖分支較多。

表3 20批樣品HPLC指紋圖譜相似度評價結果

圖4 聚類分析圖

從樹狀譜系圖結果可以看到，當類間距離為0.1時，不同生長期下的20批次藥材可聚為4類，S14單獨聚為1類，為第Ⅳ類；S1～S7、S11～S13、S15～S17聚為第Ⅰ類；S8、S9、S20聚為第Ⅱ類；S10、S18和S19聚為第Ⅲ類。花前期藥材（S1、S6、S7、S11、S13、S16）和開花期藥材（S2～S5、S17）均在第Ⅰ類，表明花前期藥材和開花期藥材質(zhì)量上較為相似；成熟期藥材（S8～S10、S19、S20）主要在Ⅱ和Ⅲ類，表明成熟期藥材在質(zhì)量上有一定的差異。CA分析較好的吻合了不同生長期下的藥材指紋圖譜與系統(tǒng)相似度的直觀差異，正確體現(xiàn)出指紋圖譜之間的相似程度。

3.3 PCA

運用SPSS 25.0軟件對不同生長期下的20批次藥材指紋譜12個共有峰數(shù)據(jù)為變量，對其進行PCA，以主成分特征值＞1為提取標準，同時將20批次藥材的12個共有峰數(shù)據(jù)導入Simca 14.1軟件。PCA結果顯示KMO檢驗系數(shù)為0.574，Bartlett球形度檢驗顯著性＜0.000 1，提示適合進行因子分析，得到3個主成分，特征值及方差貢獻率見表4。由表4可知，特征值分別為4.913、2.724、1.740，方差貢獻率分別為40.943%、22.702%、14.498%，累積方差貢獻率達到78.143%，表明這3個主成分可以比較全面的表征不同生長期毛菊苣藥材的大部分信息。基于PCA建立無監(jiān)督的模式識別模型，模型擬合參數(shù)R為0.997，預測參數(shù)Q為0.679，以上參數(shù)均大于0.5，表明該模型具有較高的解釋和預測性，PCA得分圖見圖5。從圖中看出，20批次藥材按花前期、開花期和成熟期分布，且所有樣品點均落在95%的置信區(qū)間之內(nèi)，每個生長期的樣品聚集的較好，特別是花前期與開花期藥材分布較聚集，說明花前期和開花期藥材質(zhì)量相差不大。通過觀察樣品的組內(nèi)聚集和組間分離趨勢，表明PCA結果與CA結果基本一致。

表4 主成分特征值及累積方差貢獻率

圖5 20批毛菊苣藥材的PCA分析

利用SPSS 25.0軟件對PCA分析結果進行因子提取，采用凱撒正態(tài)化最大方差法正交旋轉(zhuǎn)，迭代5次后得到主成分載荷矩陣，結果見表5。由表5可知，第1主成分主要反映了色譜峰5、6（異槲皮苷）、8、10、12的信息，第2主成分主要反映了色譜峰2、3（秦皮乙素）、4、7（3,5--二咖啡酰奎寧酸）的信息，第3主成分主要反映了色譜峰1、9、11的信息。

表5 毛菊苣主成分因子載荷矩陣

3.4 PLS-DA

為了進一步證明分類的準確性，更好地體現(xiàn)組間差異，本研究基于CA和PCA結果，采用PLS-DA模型進行有監(jiān)督的判別分析。運用Simca 14.1軟件，對20批毛菊苣藥材指紋圖譜的12個共有峰數(shù)據(jù)為變量進行PLS-DA建模分析。由PLS-DA結果顯示，在該模型下R為0.827，R為0.825，Q0.647，表明擬合的預測模型具有較好的解釋和預測性能[18]。PLS-DA模型的置換檢驗結果見圖6。

為進一步分析引起20批次毛菊苣藥材質(zhì)量差異性原因，通過提取PLS-DA模型中12個變量重要性投影值（variable importance in projection，VIP），得到差異性標志物的VIP得分圖，見圖7，得分見表6。以VIP＞1為篩選標準，得到VIP＞1的共有峰，分別為11、2、6（異槲皮苷）、3（秦皮乙素）和5號峰，說明這5個成分對不同生長期毛菊苣藥材有較大影響，可作為不同生長期毛菊苣藥材質(zhì)量差異的主要潛在標志性成分。

圖6 20批次毛菊苣PLS-DA模型置換檢驗圖

圖7 20批毛菊苣PLS-DA模型VIP圖

表6 毛菊苣12個色譜峰的VIP值

3.5 薄層色譜圖的建立及體外抗氧化活性研究

花前期藥材、開花期藥材、成熟期藥材薄層色譜圖以及對ABTS溶液和DPPH溶液的研究，見圖8～10。

通過薄層色譜圖可直觀看出各生長期下的藥材斑點的差異性，特別是成熟期的藥材與花前期、開花期間差異較大，而在相同生長期下的藥材，其薄層色譜圖斑點較一致。通過與DPPH和ABTS的反應可以看出，花前期和開花期藥材相比成熟期藥材具有良好的抗氧化活性作用。

圖8 花前期藥材薄層色譜圖以及對ABTS溶液(A) 和DPPH (B)溶液的反應

圖9 開花期藥材薄層色譜圖以及對ABTS溶液(A)和DPPH (B) 溶液的反應

圖10 成熟期藥材薄層色譜圖以及對ABTS溶液(A)和DPPH (B) 溶液的反應

4 討論

在供試品前處理方法考察時，比較了不同提取溶劑（乙醇、70%乙醇、50%乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇）對藥材指紋圖譜的影響，利用DAD檢測器對供試品溶液進行190～400 nm全波長掃描，結果在波長為254 nm、提取溶劑為70%甲醇時，指紋圖譜色譜峰數(shù)量較多。考察了乙腈-磷酸水溶液、乙腈-甲酸水溶液、甲醇-乙腈-磷酸水溶液作為流動相對指紋圖譜的峰形和分離度的影響，結果表明，甲醇-乙腈-0.3%磷酸水溶液梯度洗脫，供試品溶液指紋圖譜色譜峰的分離效果最佳。

采用該色譜條件對不同生長期下的20批次藥材建立了HPLC指紋圖譜，結果發(fā)現(xiàn)花前期和開花期藥材匹配出的共有指紋峰分別為22和24個，遠遠多于成熟期藥材13個。通過與對照品比對，花前期和開花期藥材共指認出5個對照品，分別為秦皮乙素（22.87 min）、山萵苣素（27.67 min）、異槲皮苷（44.74 min）、3,5--二咖啡酰奎寧酸（47.08 min）、山萵苣苦素（83.51 min），而成熟期藥材沒有比對出山萵苣苦素，說明毛菊苣中的主要成分會隨著生長差異發(fā)生變化。經(jīng)相似度評價系統(tǒng)2012版軟件進行相似度評價后，得出20批次藥材間12個共有指紋峰的峰面積RSD為33.04%～87.95%。指紋圖譜中峰面積RSD最大的5號峰（未知），為87.95%，其次峰面積RSD排第2的為6號峰（異槲皮苷）、排第3的為3號峰（秦皮乙素），而峰面積RSD最小的為1號峰（未知）。提示在藥材的生長過程中，由于受地質(zhì)、氣候等環(huán)境因素的影響以及采集時間不同，導致藥材中所含化學成分的種類及含量具有一定的差異。

CA結果顯示，20批次藥材聚為4類，花前期和開花期藥材除S18外均聚在第Ⅰ類，而成熟期藥材主要聚在第Ⅱ和Ⅲ類；PCA和PLS-DA所得分類結果與CA分類結果基本一致。在PLS-DA模型的置換檢驗中，2在軸的截距為0.322，Q在軸的截距為?0.512，Q回歸線與縱軸的相交點小于零,說明模型沒有出現(xiàn)過度擬合現(xiàn)象，模型驗證有效，表明建立的PLS-DA模型有較好的穩(wěn)定性和預測能力[19-20]。VIP值是篩選差異性化合物與生物活性之間的重要指標，VIP值越大，尤其大于1的時候，對模型解釋能力越強[21-22]。VIP＞1的共有峰為峰11、2、6（異槲皮苷）、3（秦皮乙素）和5號峰，以上共有峰可作為不同生長期毛菊苣藥材質(zhì)量的差異標志物，后期將對其他共有峰采用高分辨質(zhì)譜進行鑒定。

薄層色譜-生物自顯影技術是將薄層色譜分離和生物活性測定相結合，是一種在活性指導下的快速靶向追蹤分離、篩選活性成分的方法[23-25]。本研究利用該技術對相同生長期下不同批次的藥材進行薄層掃描以及對DPPH和ABTS的抗氧化作用研究。結果表明，相同生長期下各樣品的薄層色譜圖譜較一致，花前期和開花期對DPPH和ABTS的抗氧化作用強于成熟期藥材，而發(fā)揮抗氧化作用的活性成分有待進一步研究。

《中國藥典》2020年版一部菊苣項下描述采割時間為夏、秋二季，通過上述研究表明，采收時間對藥材化學成分影響較大，而產(chǎn)地不同對藥材化學成分的影響差異較小。因此借助指紋圖譜的特征性可為購買的毛菊苣地上部位藥材的采收期提供判別，也為課題組在和田墨玉園區(qū)規(guī)范化種植、采收以及質(zhì)量評價提供依據(jù)。研究結果對保證藥材質(zhì)量和產(chǎn)品安全發(fā)揮一定的指導作用，也為毛菊苣有效部位的制備提供穩(wěn)定的藥材來源。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation ofat different growth stages based on HPLC fingerprint combined with chemical pattern recognition and TLC-bioautographic method

LUO Yuqin1, WEI Zheyang1, 2, LIU Geyu1, HAJI Akber Aisa1, 2

1. Key Laboratory of Plant Resource Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Xinjiang Technical Institute of Physics and Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China

To establish HPLC fingerprint for the acrial part ofat different growth stages (pre-flowering, flowering and maturity stages), and to evaluate the quality combined with chemical pattern recognition and TLC-bioautographic technology, so as to provide a basis for further research and development.PolyPack C18-AQ column was used for gradient elution with methanol(A)-acetonitrile(B)-0.3% phosphoric acid solution(C) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min, a detection wavelength of 254 nm.was used to establish the HPLC fingerprints of medicinal materials from the acrial part ofat different growth stages and analyze the similarity. Cluster analysis (CA), principal component analysis (PCA), and partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) were performed to screen the different chemical components of the aerial part ofat different growth stages. The antioxidant activities of medicinal materials ofat different growth stages were studiedby TLC-bioautography technology.The HPLC fingerprints of 20 batches of different growth stages matched 12 common fingerprint peaks, and peak 3 was identified as aesculetin, peak 6 as isoquercitrin, peak 7 as 3,5-O-dicaffeoylquinic acid. The 20 batches of medicinal materials were divided into four categories by CA. Three principal component factors were determined by PCA, and the cumulative variance contribution rate was 78.143%. The results of PCA were basically consistent with those of CA. PLS-DA results showed that peaks 11, 2, 6 (isoquercitrin), 3 (aesculetin)and 5 could be used as markers of quality difference ofat different growth stages. TLC speckle and TLC-bioautography showed that pre-flowering and flowering herbs had better antioxidant activity than the mature herbs.The established fingerprint can provide experimental basis for the standardized planting and quality evaluation of medicinal materials from the aerial part of.

Boiss. et Huet.; fingerprint; aesculetin; isoquercitrin; 3,5--dicaffeoylquinic acid; chemical pattern recognition; bioautography

R286.2

A

0253 - 2670(2024)08 - 2746 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.023

2023-11-01

國家藥品標準制修訂研究課題（BZ20230281）；中國科學院戰(zhàn)略生物資源計劃（KFJ-BRP-007-011）

羅玉琴（1974—），女，副研究員，碩士生導師，研究方向為中藥、民族藥制劑及質(zhì)量標準的研究。E-mail: luoyq@ms.xjb.ac.cn

通信作者：阿吉艾克拜爾·艾薩（1965—），男（維吾爾族），研究員，博士生導師，研究方向為天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)。E-mail: haji@ms.xjb.ac.cn

[責任編輯 時圣明]