體外共孵育法研究腸道菌群對蒼術炒焦前后醇提物及增量成分蒼術苷A的代謝規律

曹皇亮，劉春蓮，陳高源，姚 丁，肖揚鑫，劉艷菊*

體外共孵育法研究腸道菌群對蒼術炒焦前后醇提物及增量成分蒼術苷A的代謝規律

曹皇亮1, 2, 3，劉春蓮1, 2, 3，陳高源1, 2, 3，姚 丁1, 2, 3，肖揚鑫1, 2, 3，劉艷菊1, 2, 3*

1. 湖北中醫藥大學藥學院，湖北 武漢 430065 2. 湖北省中藥炮制技術工程中心，湖北 武漢 430065 3. 湖北時珍實驗室，湖北 武漢 430065

明確生、焦蒼術醇提物在腸道菌群作用下成分的代謝差異，以及關鍵增量成分蒼術苷A的代謝轉化規律。采用體外共孵育方法，將生蒼術、焦蒼術醇提物以及炒焦增量成分蒼術苷A與小鼠腸道菌液共孵育，運用UHPLC-LTQ-Qrbitrap技術，分析生蒼術、焦蒼術醇提物共孵育后的轉化情況，并對蒼術苷A的代謝產物進行鑒定分析。生蒼術、焦蒼術醇提物與小鼠腸道菌群共孵育后原型成分蒼術苷A、5-羥甲基糠醛、蒼術素、白術內酰胺、2-(聯苯基-4-基)乙醛、二乙酰蒼術素醇、白術內酯II、羥甲香豆素、乙酰蒼術素醇、白術內酯I、β-石竹烯、3β-乙酰氧基蒼術酮、蒼術酮13種成分峰面積均降低，其中，蒼術素、二乙酰蒼術素醇、羥甲香豆素、蒼術酮4個成分在焦蒼術中降低尤為明顯；3β-乙酰氧基-白術內酯I、β-香根草烯、白術內酯III、愈創木烯、芹烷二烯酮5個成分峰面積在生、焦蒼術醇提物與菌群共孵育后均增加，其中，3β-乙酰氧基-白術內酯I、愈創木烯、芹烷二烯酮在焦蒼術中增加尤為明顯；蒼術苷A經腸道菌群代謝轉化產生了新成分，根據數據分析，推測出其中與其羥化、羰基化、乙?；嚓P的4種代謝物。腸道菌群對生蒼術、焦蒼術醇提物成分有轉化作用，且對2種飲片成分代謝轉化程度存在差異，大多成分在焦蒼術中轉化（或生成）率更高，這可能是焦蒼術增強固腸止瀉作用關鍵原因；蒼術苷A的代謝產物鑒定結果進一步驗證了腸道菌群對成分影響的關鍵作用。

蒼術；焦蒼術；蒼術苷A；腸道菌群；成分轉化；體外共孵育法；UHPLC-LTQ-Qrbitrap技術；蒼術素；二乙酰蒼術素醇；羥甲香豆素；蒼術酮；3β-乙酰氧基-白術內酯I；β-香根草烯；白術內酯III；愈創木烯；芹烷二烯酮

蒼術為菊科植物茅蒼術(Thunb.) DC.或北蒼術(DC.) Koidz.的干燥根莖，味辛、苦，性溫，歸脾、胃、肝經，是臨床常用中藥，具有燥濕健脾、祛風散寒、明目之功效[1]。臨床上常用蒼術炮制品有麩炒蒼術和焦蒼術。蒼術苷A為愈創木烷型倍半萜苷類化合物，課題組前期以茅蒼術為對象，研究發現蒼術炒焦前后化學成分的種類變化不明顯，但部分成分含量差異顯著，其中蒼術苷A的含量增加50%以上[2-4]。蒼術炒焦后固腸止瀉作用增強，課題組已證明，腸道菌群在焦蒼術增強藥效作用上發揮了關鍵作用，焦蒼術可調整模型動物腸道菌群結構和豐度，增加有益菌的豐度、降低有害菌的豐度，并影響腸道菌群的代謝物短鏈脂肪酸[5]，且蒼術苷A具有與焦蒼術類似作用[6]。腸道菌群作為一個復雜的微生態系統，在保障和調節機體功能上發揮重要作用[7-8]。大多數中藥經口服給藥后，其成分不可避免地與腸道菌群發生相互作用。研究表明，腸道菌群能產生各種代謝酶，特異性地參與中藥有效成分的代謝與結構重塑，使中藥有效成分表現出不同的藥理與毒理活性[9-10]。課題組前期研究表明，蒼術炒焦后增量成分蒼術苷A具有促進胃腸動力和保護胃黏膜，對抗消化道炎癥的作用，但其口服生物利用度較低[11-12]。因此推測蒼術苷A可能在腸道菌群的作用下轉變為易吸收的成分，從而發揮藥物療效。

基于上述研究基礎，為進一步探討腸道菌群對生、焦蒼術成分轉化的影響及其差異比較，初步闡明焦蒼術發揮藥效的物質基礎，本實驗采用體外共孵育法，運用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術研究腸道菌群對生、焦蒼術醇提物及炮制增量成分蒼術苷A轉化的影響，并深入分析蒼術苷A的代謝產物，以期從腸道菌群對成分影響角度，揭示蒼術炒焦增強“固腸止瀉”的物質基礎。本研究結果為進一步深入研究蒼術醇提物的體內菌群代謝以及蒼術苷A的關鍵代謝菌種分析提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

THZ-98AB型恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司；ES 225SM-MR電子天平，瑞士Precisa公司；1580R型離心機，中國基因有限公司；Thermo U3000液相色譜儀、Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL組合式高分辨質譜儀，美國Thermo Fisher公司；Xcalibur軟件用于數據采集和處理。

1.2 藥材與試劑

蒼術藥材采自湖北省英山縣，經湖北中醫藥大學藥學院楊紅兵教授鑒定為菊科蒼術屬植物茅蒼術(Thunb.) DC.的干燥根莖。

蒼術苷A，批號PS011500，購自成都普思生物科技有限公司，質量分數大于98.0%，適用于UPLC-LTQ-Orbitrap分析。HPLC級乙腈和甲醇，色譜純，德國Merck公司；甲酸，色譜純，阿拉丁公司；純凈水自制，艾柯實驗室超純水機，成都艾柯水處理設備有限公司；通用厭氧培養液購自青島海博生物技術有限公司。

1.3 動物

體質量（20±2）g，雄性ICR小鼠10只，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證書：SCXK（遼）2020-0001。動物研究按照湖北中醫藥大學動物倫理委員會（中國武漢）批準的指導方針進行（批準代碼：00273286，2021年12月10日）。

2 方法與結果

2.1 腸道菌群對生蒼術、焦蒼術醇提物化學成分體外代謝轉化研究

2.1.1 生蒼術、焦蒼術醇提物的制備

（1）生蒼術、焦蒼術飲片的制備：按《中國藥典》2020年版制備生蒼術飲片，按《湖北省中藥飲片炮制規范》2018年版制備焦蒼術飲片。

（2）生蒼術、焦蒼術醇提物的制備：取生蒼術、焦蒼術飲片，粉碎，過三號篩，分別用8倍量80%乙醇浸泡過夜，超聲提取3次，每次2 h，合并提取液并濾過，濃縮后冷凍干燥成凍干粉，置于?20 ℃保存，備用[5]。

2.1.2 厭氧培養基（GAM）的制備 稱取厭氧培養粉9.5 g，加熱攪拌溶解于1 000 mL蒸餾水中，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，備用[13]。

2.1.3 小鼠腸道細菌混懸液的制備 收集10只正常ICR小鼠新鮮糞便混勻，稱定質量并以每g小鼠新鮮糞便用4 mL滅菌PBS（含0.01%半胱氨酸）的比例進行勻漿，2 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，獲得上清液作為小鼠腸道菌群混合物。

2.1.4 共孵育樣品的制備 取適量生、焦蒼術提取液凍干粉，分別用厭氧培養基配制成質量濃度為500 mg/mL的生、焦蒼術醇提物溶液，取1 mL接種到9 mL厭氧培養液中作為對照組，再取1 mL 500 mg/mL的生、焦蒼術醇提物溶液分別接種到含有1 mL小鼠腸道菌群混懸液和8 mL厭氧培養液中作為實驗組，平行操作2次。厭氧條件下于恒溫振蕩器37 ℃、150 r/min孵育72 h，然后向孵育的溶液中按1∶1加入乙腈以終止反應，12 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，上清液氮吹至干，殘渣用0.3 mL甲醇溶解，于UHPLC-LTQ-Orbitrap分析。

2.1.5 色譜與質譜條件

（1）色譜條件：采用Welch Xtimate?UHPLC C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱；采用含0.1%甲酸水溶液-乙腈流動相體系，梯度洗脫：0～15 min，20%～50%乙腈；15～30 min，50%～60%乙腈；30～35 min，60%～95%乙腈；35～45 min，95%乙腈；45～46 min，95%～20%乙腈；46～56 min，20%乙腈。體積流量為0.3 mL/min；注射量5 μL。

（2）質譜條件：電噴霧離子源（ESI）正離子模式，鞘氣（N2）和輔助氣（Ar）體積流量分別為40 arb和10 arb；毛細管溫度為300 ℃；離子源電壓2.5 kV，電流100 μA；一級質譜采集范圍/100～1 000，分辨率為60 000。多級質譜采用高能碰撞誘導解離（HCD）模式，依賴一級質譜掃描中的第1到第4強峰，分辨率設為15 000；HCD裂解能量為歸一化能量50%。

2.1.6 體外代謝轉化分析結果 運用UHPLC-LTQ-Orbitrap技術，在正離子模式下分析蒼術、焦蒼術醇提物與小鼠腸道菌群共孵育后成分轉化情況，圖譜見圖1。根據HMDB數據庫，結合與對照品比對，共鑒定了18個成分，計算在菌群條件下上述18種成分峰面積變化率，計算公式為成分變化率＝(共孵育對照組成分峰面積－共孵育實驗組成峰面積)/對照組成分峰面積，結果見表1、2。實驗結果表明，蒼術、焦蒼術醇提物與小鼠腸道菌群共孵育后成分變化規律一致，蒼術苷A、蒼術素等13個成分峰面積均降低，其中蒼術苷A、5-羥甲基糠醛、蒼術素、白術內酰胺、2-(聯苯基-4-基)乙醛、二乙酰蒼術素醇、羥甲香豆素、乙酰蒼術素醇、白術內酯I、β-石竹烯、蒼術酮11種成分，在焦蒼術醇提物菌群共孵育組的峰面積下降率高于生蒼術菌群共孵育組；而3β-乙酰氧基-白術內酯I、β香根草烯、白術內酯III、愈創木烯、芹烷二烯酮5個成分峰面積在生、焦蒼術醇提物與菌群共孵育后均增加，其中3β-乙酰氧基-白術內酯I，愈創木烯和芹烷二烯酮在焦蒼術醇提物與菌群共孵育組峰面積增加率高于生蒼術菌群共孵育，可見生、焦蒼術醇提物中同一成分共孵育后變化趨勢一致，但變化率存在差異，對該差異進行比較，計算公式為Δ變化率＝焦蒼術共孵育實驗組變化率－生蒼術共孵育實驗組變化率，結果見表3。上述結果表明，生、焦蒼術醇提物中的成分能夠在腸道菌群作用下發生代謝轉化。其中蒼術苷A、白術內酯I、白術內酯II、3β-乙酰氧基蒼術酮4種共有成分均被轉化而使成分峰面積顯著降低，但它們在生、焦蒼術2種醇提物中成分轉化率相差較小，即Δ變化率均在±5%以內；蒼術素、二乙酰蒼術素醇、羥甲香豆素、蒼術酮等雖也是被轉化而降低的成分，但它們在焦蒼術中成分降低的更為明顯，Δ變化率在15%以上。同時，因轉化生成而增加的成分中，3β-乙酰氧基-白術內酯I、愈創木烯、芹烷二烯酮3種成分在焦蒼術中增加的更為明顯，而白術內酯III在生蒼術中增加的更明顯。綜合分析認為，在復雜的物質環境下，腸道微生態對2種飲片中的物質轉化趨勢一致，較多成分表現出在焦蒼術中更有利于被轉化或被生成。

A-生蒼術對照組；B-生蒼術實驗組；C-焦蒼術對照組；D-焦蒼術實驗組。

表1 生蒼術醇提物與腸道菌群共孵育的UPLC-LTQ/Orbitrap-MS/MS定性分析結果

“↑”表示實驗組中成分峰面積增加；“↓”表示實驗組中成分峰面積降低；表2同。

“↑” indicates an increase in peak area of components in experimental group; “↓” indicates a decrease in peak area of components in experimental group, same as table 2.

表2 焦蒼術醇提物與腸道菌群共孵育的UPLC-LTQ/Orbitrap-MS/MS定性分析結果

表3 生蒼術醇提物和焦蒼術醇提物與腸道菌群共孵育的峰面積變化率比較

“↑”表示共孵育后該成分增加，“↓”表示共孵育后該成分降低；“+”表示焦蒼術變化率高于生蒼術，“?”表示焦蒼術變化率低于生蒼術。

“↑” indicates that the component increases after co-incubation, and “↓” indicates that the component decreases after co-incubation; “+” means that the change rate of deep-friedis higher than that of, and “?” means that the change rate of deep-friedis lower than that of

2.2 腸道菌群對蒼術苷A的體外代謝轉化研究

2.2.1 厭氧培養基和腸道細菌混懸液的制備 按“2.1.2”和“2.1.3”項的方法制備厭氧培養基及小鼠腸道細菌混懸液。

2.2.2 樣品制備 精密稱取蒼術苷A適量，溶解在純水中，制備成質量濃度為1 mg/mL的蒼術苷A溶液[14]。將1 mL蒼術苷A溶液接種到1 mL厭氧培養基中作為對照組，再將1 mL蒼術苷A溶液接種到含有0.2 mL小鼠腸道菌群混懸液和0.8 mL厭氧培養基中作為實驗組。將對照組和實驗組樣品于厭氧環境下37 ℃培養72 h。經過孵育后，向培養的溶液中加入1∶1乙腈以終止反應。12 000 r/min離心（離心半徑10 cm）10 min，上清液氮吹至干，殘渣用0.3 mL甲醇溶解，進樣分析。

2.2.3 色譜與質譜條件 同“2.1.5”項。

2.2.4 代謝產物的鑒定 采用所建立的UPLC-LTQ-Orbitrap方法對蒼術苷A及其代謝產物進行檢測分析，蒼術苷A與腸道菌群共孵育對照及實驗組TIC圖見圖2。由蒼術苷A與腸道菌群共孵育前后TIC圖可見，蒼術苷A經腸道菌群代謝轉化產生了新的成分，從峰面積看，與對照組比較，菌群共孵育組蒼術苷A轉化率為99.5%，同時出現許多新增峰。蒼術苷A為愈創木烷型倍半萜糖苷類化合物，倍半萜糖苷類化合物生物轉化途徑主要為脫葡萄糖、氧化，倍半萜的生物轉化主要有羥化、羰基化、乙?；萚15-16]，經提取離子流圖，結合倍半萜主要轉化途徑，推測出4種蒼術苷A（a）可能的代謝產物（b～e），蒼術苷A與代謝產物轉化關系見圖3，蒼術苷A及其代謝產物鑒定結果見表4，蒼術苷A與代謝產物的提取離子流圖見圖4～8，根據峰面積計算在菌群條件下蒼術苷A成分變化率，計算公式為峰面積變化率＝(對照組蒼術苷A峰面積－實驗組蒼術苷A峰面積)/對照組蒼術苷A峰面積。

圖2 蒼術苷A與菌共孵育前后TIC圖

通過分析蒼術苷A對照品的實驗數據，首先對供試品蒼術苷A（a）進行了鑒定。蒼術苷A在/447.223 9（C21H36O10，質量偏差＝3.13×10?6）具有[M－H]?離子，保留時間為1.30 min，主要碎片離子為/285.173 7、267.163 2、101.025 8、89.025 7、59.014 9，蒼術苷A提取離子流圖及二級質譜圖見圖4。

代謝產物b，保留時間和母離子分別為1.98 min和/285.173 7。通過從蒼術苷A脫去1分子葡萄糖（/162）得到/285.173 7，進一步分子內脫水產生/267.163 5的碎片離子，代謝產物b提取離子流圖及二級質譜圖見圖5。

代謝產物c的保留時間和母離子分別為4.95 min和/461.201 7。通過從蒼術苷A羰基化產生/461.201 7，進一步分子內脫水產生/443.162 0的碎片離子，代謝產物c提取離子流圖及二級質譜圖見圖6。

圖3 蒼術苷A與代謝產物轉化關系推導

“?”表示未檢出，“↑”表示共孵育后該成分增加，“↓”表示共孵育后該成分降低。

“?” indicates that the component is not detected, “↑” indicates that the component is increased after co-incubation, and “↓” indicates that the component is decreased after co-incubation.

代謝產物d，保留時間和母離子分別為13.08 min和/405.248 8。通過從蒼術苷A脫甲基化和脫羰基產生/405.248 8，進一步脫葡萄糖產生/243.314 1的碎片離子，代謝產物d提取離子流圖及二級質譜圖見圖7。

代謝產物e，保留時間和母離子分別為14.74 min和/489.328 0。通過蒼術苷A乙酰化產生/489.328 0，進一步脫葡萄糖產生/327.221 9的碎片離子，代謝產物e提取離子流圖及二級質譜圖見圖8。

根據精確相對分子質量和多級質譜碎片等相關信息，初步分析并鑒定了蒼術苷A經腸道菌群代謝的4種產物。結果顯示，蒼術苷A的可能的代謝途徑包括脫葡萄糖、氧化、去甲基化、脫水和乙?；?。比較蒼術苷A與腸道菌群共孵育前后各成分峰面積，蒼術苷A與腸道菌群共孵育后實驗組峰面積較對照組降低99.5%，說明轉化較完全。在實驗組中檢測到蒼術苷A的代謝產物b～e的峰面積較高，而這些成分在對照組中極低甚至未檢測到，表明蒼術苷A能夠被腸道菌群幾乎完全轉化代謝。

圖5 代謝產物b提取離子流圖及二級質譜圖

圖6 代謝產物c提取離子流圖及二級質譜圖

3 討論

本實驗采用的UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術是復雜中藥化學成分快速鑒定的最主要技術之一，可以在缺少對照品的情況下對中藥化學成分進行快速篩查與確認。該技術較傳統LC-MS，可實現多級質譜碎裂和母離子的高分辨采集，是復雜物質體系中化學成分快速分析的有效手段。

圖7 代謝產物d提取離子流圖及二級質譜圖

圖8 代謝產物e提取離子流圖及二級質譜圖

目前腸道代謝的研究方法主要包括體內法、在體法以及體外法[17]。其中，體外法是研究藥物在腸內代謝的主要方法，具有簡單易行、重復性高的優點，能夠排除體內的干擾因素，從而更好地控制代謝條件[18]。在腸道菌群實驗中，糞便溫孵法是體外研究腸道菌群對藥物代謝較認可并被普遍使用的方法，是指將含有細菌的人、小鼠或其他動物的新鮮糞便與藥物混勻，37 ℃厭氧培養，應用LC-MS、GC-MS等現代儀器分析技術檢測藥物原型及其代謝產物的種類和數量[19]。通過檢索國內外文獻，發現共孵育方法較常用，所用的腸道菌群多采自正常動物[20-23]，因此，本實驗采用正常小鼠的腸道菌群體外共孵育，糞便隨時可取，方法操作方便，結果重復性強。

課題組前期對蒼術、焦蒼術的體外化學成分已進行比較研究，結果表明生、焦蒼術醇提物二者成分種類相同，但含量相差較大[2-4]，初步明確二者發揮藥效的物質基礎有所不同，其中蒼術苷A為炮制后增量明顯成分；實驗已驗證腸道菌群是焦蒼術醇提物和蒼術苷A發揮固腸止瀉作用的關鍵因素[5]，但是蒼術、焦蒼術醇提物進入體內后，在腸道微生態環境下，相關成分如何轉化尚不清楚；有研究表明，蒼術炒焦后增量成分蒼術苷A具有促進胃腸動力和保護胃黏膜，對抗消化道炎癥的作用，但其口服生物利用度較低[11-12]，而目前尚未見關于蒼術苷A的藥效是否與腸道菌群的代謝有關報道。為此，作者為全面分析蒼術、焦蒼術醇提物在腸道菌群作用下的代謝情況，為獲得豐富的成分轉化信息，運用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技術，采用體外共孵育法，較好模擬體內轉化環境，且成分分析相對簡單。由于中藥成分復雜性以及體內代謝的復雜和未知性，研究蒼術、焦蒼術醇提物體內代謝難度較大，因此本實驗首先選擇體外共孵育法初步研究分析。將蒼術、焦蒼術醇提物與小鼠腸道菌液進行體外共孵育，考察腸道菌群對蒼術、焦蒼術醇提物化學成分以及增量成分蒼術苷A的代謝轉化作用。結果原型成分蒼術苷A、5-羥甲基糠醛、蒼術素等11種成分在焦蒼術醇提物與菌共孵育后的峰面積下降率高于生蒼術共孵育，而3β-乙酰氧基-白術內酯I，愈創木烯和芹烷二烯酮在焦蒼術醇提物與菌共孵育后的峰面積增加率高于生蒼術共孵育。推測菌群共孵育前后化學成分的變化是焦蒼術藥效優勢的關鍵所在，代謝差異的原因可能與2種提取物的整體化學環境、生物環境有關。

進一步分析了腸道菌群對蒼術苷A的轉化規律，根據精確分子量和多級質譜碎片等相關信息，初步分析并鑒定了蒼術苷A的4個腸道菌群代謝產物。結果顯示，蒼術苷A的可能代謝途徑包括脫葡萄糖、氧化、去甲基化、脫水和乙酰化。比較蒼術苷A與菌共培養前后各成分峰面積，蒼術苷A與腸道菌群共培養后實驗組峰面積較對照組降低99.5%，在實驗組中檢測到蒼術苷A的代謝產物b～e的峰面積較高，而這些成分在對照組中極低甚至未檢測到。表明蒼術苷A能夠被腸道菌群幾乎完全轉化代謝。關于代謝產物b～e 4種成分的進一步鑒定，課題組試圖購買對照品比對驗證，但均未如愿買到對照品，故本結果主要以數據庫比對和分析推導確定；也由于本實驗儀器所限無法對更多的代謝物進行鑒定，這些問題將是后期需要進一步研究的內容。本研究結果為初步明確焦蒼術及蒼術苷A發揮藥效的物質基礎提供實驗依據。由于體外共孵育與體內環境相比，會存在溫度、pH值、養分供應、宿主因素、菌群動態變化等方面的不同可能會影響腸道菌群與藥物之間的相互作用，需要進一步的體內驗證。本研究通過體外共孵育研究獲得的結果為復雜的體內代謝研究提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S]. 一部. 2020: 168.

[2] 孫雄杰. 蒼術炒焦工藝及炒焦前后藥效學與化學成分對比研究 [D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2016.

[3] 陳祥勝, 劉艷菊, 陳海霞, 等. 蒼術炒焦前后GC指紋圖譜的比較 [J]. 中國實驗方劑學雜志, 2018, 24(2): 24-28.

[4] 陳海霞, 陳祥勝, 謝穎, 等. 蒼術炒焦前后蒼術苷A的含量比較研究 [J]. 時珍國醫國藥, 2019, 30(6): 1346-1348.

[5] Liu C L, Song C C, Wang Y,. Deep-friedrhizome alleviates spleen deficiency diarrhea-induced short-chain fatty acid metabolic disorder in mice by remodeling the intestinal flora [J]., 2023, 303: 115967.

[6] 許靜. 基于腸道菌群與TLR4/NF-κB通路研究蒼術苷A對脾虛泄瀉小鼠的藥效機制 [D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2022.

[7] 袁榛. 肝氣乘脾證泄瀉小鼠的腸道菌群特征研究[D]. 長沙: 湖南中醫藥大學, 2021.

[8] 田學梅, 王慧, 梁浩, 等. 腸道菌群與中醫體質相關性研究 [J]. 世界中醫藥, 2023, 18(3): 395-400.

[9] 於李龍, 陳文華, 秦路平, 等. 中藥與腸道菌群相互作用的研究進展 [J]. 浙江中西醫結合雜志, 2022, 32(9): 881-884.

[10] 張亦瑤, 王俊豪, 郝海紅. 腸道微生物群與藥物相互作用的研究進展[J]. 微生物學報, 2023, 63(12): 4536-4554.

[11] 涂濟源. 蒼術炮制前后關鍵變化成分藥效學及體內代謝規律研究[D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2019.

[12] 于艷, 袁媛, 賈天柱, 等. 蒼術炮制前后化學成分及藥理作用研究近況 [J]. 時珍國醫國藥, 2016, 27(1): 189-191.

[13] 張意涵. 蒼術的化學物質基礎與代謝組學研究[D]. 上海: 上海中醫藥大學, 2019.

[14] Xu J, Liu C L, Shi K,. Atractyloside-A ameliorates spleen deficiency diarrhea by interfering with TLR4/ MyD88/NF-κB signaling activation and regulating intestinal flora homeostasis [J]., 2022, 107: 108679.

[15] 王佳, 游松, 周麗娜. 倍半萜生物轉化的研究進展 [J]. 沈陽藥科大學學報, 2012, 29(2): 156-164.

[16] 鄧愛平, 李穎, 吳志濤, 等. 蒼術化學成分和藥理的研究進展 [J]. 中國中藥雜志, 2016, 41(21): 3904-3913.

[17] 高佳雪, 丁晶鑫, 王靖雅, 等. 中藥化學成分腸道代謝的研究 [J]. 哈爾濱商業大學學報: 自然科學版, 2018, 34(1): 20-23.

[18] 周慧慧, 環誠, 薛志鵬, 等. HPLC-Q-TOF-MS/MS分析丹參-紅花藥對在離體腸道菌群中的代謝產物[J]. 藥學學報, 2022, 57(11): 3371-3377.

[19] 李麗萍, 蔣惠娣. 腸道菌群對菊花提取物的代謝作用 [J]. 中草藥, 2006, 37(7): 1001-1004.

[20] 楊寶, 范真, 周聯, 等. 大鼠腸道菌群對紫丁香苷體外代謝轉化研究 [J]. 中草藥, 2015, 46(9): 1333-1337.

[21] 韓冰, 李靜娜, 呂西雨, 等. 腸道菌群代謝轉化中藥皂苷類成分研究進展[J]. 中草藥, 2023, 54(20): 6922-6932.

[22] Dong G M, Yu H, Pan L B,. Biotransformation of timosaponin BII into seven characteristic metabolites by the gut microbiota [J]., 2021, 26(13): 3861.

[23] Mi Y G, Xu X Y, Hong L L,. Comparative characterization of the ginsenosides from sixherbal extracts and theirrat gut microbial metabolites by advanced liquid chromatography-mass spectrometry approaches [J]., 2023, 71(24): 9391-9403.

Metabolic regularity of intestinal flora on alcohol extracts ofbefore and after stir-frying and incremental component atractyloside A byco-incubation method

CAO Huangliang1, 2, 3, LIU Chunlian1, 2, 3, CHEN Gaoyuan1, 2, 3, YAO Ding1, 2, 3, XIAO Yangxin1, 2, 3, LIU Yanju1, 2, 3

1. College ofPharmacy, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2. Hubei Engineering Research Center of Chinese Material Medica Processing Technology, Wuhan 430065, China 3. Hubei Shizhen Laboratory, Wuhan 430065, China

To clarify the metabolic differences of ethanol extract of Cangzhu () and ethanol extract of deep-friedunder the action of intestinal flora, as well as the metabolic transformation rules of the key component atractyloside A.This study adopted furtherco-incubation method to co-incubate ethanol extract of, ethanol extract of deep-fried, and atractylodes A, the incremental component of stir-coke, with mouse intestinal bacterial solution. UHPLC-LTQ-Orbitrap technology was used to analyze the transformation of ethanol extract ofand ethanol extract of deep-friedafter co-incubation and the metabolites of atractyloside A were identified and analyzed.The peak area of 13 components of atractyloside A, 5-hydroxymethylfurfural, atractylodin, atractylenolactam, 2-(bipheny-4-yl)acetaldehyde, diacetylatractylodinol, atractylenolide II, hymecromone, acetylatractylodinol, atractylenolide I, β-caryophyllene, 3β-acetoxyatractyloketone, atractylodes ketone were all decreased after co-breeding with the intestinal flora of mice. Atractylodin, diacetylatractyloside alcohol, hymecromone, atractylon were particularly decreased in deep-fried. The peak area of 3β-acetoxy-atractylenolide Ⅰ, β-vetiverene, atractylenolide III, guaiene and 7(11)-dien-8-one increased after co-culture of ethanol extract ofand ethanol extract of deep-friedwith bacterial community, and the increase of 3β-acetoxy-atractylenolide Ⅰ, guaiene and selina-4(14),7(11)-dien-8-one was particularly obvious in deep-fried. Atractyloside A was metabolized by intestinal flora to produce new components. According to the data analysis, four metabolites related to hydroxylation, carbonylation and acetylation were deduced.The intestinal flora had a transformation effect on ethanol extracts ofand deep-fried, and there were differences in the metabolic transformation degree of two components, and most components had a higher transformation (or formation) rate in ethanol extract of deep-fried, which may be the key reason for the enhancement of intestinal strengthening and anti-diarrhea effect of ethanol extract of deep-fried. The metabolic product identification results of atractyloside A further verified the key role of intestinal flora in the influence of components.

; deep-fried; atractylodes A; gut microbiota; component transformation;co-incubation method; UHPLC-LTQ-Orbitrap technology; diatractylodin; diacetylatractylodinol; hymecromone; atractylodes ketone; 3β-acetoxy-atractylenolide I; β-vetiverene; atractylenolide III; guaiene; selina-4(14),7(11)-dien-8-one

R283.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2641 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.015

2023-09-27

國家自然科學基金資助項目（82074018）；湖北省中央引導地方發展項目（2020ZYYD030）

曹皇亮，碩士研究生，研究方向為中藥飲片炮制工藝、質量控制及原理。E-mail: 1160349122@qq.com

通信作者：劉艷菊，博士生導師，教授，研究方向為中藥飲片炮制工藝、質量控制及原理。Tel: (027)68890101 E-mail: lyj1965954@sohu.com

[責任編輯 鄭禮勝]