基于生信分析和動力學模擬鑒定阿爾茨海默病免疫標志物及靶向藥食同源中藥預測

梁朋朋，王雅樂，黃 海，李桂云，吳紅彥

·數據挖掘與循證醫學·

基于生信分析和動力學模擬鑒定阿爾茨海默病免疫標志物及靶向藥食同源中藥預測

梁朋朋，王雅樂，黃 海，李桂云，吳紅彥

上海中醫藥大學深圳醫院，廣東 深圳 518004

分析阿爾茨海默病（Alzheimer’s，AD）免疫相關的生物標志物、發病機制、免疫浸潤水平和潛在的靶向藥食同源中藥。從GEO數據庫中下載GSE5281、GSE132903數據集的表達譜，獲得AD差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。采用加權共表達算法鑒定出AD重要模塊基因，再從ImmPortPortal數據庫獲取免疫相關基因（immune-related genes，IRGs），將這些基因取交集得到免疫重要差異基因；隨后應用最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）及機器學習-支持向量機遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）方法進行分析，篩選出AD共同的免疫相關標志物，并通過基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）探索生物途徑。然后，通過受試者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲線來評估其鑒別能力，并在GSE122063數據集中進行驗證。此外，建立臨床列線圖和曲線進行臨床應用評估。基于轉錄樣本中不同細胞類型相對豐度算法（cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts，Cibersort）和單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）進行免疫細胞浸潤分析。最后，運用Coremine Medical、Herb數據庫進行中藥和成分分析，并進行分子對接和動力學模擬。共篩選出1 360個DEGs和富半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質1（cysteine and glycine rich protein 1，）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，）、白細胞介素4受體（interleukin 4 receptor，）、生長抑素（somatostatin，）、人核因子-κB抑制蛋白α（nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，）5個生物標志物。GO分析顯示AD與神經系統發育和細胞發育的正向調節高度相關；KEGG和GSEA富集結果顯示AD與B細胞受體信號通路、糖胺聚糖生物合成途徑等通路最為密切。免疫浸潤分析顯示AD腦組織內巨噬細胞、記憶B細胞、中心記憶CD8 T細胞等比例上升，初始CD4+T細胞、活化的CD8+T細胞、效應記憶CD8+T細胞比例下降，B2M、CD40等檢查位點有明顯差異。潛在靶向中藥有人參、當歸、厚樸花等82種，四氣五味以溫、寒、平、辛、苦、甘為主，歸經以肝、肺、脾、胃經為主，功效以清熱、活血、補虛居多。分子對接和動力學模擬顯示20()-原人參二醇與標志物對接穩定。通過多種方法篩選出了AD的生物標志物，通過富集分析得到了AD相關的生物過程及信號通路，闡釋了免疫相關機制，人參、當歸、厚樸花等藥食同源類中藥有望成為AD新藥開發的重要來源，為AD發病機制、臨床治療、藥物研發提供新的思路。

阿爾茨海默病；加權共表達分析；機器學習；免疫浸潤；生物標志物；人參；當歸；厚樸花；20()-原人參二醇

阿爾茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）又稱原發性變性癡呆，常發生于老年人，是一種具有不可逆性和致死性的中樞神經系統退行性病變，常伴有進行性認知障礙、記憶缺陷、人格和行為改變等癥狀表現，嚴重影響患者的生活質量[1]。此外，臨床上缺乏特異性的診斷標志物，許多AD患者在癡呆發病的前幾年一般沒有任何癥狀，無法準確診斷或采取預防措施，延誤了診斷和治療的最佳時機[2-3]。相關研究報告指出，全世界約有5 000萬AD患者，到2050年，AD患者的數量將增加到1.52億，導致高達9億美元的經濟負擔，給社會和經濟造成了嚴重的負擔[4]。關于AD的確切病理機制尚不清楚，主要認為與老年斑、神經原纖維纏結和神經細胞死亡有關[5]。近年來，越來越多研究發現免疫炎癥反應在AD的發生發展中起著重要作用，尤其是小膠質細胞、肥大細胞、巨噬細胞等免疫細胞作用顯著[6-7]。小膠質細胞是中樞神經系統中一種特殊的固有免疫細胞，在腦炎癥反應中起著主要作用。研究表明[8]，M1小膠質細胞具有促炎作用，可分泌促炎因子來加重神經元損傷，如白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、IL-6和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）。相反，M2小膠質細胞可以通過分泌抗炎因子和特定的神經營養因子來調節腦微環境，促進組織修復，進而調節淀粉樣斑塊的靶向和清除。此外，大腦中淀粉樣蛋白的異常沉積可與免疫細胞表型結合，如CD36、Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）和TLR6，也可導致促炎因子和趨化因子產生，激活顱內炎癥，導致神經元損傷和AD進展的惡化[9-10]。因此，臨床上在清除β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）和微管相關蛋白-tau（microtubule-associated protein-tau，MAPT）等病理蛋白的基礎上，同時多靶點調節大腦免疫系統有望成為AD治療的潛在策略之一。當前大量文獻證實機體免疫可調節AD，但在這些與AD相關的研究中系統分析核心基因、評估免疫細胞豐度差異、免疫基因和免疫細胞間相關性的研究相對較少。

臨床上治療AD的藥物如美金剛胺、多奈哌齊等只能短期改善認知功能，治療時間久，合并用藥多，長期用藥會產生頭暈、惡心、腹瀉、肝腎毒性等不良反應[11-12]。隨著國內外治療AD藥物的研發遭遇瓶頸，中藥研究給科研工作者提供了全新的思路和研究價值。黃連解毒湯、開心散、黑逍遙散等諸多復方是臨床治療AD的經典方劑，并且組成中藥多數以藥食同源類為主。研究證實，此類復方可以通過其有效成分改善膽堿能神經功能、減輕氧自由基損傷、抑制氧化應激和神經炎癥反應，減少細胞凋亡等途徑改善AD患者學習和記憶，高效低毒，具有明顯的治療優勢[13-15]。到目前為止，國家已經公布了110種藥食同源中藥，然而對此類中藥及其成分調節免疫改善AD的機制尚不明析，且仍有中藥尚未發掘。因此，積極探索具有潛在治療作用的靶向中藥及化合物，歸納用藥規律，不僅可以為AD的臨床治療提供更多選擇，同時也可進一步發掘此類中藥的藥食價值。

基于上述認識，本研究利用生物信息學方法，從GEO數據庫獲取AD患者和正常人群的基因表達數據，采用加權基因共表達網絡分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）、機器學習篩選免疫相關標志物，通過轉錄樣本中不同細胞類型相對豐度算法（cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts，Cibersort）和單樣本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）算法對AD的免疫浸潤情況進行評估，最后通過Coremine Medical、Herb數據庫預測靶向中藥和化合物，并使用分子對接和動力學模擬做進一步驗證，以期為AD的預防、治療及保健食品研發提供參考依據。研究流程見圖1。

圖1 研究流程圖

1 材料和方法

1.1 數據的下載和處理

從基因表達綜合數據庫（Gene Expression Omnibus，GEO）中獲得了3個原始數據集（GSE132903[16]、GSE5281[17]和GSE122063[18]）。GSE132903基于GPL10558平臺，包括97個AD患者和98個正常人（對照）樣本；GSE122063基于GPL16699平臺，包括56個AD患者和44個對照樣本；GSE5281基于GPL570平臺，包括87個AD患者和74個對照樣本。隨后，對每個數據集中的探針進行注釋，并根據相應的平臺注釋文件轉換為標準基因名。將GSE5281和GSE132903數據集的表達譜合并為訓練集，并利用sva包調整批效應，用于后續的WGCNA和機器學習等分析。另外將GSE122063作為額外數據集用于驗證。

1.2 免疫相關基因獲取

ImmPort是目前權威較高的人類免疫基因數據庫之一，可以下載數據進行有效分析。從ImmPort數據庫（https://www.immport.org/home）下載人類免疫基因集，剔除重復基因后獲得1 793個免疫相關基因（immune-realated genes，IRGs）。

1.3 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）的分析

對數據集進行標準化、歸一化處理后，使用“limma”R包分析AD和對照樣本之間的差異基因。以差異表達倍數的絕對值大于0.5且值小于0.05為篩選標準。使用R軟件ggplot2軟件包和“復雜熱圖”分別繪制了火山圖和熱圖，以顯示顯著調控的重要基因。

1.4 WGCNA

WGCNA是一種常用模塊化分析技術，常用于識別和篩選復雜疾病生物標志物或藥物靶點，鑒定高度協同變化基因表達矩陣，為研究疾病的潛在機制提供新方向。利用R軟件中的“WGCNA”包構建了一個共表達網絡[19]。使用合并數據集中方差前5 000個基因構建共表達網絡，模塊內最小基因數設置為30。隨后將鄰接矩陣轉化為拓拓撲重疊矩陣（topological overlap matrix，TOM），構建多個基因模塊及分層聚類樹。最后，評估了每個模塊與臨床特征之間的相關性，計算模塊基因顯著性（gene significance，GS）以及模塊顯著性（module membership，MM）用以衡量基因與生物模塊和臨床信息的相關性、顯著性，提取重要模塊和基因用于后續分析。

1.5 樞紐免疫相關DEGs的鑒定

為了準確識別重要基因，將DEGs、WGCNA中的模塊基因和IRGs取交集，以鑒定免疫樞紐基因集，為確保在兩數據集中差異基因均含有樞紐基因，再次進行了交集運算，獲取最終免疫樞紐基因，采用Venn圖展示結果。隨后，對免疫樞紐基因進行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析，以分析相關生物功能和通路。

1.6 對診斷特征基因的機器學習

機器學習是處理高維復雜數據常用的工具之一。使用2種機器學習算法最小絕對收縮和選擇算法（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）及機器學習-支持向量機遞歸特征消除（support vector machine-recursive feature elimination，SVM-RFE）進行特征基因預測。LASSO可以提升正則化來提高預測準確度的回歸分析算法。使用R4.2.0軟件的“glmnet”軟件包開展LASSO回歸分析。SVM是一是一種線性分類器，使用基于SVM的最大間隔原理訓練樣本，不斷迭代，最后選出需要的特征數，使用“e1071”R包來識別具有最高鑒別能力的基因。

1.7 評估生物標志物對AD的診斷價值

使用R軟件中的pROC包繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線圖，評估已確定的生物標志物的診斷價值。在驗證數據集GSE122063中進一步驗證候選標記物的表達水平及診斷效能。使用R軟件中的“rms”包建立列線圖進行綜合風險分值評估，然后繪制校準曲線用于評估列線圖模型的預測能力，最后使用R軟件中的“rmda”包繪制遺傳決策曲線和臨床影響曲線評估模型的臨床決策和效用價值。

1.8 基因集合富集分析

基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是使用快速GSEA R包來闡明特征基因的生物學意義。為了實現每個分析的標準化富集分數，進行1 000次的基因集排列。錯誤發現率（false discovery rate，FDR）＜0.05為顯著富集。

1.9 免疫細胞亞型的豐度及表達差異評價

使用Cibersort反卷積算法和ssGSEA分析免疫浸潤細胞的豐度和相關性。Cibersort方法主要依賴于LM22的免疫細胞亞型表達矩陣，使用Ciber Sort R腳本對其矩陣進行定性和定量分析。ssGSEA算法基于TISIDB網站獲得28種免疫相關基因集進行豐度計算。通過Wilcoxon秩和檢驗分析組間免疫細胞的豐度差異及比較37個免疫檢查位點差異。基于ssGSEA的分析結果，分析特征基因與免疫細胞種類的相關性，以＜0.05為篩選標準，使用corrplot包繪制圖形。

1.10 潛在靶向中藥預測分析與核心成分鑒定

將核心基因導入Coremine Medical數據庫（http://www.coremine.com/medical/），以＜0.05為標準篩選具有潛在治療作用的中藥，統計潛在中藥的功效、四氣、五味、歸經，供臨床用藥參考。以國家衛生健康委員會頒布及后續補充的藥食同源中藥名單對中藥分類后，構建“基因-中藥”靶向網絡，篩選度（degree）值排名前5的中藥作為核心中藥進行后續分析。將核心中藥導入本草組鑒數據庫（http://herb.ac.cn）中查詢化學成分，使用Network Analyzer推算拓撲參數分析，參考中心度（betweenness centrality）、緊密中心度（closeness centrality），以節點連接度值（degree）排序前15位成分初篩確定核心成分。導入Swiss ADME數據庫（http://www.swissadme.ch）進行類藥性評估，以腸道通透性為“High”，類藥性五原則至少有2個“Yes”進行再次篩選確定關鍵成分。

1.11 分子對接和分子動力學模擬

將篩選得到的關鍵成分與靶點進行分子對接，從PubChem下載關鍵成分的3D結構。從PDB數據庫中獲取核心靶點的分子結構，用PyMol軟件刪除水分子和原配體。對接過程采用AutoDock Tools1.5.6軟件對蛋白添加氫，計算電荷。隨后采用AutoDock Vina進行分子對接，根據結合能≤?5.5 kJ/mol作為篩選標準，對結果進行排序，選擇最佳對接組合進行動力學模擬。將對接結果的蛋白與小分子配體分離，通過Ambertools軟件中的antechamber工具生成小分子力場文件，通過acpype軟件工具將小分子力場文件轉換為gromacs力場文件。小分子采用GAFF力場，蛋白采用AMBER14SB力場和TIP3P水模型，合并蛋白和小分子配體的文件，構建復合物的模擬體系。

采用Gromacs2022程序進行分子動力學（molecular dynamics，MD）模擬，在恒溫、恒壓以及周期性邊界條件下進行。在MD模擬過程中，所有涉及氫鍵采用線性約束求解器（linear constraint solver，LINCS）算法進行約束，積分步長為2 fs。靜電相互作用采用PME（particle-mesh Ewald）方法計算，截斷值設為1.2 nm。非鍵相互作用截斷值設為10 ?（1 ?＝0.1 nm），每10步更新1次。采用V-rescale溫度耦合方法控制模擬溫度為298 K，采用Berendsen方法控制壓力為1 bar（1 bar＝100 kPa）。在298 K下，進行100 ps的恒定原子數、體積、溫度（constant atoms，volume，temperature，NVT）系綜與恒定原子數、壓力、溫度（constant atoms，pressure，and temperature，NPT）系綜平衡模擬，并對復合物體系進行100 ns的MD模擬，每10 ps保存1次構象。模擬完成后，使用視覺分子動力學（visual molecular dynamics，VMD）軟件和pymol對模擬軌跡進行分析，使用g_mmpbsa程序采用分子力學泊松-玻爾茲曼表面積法對蛋白和小分子配體之間進行結合自由能分析。

2 結果

2.1 阿爾茨海默病腦組織中DEGs的鑒定

GSE132903數據集基于GPL10558平臺，包含97個AD樣本和98個對照樣本；GSE5281數據集基于GPL570的平臺，包括87個AD樣本和74個對照樣本。經過預處理并去除批處理效應后，共獲得1 360個DEGs，其中AD樣本中有612個上調基因，748個下調基因，熱圖見圖2-A，火山圖見圖2-B。

2.2 共表達網絡的構建與模塊鑒定

使用R包“WGCNA”構建基因共表達網絡分析。首先對樣本進行聚類，以保證后續分析的準確性。為保證基因間相互作用最大限度符合無尺度分布，對數據進行軟閾值的確定，如圖3-A所示，根據R軟件計算得到最佳軟閾值，確定為3，即此時的圖3-A（左）的縱坐標2接近0.9。基于最優軟閾值，按照混合動態剪切樹算法識別AD不同基因模塊（圖3-B），將變異排名前5 000個基因聚類并合并為9個共表達模塊（圖3-C），采用Pearson相關分析，探討模塊特征基因與臨床性狀的相關性。結果顯示，各模塊與臨床特征相關性一般，其中綠松石模塊相比于其他模塊相關性較高（cor＝0.49，＜0.01），見圖3-C。此外，綠松石模塊基因顯著性與模塊隸屬度分析顯示，兩者高度關聯（cor＝0.83，＜0.01），因此取該模塊為重要模塊，共2 552個基因用于后續分析（圖3-D）。

2.3 樞紐免疫相關基因的功能富集分析

將WGCNA鑒定的重要基因模塊綠松石、DEGs、IRGs取交集，共獲取72個基因（IRHUB），為了保證在2個數據集差異基因中均含有關鍵基因，再次進行了交集運算，共識別出24個樞紐基因用于后續分析，如圖4-A所示。生物功能富集顯示與神經發生的正向調節（GO：0050769）、神經系統發育的正向調節（GO：0051962）、細胞發育的正向調節（GO：0010720）、神經發生的調節（GO：0050767）有關；分子功能富集主要涉及激素結合（GO：0042562）、受體配體活性（GO：0048018）、信號受體激活物活性（GO：0030546）、激素活性（GO：0005179）、肽結合（GO：0042277）等功能；在細胞成分方面，鎂依賴蛋白絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶復合物（GO：0005963）、Z盤（GO：0030018）、肌膜（GO：0042383）、I帶（GO：0031674）、局灶黏附（GO：0005925）等在AD的免疫調控中發揮了重要作用（圖4-B）。在KEGG分析中（圖4-C），富集通路主要分布在B細胞受體信號通路（hsa04662）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路（hsa04010）、T細胞受體信號通路（hsa04660）等多條通路中，說明免疫調控在AD的發病機制發揮了重要作用，為未來AD的研究提供了潛在的靶點和通路。

A-熱圖；B-火山圖。

2.4 AD中免疫相關診斷特征生物標志物的識別

采用2種機器學習方法LASSO回歸和SVM-RFE來探索AD的潛在標志物。LASSO回歸方法分析出17個AD特征基因（圖5-A、B）；SVM-RFE算法分析得到5個AD的特征基因（圖5-C、D）。2種算法與24個樞紐基因進行交集運算，最終得到5個共同基因作為AD免疫特征相關的樞紐基因富半胱氨酸和甘氨酸的蛋白質1（cysteine and glycine rich protein 1，）、膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，）、白細胞介素4受體（interleukin 4 receptor，）、生長抑素（somatostatin，）、人核因子-κB抑制蛋白α（nuclear factor-kappa B inhibitor alpha，）（圖5-E）。

2.5 診斷標志物的表達水平和診斷意義

如圖6-A所示，通過ROC曲線分析，的曲線下面積（area under urve，AUC）為0.731［95%可信區間（confidence interval，CI）＝0.678～0.782］，的AUC為0.813（95% CI＝0.767～0.856），的AUC為0.695（95% CI＝0.644～0.748），的AUC為0.853（95% CI＝0.812～0.892），的AUC為0.811（95% CI＝0.764～0.855），顯示了這5個基因作為AD潛在標志物可靠的診斷效能。此外，與對照組相比，AD患者腦組織樣本中、、的表達水平上調，表達水平下調（圖6-B）。

2.6 AD潛在生物標志物外部數據集驗證

為了驗證上述結果的準確性和可靠性，使用外部數據集（GSE122063）對上述5個樞紐基因（、、、、）進行了驗證。結果顯示，與對照組相比，AD患者的、、、、的表達水平與在訓練集基因中觀察到的表達趨勢一致（圖7-A）。此外，診斷模型分析顯示（圖7-B），5個標志物的AUC均大于0.6，表明具有可靠的診斷價值。

2.7 AD潛在標志物列線圖模型預測結果

本研究構建了診斷標志物的列線圖模型來預測AD的發病風險。校準曲線、決策曲線和臨床效應曲線如圖8所示。通過計算模型中特征的總分，可以得出患AD的風險，這為AD的診斷提供了一些新的策略（圖8-A）。校準曲線顯示了列線圖模型預測與理想模型擬合較好，具有良好的可靠性（圖8-B）。臨床決策曲線中彩色曲線表示的診斷標志物模型遠離全部（all）和無（none）曲線，表明基于模型的決策對AD患者有較大的臨床益處（圖8-C）。此外，臨床效應曲線顯示了列線圖模型具有顯著的預測能力（圖8-D）。

2.8 樞紐基因的通路分析結果

GSEA富集分析結果顯示，這些標志物參與AD發生發展的多條通路，主要涉及免疫排斥反應、氨基酰-tRNA合成酶合成、基礎轉錄因子調控、慢性髓系白血病、糖胺聚糖生物合成途徑、Hippo經典信號通路、尼古丁成癮、Notch信號通路、逆行內源性大麻素記憶信號通路、氧化應激、鈣離子調節通路、病毒蛋白-細胞因子串擾、免疫缺陷等多條通路。其中糖胺聚糖生物合成途徑、Hippo經典信號通路、尼古丁成癮等通路均在5個樞紐基因中顯著富集，可能在AD免疫調節密切關聯（圖9）。

2.9 免疫細胞浸潤分析

使用Cibersort、ssGSEA評估了AD患者和對照組的免疫豐度，如圖10-A、B所示。Cibersort結果顯示，AD患者組織中M1巨噬細胞、靜息態記憶CD4+T細胞具有較高的比例，而初始CD4+T細胞有所減少。ssGSEA結果顯示，AD患者組織中CD56明亮自然殺傷細胞、未成熟B細胞、未成熟的樹突狀細胞、髓源性抑制細胞、巨噬細胞、肥大細胞、自然殺傷T細胞、中性粒細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、濾泡輔助T細胞、輔助性T細胞1、輔助性T細胞17、記憶B細胞、中心記憶CD8+T細胞比例上升，活化的CD8+T細胞、嗜酸性粒細胞、中心記憶CD4+T細胞、效應記憶CD8+T細胞比例下降。

基于Cibersort、ssGSEA 2種方法創建了相關性熱圖來探索多種免疫細胞之間的差異相關性。如圖10-C、D所示，橙色越深代表正相關性越高，藍色越深代表負相關性越高。基于Cibersort結果，負相關性較高的組合有M0巨噬細胞與M2巨噬細胞、記憶B細胞與初始B細胞、靜息自然殺傷細胞與活化自然殺傷細胞等，正相關性較高的組合有M0巨噬細胞與靜息肥大細胞、M2巨噬細胞與中性粒細胞、M0巨噬細胞與靜息記憶CD4+T細胞等。基于ssGSEA結果，負相關性較高的組合有自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、CD56昏暗自然殺傷細胞與效應記憶CD8+T細胞等。基于ssGSEA的分析結果進一步探索了樞紐基因與免疫細胞之間的相關性（圖10-E），結果表明，樞紐基因與多種免疫細胞之間存在較強相關性，、、均與自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、記憶B細胞呈正相關。、、均與效應記憶CD8+T細胞、活化CD4+T細胞呈負相關。與自然殺傷細胞、骨髓來源的抑制性細胞、活化樹突狀細胞呈正相關，與效應記憶CD8+T細胞呈負相關。然而與效應記憶CD4+、CD8+T細胞和活化CD4+T細胞呈正相關，與自然殺傷細胞、自然殺傷T細胞、記憶B細胞呈負相關。免疫檢查位點分析顯示（圖10-F），AD組腦組織中B2M、CD274、CD28、CD40、CD8A等18個免疫檢查位點與對照組具有明顯差異，故AD可能與免疫細胞檢查位點的激活進而引起炎癥反應有關。

A-免疫基因的篩選；B-GO功能富集分析；C-KEGG通路富集分析。

A、B-LASSO回歸分析結果；C、D-SVM-RFE分析結果；E-樞紐基因、LASSO、SVM-RFE交集結果。

A-5種標志物的受試者工作特征曲線；B-5種標志物的表達水平；***P＜0.001。

A-GSE122063中5種標志物的受試者工作特征曲線；B-GSE122063中5種標志物的表達水平；*P＜0.05 ***P＜0.001。

A-基于5種標志物的列線圖模型；B-列線圖模型的校正曲線；C-列線圖模型的臨床決策曲線；D-列線圖模型的臨床影響曲線。

圖9 5個潛在標志物GSEA富集分析結果

2.10 對AD樞紐基因潛在靶向中藥的預測與分析

將、、、、5個樞紐基因導入Coremine數據庫中，以＜0.05篩選潛在的靶向中藥（圖11），其中匹配到蓖麻子、娑羅子、血竭、石菖蒲、當歸等25味中藥；匹配到石龍子、木鱉子2味中藥；匹配到玉米須、菊苣2味中藥；匹配到旋覆花、金沸草、石斛、甘草、澤蘭等59味中藥；未匹配到中藥，查閱Coremine Library中文獻發現人參、參蘆、參葉、參花對均有一定靶向調控作用，故作為潛在中藥納入分析。查閱《中華本草》及文獻對上述中藥的功效、四氣五味、歸經進行分析，潛在靶向中藥四氣以溫、寒、平為主，五味以辛、苦、甘比例較大，功效以清熱、活血、補虛為主，歸經以肝、肺、脾、胃經居多。參考國家藥食同源目錄進行分類，藥食同源類中藥有菊苣、枸杞子、西紅花、白果、甘草、夏枯草等12味，保健食品產業可添加的有丹參、厚樸花、銀杏葉、川芎、遠志、石斛等12味，兩者均符合的有當歸、人參、玫瑰花3味中藥。選取度值（degree）排名前5的中藥作為關鍵中藥，最后篩選出人參、當歸、厚樸花、遠志、玫瑰花5味中藥（表1）。

A-基于Cibersort的22種免疫細胞的豐度差異；B-基于ssGSEA的28種免疫細胞的豐度差異；C-基于Cibersort的22種免疫細胞類型相關性分析，橙色表示正相關，藍色表示負相關；D-基于ssGSEA的28種免疫細胞類型相關性分析，橙色表示正相關，藍色表示負相關；E-基于ssGSEA的5種標志物與28種免疫細胞相關性分析，紅色表示正相關，綠色表示負相關；F-對照組vs AD組37種免疫檢查位點分析，*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。

2.11 分子對接與分子動力學模擬

將核心中藥導入本草組鑒中查詢化學成分，初步獲取939個化合物，經參數標準和Swiss ADME數據庫篩選后確定香茅醛（CID:7794）、香芹酚（CID:10364）、異丁香酚（CID:853433）、庚醛（CID:8130）、20()-原人參二醇（CID:11213350）5種成分進行對接（表2）。由圖12-A可知，發現20()-原人參二醇、香芹酚、異丁香與樞紐靶點受體之間有較好的結合活性、對接穩定，選擇最佳的-20()-原人參二醇進行動力學模擬。由圖12-B可知，小分子的均方根偏差（root mean square deviation，RMSD）保持穩定，復合物和蛋白的RMSD初期存在波動，中期逐漸穩定，后期存在較小的波動。此外，小分子與蛋白的距離、小分子與初始結合位點的距離在模擬初期存在較大的波動，然后逐漸保持穩定，這表明復合物逐漸到達穩定狀態（圖12-C）。由圖12-D可知復合物的回轉半徑（radius of gyration，Rg）逐漸穩定，表明復合物整體結構逐漸緊密穩健。均方根漲落（root mean square fluctuation，RMSF）分析顯示前期蛋白柔性穩定，后期稍有波動，可能與蛋白調整構像有關（圖12-E）。將兩者的模擬構象進行疊合，復合物中的小分子的疊合構象均在初始結合位點附近，疊合程度高，進一步證明小分子與蛋白結構的穩定性，見圖12-H。氫鍵結果顯示，小分子與蛋白之間的氫鍵數量較低，且較為穩定，主要分布在0～2個（圖12-F）。復合物中范德華力與靜電相互作用在模擬過程中逐漸穩定，這表明小分子與蛋白的穩定結合。選取穩定狀態下的復合物軌跡，使用MM-PBSA的方法計算，得到結合能相關能量項，其中ΔEele為小分子與蛋白之間的靜電相互作用，值為（?136.118±0.777）kJ/mol。ΔEvdw為范德華相互作用，值為（?11.928±1.906）kJ/mol。ΔEpol為極性溶劑化能，可表示靜電勢能，值為（74.884±1.690）kJ/mol。ΔEnonpol為非極性溶劑化能，可表示疏水相互作用，值為（?18.333±0.126）kJ/mol。結合能（ΔEMMPBSA）為ΔEele、ΔEvdw、ΔEpol、ΔEnonpol之和，值為（?91.495±0.531）kJ/mol。ΔGbind為ΔEMMPBSA與?TΔS之和，值為（17.914±4.285）kJ/mol。通過分析發現，復合物的范德華力相互作用ΔEvdw遠高于靜電相互作用能ΔEele和疏水相互作用ΔEnonpol，ΔEvdw為ΔEele的11.4倍，ΔEvdw為ΔEnonpol的7.4倍。范德華力ΔEvdw發揮主要作用，靜電相互作用ΔEele和疏水相互作用ΔEnonpol發揮補充作用。小分子與蛋白的結合能高，二者的親和力高。進一步對ΔEMMPBSA進行分解，獲取各氨基酸對整體結合能的貢獻，蛋白中對各自結合能貢獻較大的殘基如圖12-I、J所示，蛋白中結合小分子的關鍵氨基酸有16ILE、10VAL、18THR、62HIE、99ARG、12ASP、64LEU、96VAL、155SER、17SER等。

*ΔGbind=ΔEvdw＋ΔEele＋ΔEpol＋ΔEnonpol?TΔS

A-候選標志物-靶向中藥網絡；B-中藥功效統計分析；C-中藥四氣統計分析；D-中藥五味統計分析；E-中藥歸經統計分析。

表1 核心中藥前5位拓撲參數

表2 核心化合物ADME參數

A-分子對接；B-RMSD分析；C-質心演變分析；D-Rg分析；E-RMSF分析；F-氫鍵數量分析；H-小分子結合位點分析；I-結構分析；J-殘基貢獻分析。

3 討論

AD是一種以認知功能下降和記憶能力減退為主要臨床表現的一種神經退行性疾病，目前發病機制仍不清楚。免疫機制與AD的發生及發展密切相關。然而，當前在AD研究領域中，關于免疫相關基因的潛在標志物及對應治療中藥方面的報道相對較少，故本研究采用生物信息學方法、機器學習、分子對接、動力學模擬4種方法綜合分析了AD中免疫相關的診斷標志物、浸潤模式、生物途徑、靶向中藥及核心成分預測。

3.1 CSRP1、GFAP、SST、IL4R及NFKBIA是AD免疫相關機制中的核心分子

本研究識別出AD患者5個與對照組具有表達差異的免疫標志物CSRP1、GFAP、SST、IL4R及NFKBIA，與AD的發生發展具有密切關系。因此對其功能與相關調控機制的深入探索有助于加強對AD免疫相關機制的理解，為AD的治療帶來新方向。

研究表明，CSRP1是半胱氨酸和甘氨酸富含蛋白質家族的成員，在細胞結構、細胞黏附、增殖、運動中發揮了重要作用[20]。目前關于CSRP1與AD發病機制的報道較少，郭晨旭等[21]研究發現，CSRP1可以影響腫瘤患者的免疫浸潤進而影響機體免疫穩態。因此靶向CSRP1進而調控AD患者的免疫微環境改善病情有望成為潛在的治療策略。GFAP是一種主要存在于大腦星形膠質細胞中的結構蛋白，是膠質細胞活化和腦損傷或疾病中的重要標志物[22]。臨床研究顯示，患者血液中檢測到高水平GFAP，腦內病理性Tau蛋白會經歷更嚴重的發展，可以作為AD臨床確診前的判斷依據，這與本研究研究結果是一致的[23]。SST是一種廣泛分布于人類中樞神經系統和外周組織的抑制性激素。Han等[24]發現生長抑素遇到銅、Aβ和金屬-Aβ復合物時，會產生大量聚集，以減弱金屬-Aβ復合物的毒性和聚集為主，進而減輕大腦毒性損害。IL4R是是一種受體蛋白，能夠與IL4結合，激活信號傳導通路，從而調節腦內多種免疫細胞的功能。有研究報道IL4主要在神經元和小膠質細胞/巨噬細胞中響應Aβ-42而被激活，并通過神經干/祖細胞（neural stem/progenitor cell，NSPC）中的IL4受體進而誘導信號轉導-轉錄活化因子6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）磷酸化增加NSPC可塑性，可作為AD的藥物治療的候選靶點進一步研究[25]。NFKBIA是一種轉錄因子，可與核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）形成復合物，阻止NF-κB進入細胞核，進而影響免疫反應、凋亡、增殖等生物過程，介導AD的進展。此外，NFKBIA接受沉默信息調節因子1（silent information regulator 1，SIRT1）的調控，進而形成抗衰老的調控網絡，延緩AD等退行性疾病的進展[25]。

3.2 免疫通路及炎癥反應是AD發病機制中的重要環節

根據Cibersort和ssGSEA 2種免疫浸潤結果及相關性分析，發現AD患者組織中M1巨噬細胞、靜息態記憶CD4+T細胞、記憶B細胞、未成熟的樹突狀細胞、活化的CD8+T細胞、嗜酸性粒細胞、中心記憶CD4+T細胞、效應記憶CD8+T細胞等多種免疫類型細胞與AD生物過程密切相關，表明免疫細胞浸潤在AD的發展過程中具有重要作用。據以往研究[26-27]報道，上述免疫細胞大多在AD中處于異常狀態，可導致神經元退行性病變和AD病理狀態的進一步惡化。此外，Aβ也會激活巨噬細胞，產生大量炎性細胞因子和毒性介質，形成神經炎癥，并參與Tau蛋白的聚集和擴散[28]。本研究中的CD4+亞型Th1和Th17效應T細胞被證實可通過下調周圍神經系統和中樞神經系統內調節性T細胞的作用，促進膠質細胞激活和神經炎癥加劇導致AD的病理學發生改變，加重記憶障礙[29]。此外，Machhi等[30]發現相對于對照組，AD患者中初始B細胞比例下降，記憶B細胞增加，活化B細胞釋放的高水平腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）促進AD腦內斑塊的形成，與本研究免疫浸潤結果較為一致。查閱歸納目前文獻，發現近年對AD免疫因素的研究主要集中在T細胞、B細胞、星形膠質細胞、炎性因子等[31-32]，這說明免疫浸潤分析結果的可靠性與一致性，提示未來靶向關鍵基因、調控機體免疫穩態，進而改善AD的策略值得深入探索。本研究還對AD患者的37個免疫檢查位點情況進行了分析，B2M、CD40、CD8A等多個免疫檢查位點具有明顯差異。目前關于靶向免疫檢查位點治療AD的文獻相對較少，未來研究可進一步挖掘潛在標志物、顯著免疫細胞及檢查位點的關聯價值。

富集分析發現免疫細胞的生物功能在B細胞、T細胞及神經發育等通路中顯著富集，也揭示了免疫細胞趨化激活對AD發病及腦內神經元產生了重要的影響。GSEA結果發現尼古丁成癮等通路、糖胺聚糖生物合成途徑、Hippo經典信號通路與這些標志物密切關聯。尼古丁成癮通路被認為是AD藥物的重要通路，通路中的乙酰膽堿受體可以控制乙酰膽堿的釋放，發揮調節大腦中認知功能，拮抗Aβ毒性等作用[33]，可能是治療神經退行性疾病的新策略。糖胺聚糖合成途徑產生的糖胺聚糖既可以與淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursor protein，APP）結合，促進APP的β分泌酶代謝途徑，增加Aβ的含量；又可促進蛋白激酶對Tau蛋白的磷酸化修飾，從而誘導Aβ和Tau蛋白的累積與沉淀[34]。Hippo信號通路是哺乳動物中高度保守的通路，與組織和器官大小及細胞增殖、分化和凋亡密切相關。Wang等[35]發現調節Hippo通路中巨噬細胞刺激蛋白1（macrophage stimulating 1，MST1）可以直接抵抗和改善AD病理特征和臨床癥狀，不需要依賴于清除Aβ。本研究發現5種標志物均與Hippo通路有關，后續可深入研究這些標志物與基因之間的調控關系，以期為AD防治提供新靶點。

3.3 預測的靶向中藥及化合物為調節免疫治療AD提供了參考依據

中醫將AD歸屬于“癡呆”“健忘”“呆病”等范疇。近幾年，由于中醫藥的臨床和基礎研究不斷深入，中醫藥受到了眾多科研工作者的關注。本研究對預測出的靶向中藥進行藥性分析后發現，四氣以溫、寒、平為主，五味以辛、苦、甘比例較大，功效以清熱、活血、補虛為主，歸經以肝、肺、脾、胃經居多。表明這些中藥對關鍵基因的影響可能更為顯著，這不僅與中醫從扶正固本、調和臟腑出發，兼以化痰、祛瘀、補虛治療AD一致[36-37]，也與本研究團隊前期基于肝脾論治AD相關研究吻合[38]。最終經參數篩選出人參、當歸、厚樸花、遠志、玫瑰花5味核心中藥。

經過查閱文獻，發現上述中藥治療AD已經得到了證實。研究報道指出，人參中已確定多種皂苷可以改善退行性疾病的學習和記憶，其中人參皂苷Rg1可能通過抑制核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白1（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 1，NLRP1）炎癥體和自噬功能障礙來緩解Aβ沉積和AD進展[39]。葉長青等[40]研究表明，當歸主要活性成分西托糖苷、β-谷甾醇、豆甾醇可能與蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、前列腺素內-過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）等關鍵靶點結合發揮抗AD的作用。厚樸花中的主要成分是厚樸酚、和厚樸酚[41]，可以抑制活性氧生成、細胞內Ca2+濃度升高和半胱天冬酶活性，對抗β-淀粉樣蛋白誘導的PC12細胞死亡，產生神經保護作用[42]。遠志中的皂苷能夠通過調節磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）/Akt信號通路顯著提高和延長轉Tau基因果蠅AD模型的生存時間[43]。玫瑰花總黃酮能明顯調控PI3K/Akt信號通路和內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）途徑抑制神經細胞凋亡，發揮神經保護作用[44]。從諸多藥理研究中不難發現這些中藥均有靶向治療AD的作用，因此臨床上此類中藥既可組方配伍，又可作為“援藥”進行化裁，提高臨床療效[45]。企業及科研機構還可以基于“治未病”與“精準營養”[46]的思想，大力挖掘其中的藥食價值，加強成果轉化，開發多種形式產品，保障人民健康，發揮中醫藥優勢。分子對接顯示，(20)-原人參二醇與5個生物標志物對接穩定，具有良好的結合能力。將最佳對接結果IL4R-(20)-原人參二醇進行了動力學模擬驗證，發現在模擬過程中，小分子與蛋白形成的氫鍵數量少而穩定，親和力好，關鍵氨基酸有16ILE、10VAL、18THR、62HIE、99ARG、12ASP、64LEU、96VAL、155SER、17SER等，對接結合能高，范德華力相互作用遠高于靜電相互作用和疏水相互作用，范德華力發揮主要作用，靜電相互作用和疏水相互作用發揮補充作用。相關研究[47-48]證實(20)-原人參二醇可以通過刺激分泌性糖蛋白（wingless/integrated，Wnt）/糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/β-連環蛋白（β-catenin）通路，促進增強海馬神經再生，抑制氧化應激，上調海馬中早期生長反應因子（early growth responsive gene-1，Egr-1）、FBJ骨肉瘤癌基因（c-Fos）和Jun原癌基因（Jun proto-oncogene，c-Jun）等多種途徑來改善AD模型小鼠的記憶障礙。上述模擬結果和文獻報道說明(20)-原人參二醇與標志物相互作用良好，且具有較強的藥效作用，可作為AD免疫標志物的靶向藥物進一步研究，為AD的免疫治療提供了新證據。

4 結論

本研究利用多種技術分析了AD免疫相關的標志物和浸潤模式，通過關鍵基因富集分析得到了AD相關的生物過程及信號通路，為免疫調控AD提供了一定的依據，進一步明確了AD的發病機制。最后通過潛在標志物和藥食同源目錄，預測得到了藥食同源中藥及核心成分，對其藥性功效進行了分析，豐富了中醫藥從微觀機制治療AD的理論內涵，為臨床工作者及相關藥企進一步研究AD的分子機制、藥物設計、保健食品研發提供一定的參考依據。但本研究仍然存在以下不足：（1）初步合并了AD芯片對AD免疫相關基因進行了探索，后續工作應注重AD患者腦區分類，以期篩選更精確的標志物；（2）中藥化合物數據庫使用單一，后續可擴大數據庫種類，以獲得更為豐富的化合物數量進行預測篩選；（3）本研究基于生物數據庫和模擬計算，故結果仍需實驗及臨床觀察進一步驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification of immune-related biomarkers of Alzheimer’s disease and prediction of medicine-food homology traditional Chinese medicines based on bioinformatics analysis and dynamic simulation

LIANG Pengpeng, WANG Yale, HUANG Hai, LI Guiyun, WU Hongyan

Shenzhen Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shenzhen 518004, China

To analyze the immune-related biomarkers, pathogenesis, levels of immune infiltration and potential homology herbs in Alzheimer’s disease (AD).The expression profiles of GSE5281 and GSE132903 were downloaded from GEO database to obtain AD differentially expressed genes (DEGs). The relevant module genes of AD were identified using a weighted co-expression algorithm, and the immune-related genes were subsequently obtained from the ImmPortal database. The intersection of the above mentioned genes was used to obtained to obtain the set of essential immune differential genes. The analysis was then performed using least absolute shrinkage and selection operator (LASSO) and support vector machine - recursive feature elimination (SVM-RFE) methods to screen for common immune biomarkers of AD. Biological pathways were explored through gene ontology (GO) and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG), and gene set enrichment analysis (GSEA). The receiver operator characteristic (ROC) curve was used to evaluate the diagnostic capability of these candidate markers, and validated them in GSE122063 dataset. Besides, we established clinical nomograms and curves for clinical application evaluation. The cell-type identification by estimating relative subsets of RNA transcripts(Cibersort) and single-sample gene set enrichment analysis (ssGSEA) were used to analyze immune cell infiltration in the samples. Finally, Coremine Medical and Herb databases were used to analyze traditional Chinese medicines (TCMs) and components, and molecular docking and kinetic simulation were carried out.A total of 1 360 differential genes and five biomarkers including cysteine and glycine rich protein 1 (), glial fibrillary acidic protein (), interleukin 4 receptor (), somatostatin (), and nuclear factor-kappa B inhibitor alpha () were screened. GO analysis shows that AD is strongly correlated with positive regulation of neural development and cell development. The KEGG and GSEA enrichment results indicated that AD is most closely related to the B-cell receptor signaling pathway and the glycosaminoglycan biosynthesis pathway. Immune infiltration analysis showed that the proportion of macrophages, memory B cells and central memory CD8+T cells in AD brain tissue was increased, while the proportion of initial CD4+T cells, activated CD8+T cells and effector memory CD8+T cells decreased, and there were significant differences in B2M, CD40 and other examination sites. There were 82 potential TCMs, including Renshen (et), Danggui () and Houpohua (). Moreover, their four properties and five flavors are mainly warm, cold, flat, bitter, and sweet, and belong to the liver, lung, spleen, and stomach passages, with the effect of clearing heat, promoting blood, and tonifying deficiency. Molecular docking and kinetic simulation showed that 20()-protopanaxadiol was stable in docking with markers.The biomarkers and immune-related mechanisms of AD were screened and explained through various methods. Medicine-food homologous TCMs such aset,andare expected to be a significant source for AD drug development. This study sheds new light on the pathogenesis, clinical treatment, and novel drugs for AD.

Alzheimer’s disease; weighted coexpression analysis; machine learning; immune infiltration; biomarkers;et;;; 20()-protopanaxadiol

R285

A

0253 - 2670(2024)08 - 2667 - 17

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.017

2023-11-20

深圳市“醫療衛生三名工程”項目（SZZYSM202201007）；羅湖區軟科學研究計劃項目（LX20210101）；羅湖區軟科學研究計劃項目（LX202302101）

梁朋朋（1996—），男，博士研究生，研究方向中醫藥治療心腦血管疾病研究。E-mail: l17864190755@163.com

通信作者：吳紅彥（1963—），男，教授，博士研究生導師，從事中醫老年病研究。E-mail: wu.hy@163.com

[責任編輯 潘明佳]