基于抗炎效應成分指數的金銀花配方顆粒質量評價研究

賈金浩，陳小菲，李寒冰，李偉霞，王曉艷，張 輝，張明亮，汪 彬，韓 冰，紀秋如，肖小河，唐進法, *

基于抗炎效應成分指數的金銀花配方顆粒質量評價研究

賈金浩1，陳小菲2, 3，李寒冰2，李偉霞2，王曉艷2，張 輝2，張明亮2，汪 彬1，韓 冰1，紀秋如1，肖小河3*，唐進法1, 2*

1. 河南中醫藥大學藥學院，河南 鄭州 450046 2. 河南中醫藥大學第一附屬醫院 藥學部，河南省中藥臨床應用、評價與轉化工程研究中心，河南省中藥臨床藥學中醫藥重點實驗室，河南 鄭州 450000 3. 中國人民解放軍總醫院第五醫學中心，北京 100039

以抗炎為例，建立基于效應成分指數（effect-constituents index，ECI）的金銀花配方顆粒質量一致性評價方法。采用超高效液相色譜法測定22批次不同標準（國標/企標）的金銀花配方顆粒樣品中9種具有抗炎活性的單體成分（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、斷馬錢子酸、斷氧化馬錢子苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）含量，采用環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）試劑盒測定上述樣品的抗炎效價和相關單體成分的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50），進而整合分析獲取上述各個成分的抗炎效價權重系數，通過權重系數和效價整合計算得到ECI，最后通過細胞實驗驗證所構建的ECI的可行性。抗炎成分含量測定結果顯示，9種單體成分含量存在較大的差異，其中國標批次（S1～S11）和企標批次（S12～S22）在單體成分的含量高低也存在顯著差異，如國標批次（S8）中綠原酸的含量是企標批次（S16）中該成分含量的3.3倍（43.0612.98 mg/g）。國標（S1～S11）樣品的整體穩定性與企標（S12～S22）樣品相差不大（RSD國標＝211.55，RSD企標＝215.71）。生物效價測定方法通過了方法學考察，結果顯示國標樣品的抗炎效價和穩定性比企標更好（效價國標＝100.28～106.35 U/mL，效價企標＝88.06～95.49 U/mL；RSD國標＝1.98，RSD企標＝2.56）。ECI理論計算結果顯示該方法結果與實驗結果一致，能夠反映金銀花配方顆粒樣品的藥效關系（ECI國標＝10.82～14.11，ECI企標＝9.32～12.58；RSD國標＝9.51，RSD企標＝10.02）。相關性分析顯示單一指標性成分的含量與抗炎效價之間正相關性較好的是綠原酸（＝0.644），其次是木犀草苷（＝0.581），說明這2個成分在抗炎活性中起主要作用。以抗炎為例，建立基于效應成分指數的金銀花配方顆粒質量評價方法。可應用于多批次不同標準（國標/企標）的金銀花配方顆粒的質量一致性評價，為其他具有類似抗炎作用的中藥配方顆粒的質量評價研究及應用提供科學參考。

質量評價；效應成分指數；抗炎；金銀花；配方顆粒；新綠原酸；綠原酸；隱綠原酸；斷馬錢子酸；斷氧化馬錢子苷；木犀草苷；異綠原酸B；異綠原酸A；異綠原酸C

符合中醫藥特點的質量評價模式是中藥質量研究中的重點和難點，同時也是限制中藥現代化發展的關鍵問題之一[1]。目前中藥質量評價研究有了全方位的進步，從整體上對中藥質量評價水平進行了提升[2]。現行中藥質量控制的基本模式參照國外植物藥的質量控制方法，借鑒化學藥質量控制的模式所建立，化學定性鑒別與指標成分檢測是其主要內容[3]。然而，僅基于化學基準的中藥質量控制模式存在指標性成分難以全面地反映整體質量、與臨床有效性及安全性關聯不夠緊密、不能充分體現中醫藥特色等問題，仍存在較大的局限性[4]。生物效價是可以評估藥物對生物體的活性和效果，評價藥物有效性或毒性的方法，推動中藥質量標準走進臨床、關聯療效的關鍵舉措[5]。將多組分化學表征和生物效價檢測聯用模式，以效應成分指數（effect-constituents index，ECI）為指標作為中藥質量評價的方法越來越受到專家的共識，同時也為中藥質量評價提供一種新的參考研究模式和分析方法。

ECI是一種質量控制綜合量化的評價指標，可以解決質量差異對臨床療效穩定性的影響[6]。該方法融合了化學評價的精準性和可行性的優勢與生物評價關聯功效和安全性的技術優勢，實現了通過化學成分檢測即可評價中藥的藥效品質。ECI方法操作簡便，測定一定的效應成分的量同時測定這些成分的效應值后，建立數學模型對效應成分賦予一定的權重進行評價，即可實現通過測定成分的量而體現中藥之“效”，更有集成性和綜合性的特點[7]。ECI還可以為中藥質控指標的選擇提供了強有力的證據，效應權重大小直接說明了成分的活性大小或效應指標的貢獻度大小[8]。ECI方法的主要限制和挑戰是如何確證藥材中與臨床活性相關聯的活性成分以及這些活性成分之間的協同或拮抗作用如何表征[9]。

中藥配方顆粒是飲片的一種新的形式，是將單味中藥飲片經提取、濃縮、干燥等工藝制成的單味中藥產品，具有使用方便、療效確切等優點[10]，發展中藥配方顆粒行業是推動我國中醫藥現代化的重要舉措[11]。金銀花為忍冬科植物忍冬Thunb.的干燥花蕾或帶初開的花，具有清熱解毒、涼散風熱的功效，在中藥處方中具有悠久的使用歷史。金銀花是最常用于清熱解毒的傳統中藥之一，現代藥理學研究表明金銀花具有抗炎的作用，可以認為抗炎是金銀花清熱解毒的藥理學基礎[12-14]。因此本研究以金銀花抗炎活性表征其清熱解毒活性，建立基于抗炎ECI的金銀花配方顆粒質量評價方法，并應用于多批次不同標準的金銀花配方顆粒的質量一致性評價，以期為中藥配方顆粒的質量評價的研究及應用提供科學參考。

1 材料

1.1 細胞

小鼠單核巨噬細胞系RAW264.7購自上海信裕生物科技有限公司。

1.2 藥品與試劑

金銀花配方顆粒共收集到3個廠家生產的22批樣品，編號為S1～S22，見表1；對照品新綠原酸（批號906-33-2）、綠原酸（批號327-97-9）、木犀草苷（批號5373-11-5）、異綠原酸A（批號89919-62-0）、異綠原酸B（批號14534-61-3）、異綠原酸C（批號57378-72-0）、斷氧化馬錢子苷（批號58822-47-2）、隱綠原酸（批號905-99-7）、斷馬錢子酸（批號60077-46-5）購自成都克洛瑪生物科技有限公司，質量分數均≥98%；純凈水購自杭州娃哈哈集團有限公司；磷酸（批號4821551）、甲醇（批號11092007019）、乙腈（批號JA100630）均為色譜純，購自默克股份兩合公司；DMEM培養基（批號20230907）、胎牛血清（批號FA35213）、胰酶購自北京索萊寶科技有限公司；PBS（批號20230902）購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；CCK-8試劑（批號K10182633EF5E）購自美國APExBIO公司；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）試劑盒（批號KL01NPJH0657）、白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）試劑盒（批號AK02TDPB4866）、環氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）試劑盒（批號AK04D28J2524）均購自武漢伊萊瑞特生物科技公司；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批號0000114326）購自美國Sigma公司；COX-2抑制劑篩選試劑盒（批號S0168）購自上海碧云天生物技術有限公司。

表1 22批次金銀花配方顆粒信息

1.3 儀器

Waters Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀（PDA檢測器，Empower 2色譜工作站）；Waters Acquity UPLC?BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；VARIOSKAN FLASH酶標儀、Multiskan FC酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；XS105型十萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-100DE型數顯超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司）；BS2000型生物統計軟件（中國食品藥品檢定研究院）。

2 方法

2.1 基于超高相液相色譜（UPLC）的金銀花配方顆粒質量評價

2.1.1 色譜條件 Waters symmetry C18Analytical色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為0.1%磷酸水溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脫：0～1 min，4%～5% B；1～9 min，5%～6% B；9～13 min，6%～10% B；13～15 min，10%～14% B；15～30 min，14%～17% B；30～33 min，17%～100% B；33～35 min，100% B；35～38 min，100%～4% B。柱溫30 ℃；體積流量0.30 mL/min；進樣量2 μL；檢測波長為238、326、352 nm。

2.1.2 溶液的制備

（1）混合對照品溶液的制備：精密稱取新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸對照品適量，加1 mL 70%甲醇渦旋振蕩1 min，4 ℃保存備用。分別吸取以上9個對照品母液適量，配制成質量濃度為1 mg/mL的混合對照品溶液，并按照2、5、10、20、50、100倍數加入70%甲醇稀釋，配制成質量濃度為1 000、500、200、100、50、20、10 μg/mL的混合對照品溶液，取200 μL上清液待測。

（2）供試品溶液的制備：取適量22批次金銀花配方顆粒研細，精密稱定10 mg置EP管中，精密加入70%甲醇2.5 mL，稱定質量，500 W、40 kHz超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，濾過，取續濾液，即得供試品溶液，取200 μL上清液待測。

（3）抗炎活性成分溶液的制備：精密稱取9種抗炎生物活性成分（新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸）對照品適量，配制成1 280、320、80、20、5 μg/mL的對照品溶液，渦旋振蕩1 min，4 ℃保存備用。

2.1.3 方法學考察

（1）線性關系考察：分別取200 μL質量濃度為1 000、500、200、100、50、20、10 μg/mL的混合對照品溶液，注入UPLC進行測定，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標（），各樣品實際質量濃度為橫坐標（），繪制標準曲線。回歸方程為新綠原酸＝19 408 606.67，綠原酸＝20 252 920.63，木犀草苷＝15 328 284.49－252.73，異綠原酸A＝25 368 359.55，異綠原酸B＝20 116 208.37，異綠原酸C＝22 615 751.77，斷氧化馬錢子苷＝10 931 506.74－8 461.64，隱綠原酸＝15 980 107－4 328.69，斷馬錢子酸＝5 784 352.17。結果表明新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸在一定質量濃度范圍內的線性關系較好，值均大于0.999。

（2）精密度試驗：取200 μg/mL的混合對照品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣8次，記錄目標化合物的色譜峰面積，計算RSD。結果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸峰面積的RSD分別為0.44%、3.05%、0.22%、0.21%、0.32%、0.29%、0.29%、0.37%、0.94%，表明儀器的精密度良好。

（3）重復性試驗：取S4批號的金銀花配方顆粒樣品適量，平行制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣，記錄目標化合物的色譜峰面積，計算RSD。結果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸質量分數的RSD分別為0.32%、0.62%、0.58%、0.62%、0.53%、0.56%、0.57%、0.57%、0.82%，表明該方法重復性較好。

（4）穩定性試驗：取S4批號的金銀花配方顆粒樣品適量，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件于1、3、6、12、24 h進樣，記錄目標化合物的色譜峰面積，計算RSD。結果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸在24 h內峰面積的RSD分別為0.79%、1.04%、0.78%、0.62%、0.86%，0.90%、1.12%、1.79%、1.14%，表明供試品溶液在24 h內的穩定性良好。

（5）加樣回收率試驗：取S4批號的金銀花配方顆粒樣品粉末，置于5 mL EP管中，分別加入相等質量的對照品（以各化合物的對照品溶液形式加入），最后加入一定量甲醇溶液至總體積為2.5 mL，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算回收率和RSD。結果顯示，金銀花配方顆粒中新綠原酸、綠原酸、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、隱綠原酸、斷馬錢子酸的回收率為95.0%～104.9%，RSD分別為0.79%、0.68%、0.78%、0.56%、0.67%、0.91%、1.17%、0.70%、0.59%，表明方法的準確性較好。

2.2 基于抗炎活性生物效價的測定

2.2.1 基于抗炎活性生物效價的方法測定

（1）供試品溶液的制備：取適量22批金銀花配方顆粒樣品于研缽中均勻混合后，制備成混樣，稱取1 mg混樣，加入1 mL COX-2 Assay Buffer制備成1 mg/mL的混樣母液，制備成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL的溶液。

（2）工作參照液的制備：以試劑盒中的塞來昔布為工作參照品，20 μL塞來昔布溶液中加入980 μL COX-2 Assay Buffer，再加入640 μg β-環糊精惰性物質，將塞來昔布配制成640 μg/mL的母液，制備成640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL的溶液。

（3）樣品檢測：取96孔黑板，空白對照孔加入80 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL樣品溶劑，100%酶活性對照孔加入75 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL COX-2工作液、5 μL樣品溶劑，陽性抑制劑對照孔加入75 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL COX-2工作液、5 μL塞來昔布，樣品孔加入75 μL COX-2 Assay Buffer、5 μL COX-2 Cofactor工作液、5 μL COX-2工作液、5 μL待測樣品。混勻，37 ℃孵育10 min。激發波長為560 nm，發射波長為590 nm，進行熒光測定。記錄每個樣品孔和空白對照孔的平均熒光值（RFU），計算每個樣品的抑制率。

抑制率＝(RFU100%酶活性對照－RFU樣品)/(RFU100%酶活性對照－RFU空白對照)

2.2.2 基于抗炎活性生物效價方法的建立

（1）工作對照品的賦值：選用試劑盒中的塞來昔布為工作對照品，約定其效價為100 U/mL作為金銀花供試品溶液的參照效價，通過與工作對照品約定的效價對比來評價各批次金銀花供試品的品質。

（2）線性關系考察：供試品溶液、工作參照液質量濃度為640、320、160、80、40、20、10、5、2.5 μg/mL，按照生物效價測定方法測定每個質量濃度的吸光度（）值，計算COX-2酶抑制率，考察抑制率與對數劑量之間是否呈良好的對稱“S”形曲線，來確定選取質量濃度在2.5～640.0 μg/mL與抑制率是否具有良好的線性關系。

（3）可靠性檢驗：經量效關系考察，條件優化后，選取劑間比為1∶0.125的低、中、高濃度作為金銀花配方顆粒抗炎生物效價測定濃度，通過BS2000生物統計軟件，選用量反應平行線（3.3）法，輸入T估計效價為100 U/mL，T最大劑量為320 μg/mL，S最大劑量為320 μg/mL，劑間比為1∶0.125，并輸入低、中、高濃度供試品溶液、工作參照液樣品的抑制率，采用完全隨機設計實驗，計算得到可靠性檢驗結果。

（4）方法學考察：方法學考察分為精密度考察、重復性考察和穩定性考察，主要對儀器的精密度是否良好、方法的重復性是否良好、供試品溶液的配置時間等因素進行考察。

精密度考察：選取低、中、高質量濃度分別為5、40、320 μg/mL的供試品溶液、工作參照液測定濃度，以工作參照液為S組，供試品溶液為T組，通過BS2000生物統計軟件，選用量反應平行線3.3法，輸入T估計效價為100 U/mL，T最大劑量為320 μg/mL，S最大劑量為320 μg/mL，劑間比為1∶0.125，并輸入低、中、高質量濃度供試品溶液、工作參照液的抑制率，采用完全隨機設計實驗，計算得到效價值（Pt），連續測定6次。結果顯示，連續6次測定均能夠通過可靠性檢驗，求得效價的RSD值為2.51%，說明儀器的精密度良好。

重復性考察：選取低、中、高質量濃度分別為5、40、320 μg/mL的供試品溶液、工作參照液測定濃度，平行制備6份，同精密度考察方法連續進行6次測定。結果顯示，供試品溶液均通過可靠性檢驗，效價的RSD值為1.64%，表明方法重復性良好。

穩定性考察：選取低、中、高質量濃度分別為5、40、320 μg/mL的供試品溶液、工作參照液測定濃度，平行制備4份，分別于制備好后的0、1、2、3、4 h，同精密度考察方法進行測定。結果顯示，5次測定的效價的RSD值為1.19%。表明為了保證結果的準確可靠，供試品最好現配現用。

（5）樣品的測定：分別制備供試品溶液、工作參照液，以工作參照液為S組，供試品溶液為T組，通過BS2000生物統計軟件，選用量反應平行線（3.3）法，輸入T估計效價為100 U/mL，T最大劑量為10 mg/mL，S最大劑量為10 mg/mL，劑間比為1∶0.125，并輸入低、中、高質量濃度供試品溶液、工作參照液的抑制率，采用完全隨機設計實驗，計算得到Pt和可信限率（FL）[15]。

2.2.3 COX-2試劑盒測定抗炎活性成分的半數抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50） 按照“2.2.1”項下方法制備9種抗炎活性成分溶液，按照“2.2.1”項下方法測定抑制率，通過GraphPad Prism 9.0軟件，輸入各成分的濃度和抑制率，計算得到IC50。

2.2.4 抗炎生物效價權重系數（ECF）和ECI的建立 根據COX-2試劑盒選用不同質量濃度對照品來測定金銀花各個抗炎成分的IC50，計算各個抗炎成分的ECF。

通過整合ECF和含量測定結果計算抗炎ECI，以表征金銀花中9種具有抗炎生物活性成分對本實驗中抗炎作用的貢獻總和。

ECF代表成分的抗炎活性生物效價權重系數，C代表金銀花中單體成分的實際含量

2.2.5 相關性統計分析 采用SPSS 25.0和GraphPad Prism 9.0軟件上進行相關性分析。根據相關系數（）評估每種單體成分與實際測得的抗炎生物效價之間的相關性。

2.2.6 細胞實驗驗證

（1）細胞毒性實驗：RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的完全培養基制成細胞懸液，以5 000個/孔接種到96孔板上，于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養過夜。接種24 h后，用純水配制S9批次金銀花配方顆粒藥液使其質量濃度為0、62.5、125、250、500、1 000、2 000、4 000、8 000 μg/mL，棄去孔板中的培養基，每孔加入200 μL對應質量濃度的藥液。加藥結束后，繼續置于孵箱中培養24 h，培養結束后，取出孔板，每孔加入CCK-8溶液后繼續培養1～4 h。取出孔板，避光，于搖床上輕輕搖晃3～5 min后，采用酶標儀測定450 nm處的值。

（2）上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2水平的檢測：RAW264.7細胞用含10%胎牛血清的完全培養基制成細胞懸液，以5 000個/孔接種到96孔板上，于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養過夜。接種12 h后，設置對照組、模型組和給藥組，棄去孔板中的培養基，模型組和給藥組加入2 ng/mL LPS，給藥組加入0.5 mg/mL藥液，對照組加入不含藥物的培養基，于孵箱培養6 h。培養結束后，取出孔板，收集細胞上清液，按照試劑盒說明書檢測TNF-α、IL-1β、COX-2水平。

3 結果

3.1 基于UPLC的金銀花配方顆粒含量測定

混合對照品溶液和不同批次樣品溶液的色譜圖見圖1，采用UPLC法測定金銀花中9種具有抗炎活性成分的含量測定，如表2所示，9種單體成分含量存在較大的差異，其中國標批次（S1～S11）和企標批次（S12～S22）之間在單體成分的含量高低也存在顯著差異，如S8批次中綠原酸的含量比S16批次中該成分含量高3.3倍（43.0612.98 mg/g）。在9個抗炎活性成分中，成分2（綠原酸）和成分4（斷馬錢子酸）的含量顯著高于其他成分的含量，并且國標的成分含量平均值要普遍高于企標，國標的成分2、成分4及總體的RSD要小于企標，從含量測定結果中初步說明國標的質量一致性和穩定性比企標的更好。

3.2 金銀花配方顆粒效價結果

3.2.1 線性關系考察結果 金銀花配方顆粒和陽性藥塞來昔布均能通過可靠檢驗，樣品量效曲線形狀與工作參照物相同，且線性回歸方程（＝31.983＋5.659）與對照藥塞來昔布（＝31.983＋7.789）較為一致，提示兩者作用趨勢和規律相同，抑制率與對數劑量之間呈良好的對稱“S”形曲線，說明質量濃度在2.5～640 μg/mL與抑制率的線性關系良好，最終確定低、中、高質量濃度分別為5、40、320 μg/mL。

1-新綠原酸；2-綠原酸；3-隱綠原酸；4-斷馬錢子酸；5-斷氧化馬錢子苷；6-木犀草苷；7-異綠原酸B；8-異綠原酸A；9-異綠原酸C。

表2 22批次金銀花配方顆粒樣品中9種具有抗炎活性的單體成分的含量

3.2.2 可靠性檢驗結果 根據《中國藥典》2020年版四部中量反應平行線法可靠性檢驗結果成立的判別要求，量反應平行線（3.3）法可靠性測驗的結果，回歸項應非常顯著（＜0.01），偏離平行、二次曲線、反向二次曲線各項均應不顯著（＞0.05）。可靠性檢驗中回歸項和二次曲線項用來檢驗S和T是直線還是二次曲線關系，結果中回歸項極顯著（＜0.01），說明隨著工作參照物S和T的給藥劑量的增加。偏離平行項和反向二次曲線用來檢驗S和T的平行性，回歸項極顯著，偏離平行以下各項都不顯著，則S和T為平行直線。如表3所示，結果中偏離平行、二次曲線、反向二次曲線均不顯著（＞0.05），說明S和T 2條直線是平行關系。表明本方法能通過可靠性檢驗，可認為S和T具有同質性，所以T的生物效價可看作為稀釋或濃縮一定倍數的S的生物效價。

表3 金銀花配方顆粒樣品效價可靠性檢驗

3.2.3 金銀花配方顆粒抗炎生物效價測定和抗炎活性成分IC50測定 如表4所示，國標批次（S1～S11）的生物效價在100.28～106.35 U/mL，企標批次（S12～S22）的生物效價在88.06～95.49 U/mL。如表5所示，9種指標性成分的IC50在6.84～210.40 μg/mL，成分之間的IC50差異較大。

表4 22批次金銀花配方顆粒樣品的效價

表5 金銀花配方顆粒9個成分的IC50

3.3 ECI的理論計算

如表6所示，國標批次（S1～S11）的金銀花配方顆粒ECI為10.82～14.11，企標批次（S12～S22）的金銀花配方顆粒ECI為9.32～12.58，表明國標金銀花配方顆粒樣品的ECI相對較高，而企標金銀花配方顆粒樣品的ECI相對較低，說明金銀花國標批次配方顆粒整體質量、穩定性和抗炎藥效要高于企標批次。

表6 22批次金銀花配方顆粒樣品的ECI和效價

3.4 ECI和單體成分含量與實際測得抗炎效價之間的相關性分析

根據比較構建的ECI與實際測得金銀花樣品抗炎作用效價和9個指標性單體成分的含量與抗炎效價之間的相關性[以相關系數（）表示]，來分析ECI和抗炎作用單體成分含量來表征金銀花配方顆粒實際測得抗炎效價的準確性。結果分析顯示，與9個指標性單體成分含量的相關性相比較，ECI與金銀花實測抗炎生物效價之間有較好的相關性，＝0.673（圖2-A），提示ECI可作為評價金銀花配方顆粒各樣品是否具有強抗炎作用的質量評價指標。估計值與金銀花生物效能的實際測量值之間的差異，即統計殘差，可用于評估ECI的準確性。殘差分布圖顯示ECI的離散度非常窄（圖2-B），提示當評價不同來源的抗炎效果時，ECI是一個更準確評價指標。采用殘差平方和作為量化指標反映出ECI（＝10）作為一張金銀花質量控制指標的準確度優于其余評價指標（圖2-C）。統計分析結果表明，ECI作為金銀花抗炎活性的一種評價指標的準確性是相對比較可靠的。

圖3結果表明單一指標性成分的含量高低與配方顆粒實際測得抗炎生物效價之間相關性最好的是綠原酸（＝0.644），其次是木犀草苷（＝0.581）。新綠原酸、隱綠原酸、斷氧化馬錢子苷的含量與金銀花樣品實際測得的生物效價之間的相關性普遍較差間的相關性普遍較差，為?1.44～?0.194。

3.5 細胞驗證結果

3.5.1 金銀花配方顆粒對RAW264.7細胞存活率的影響 如圖4所示，0.062 5～0.500 0 mg/mL的金銀花配方顆粒對RAW264.7細胞存活率無明顯影響。以質量濃度為0.5 mg/mL的金銀花配方顆粒用于后續細胞實驗。

A-金銀花配方顆粒樣品的ECI與實際測得的生物活性之間的相關性分析，藍線代表線性擬合，紅線代表置信帶，黑線代表預測帶，＝0.673；B-ECI的標準化殘差分布圖；C-殘差的平方和。

A-correlation analysis between ECI and actual measured bioactivities ofdispensing granules samples, blue line represents the linear fit, red line represents the confidence band, and black line represents the prediction band,= 0.673; B-standardized residual distribution map of ECI; C-sum of squares of residuals.

圖2 相關性分析結果

Fig. 2 Results of correlation analysis

圖3 金銀花配方顆粒樣品中各生物活性成分含量與實際測得的抗炎作用之間的相關性分析

3.5.2 金銀花配方顆粒對LPS誘導的RAW264.7細胞上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2水平的影響 如圖5所示，與模型組比較，22批次金銀花配方顆粒均可顯著抑制上清液中TNF-α、IL-1β、COX-2水平（＜0.05）。從國標組和企標組的對比結果（圖6）可以看出，國標組降低炎癥因子水平的效果比企標組好，提示該結果與金銀花配方顆粒的效價結果和ECI結果相符合。

4 討論

生物效應評價的方法是實現中藥質量標準現代化的有效途徑，是連接臨床療效與中藥質量的橋梁[16]。中藥ECI是基于單體成分分析和生物效價檢測共同加權的質量評價指標，其可通過中藥中活性成分的“量-效”關系方程來建立。肖小河教授提出構建“中藥品質標準評控力金字塔”，在基于化學基準的基礎上增加效應基準，逐步建立以生物評價為核心手段和指標之一的中藥質量標準體系，這將是中藥質量標準化建設的重要發展方向[17]。

與對照組（0 mg?mL?1）比較：**P＜0.01。

本研究通過在單體成分含量測定的基礎上，增加了金銀花抗炎的生物效價測定方法，并構建了一種基于生物效價權重系數加權的多組分化學定量分析的中藥質量評控方法，并且通過細胞實驗水平驗證了該方法的結果，說明方法可行、可靠。本研究的含量測定結果顯示，綠原酸的含量最高，其次是斷馬錢子酸，其他7種成分含量較低，該結果與魏悅等[18]的含量測定結果一致，說明建立的含量測定分析方法準確、可行、重復性良好。本研究在譚鵬等[19]研究金銀花配方顆粒方法的基礎上，對22批不同標準（國標/企標）的金銀花配方顆粒樣品進行質量一致性評價，結果表明國標樣品抗炎活性和穩定性要優于企標，國標樣品的質量一致性較好，說明國標的出臺，一定程度地結束了“異地異標準，各廠各規范”現象，成為中藥配方顆粒生產質量的“指南針”，更能保障中藥配方顆粒整體質量穩定和均一。從相關性結果分析顯示，綠原酸、木犀草苷的含量與金銀花發揮抗炎作用的關聯度較大，這與Zhang等[20]、施春燕[21]、熊樂文等[22]的研究相似，這2個成分同樣也是作為《中國藥典》2020年版[18]和金銀花配方顆粒國家藥品標準質量評價的指標性成分，說明該相關性分析結果準確、可靠、具有參考意義。

與對照組比較：*P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05。

圖6 國標組和企標組TNF-α、IL-1β、COX-2水平的對比

綜上，本研究建立了基于抗炎活性檢測的ECI測定方法，用于金銀花配方顆粒的質量一致性評價，測定結果穩定可靠，適應性強，本研究可以為其他具有類似抗炎作用的中藥配方顆粒的質量評價研究及應用提供科學參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Quality evaluation ofFlos dispensing granules based on anti-inflammatory effect component index

JIA Jinhao1, CHEN Xiaofei2, 3, LI Hanbing2, LI Weixia2, WANG Xiaoyan2, ZHANG Hui2, ZHANG Mingliang2, WANG Bin1, HAN Bing1, JI Qiuru1, XIAO Xiaohe3, TANG Jinfa1, 2

1. School of Pharmacy, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China 2. Henan Key Laboratory of Clinical Pharmacy of Traditional Chinese Medicine, Henan Engineering Research Centre for Clinical Application, Evaluation and Translation of Traditional Chinese Medicine, Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450000, China 3. The Fifth Medical Center, Chinese People’s Liberation Army General Hospital, Beijing 100039, China

To establish a method for quality consistency evaluation of Jinyinhua () dispensing granules based on effect-constituents index (ECI) by taking anti-inflammation as an example.Ultra performance liquid chromatography (UPLC) was used to determine the contents of nine monomer components (neochlorogenic acid, chlorogenic acid, cryptochlorogenic acid, secologanic acid, secoxyloganin, cymaroside, isochlorogenic acid B, isochlorogenic acid A, isochlorogenic acid C) with anti-inflammatory activity in 22 batches ofdispensing granules of different standards (national standard/enterprise standard, NS/ES), and the anti-inflammatory potency of the above samples and half inhibitory concentration (IC50) of the relevant monomer components were determined by using the cyclooxygenase-2 (COX-2) kit, and then the weight coefficient of anti-inflammatory potency of the above components was obtained by integrative analysis, and ECI was calculated through the integration of weight coefficients and effectors, and finally, the feasibility of the constructed ECI was verified by cellular experiments.The results of anti-inflammatory component content determination showed that there were large differences in the contents of nine individual components, of which there were also significant differences in the content of individual components between the NS batch (S1—S11) and the ES batch (S12—S22), for example, the content of chlorogenic acid in the NS batch (S8) was 3.3 times more than the content of this component in the ES batch (S16) (43.0612.98 mg/g). The overall stability of NS (S1—S11) samples was not much different from that of ES (S12—S22) samples (RSDNS= 211.55, RSDES= 215.71). The bioefficacy assay passed the methodological examination, and the results showed that the anti-inflammatory potency and stability of the NS samples were better than those of the ES samples (potencyNS= 100.28—106.35 U/mL, potencyES= 88.06—95.49 U/mL; RSDNS= 1.98, RSDES= 2.56). The theoretical calculations of ECI showed that the results of the method were consistent with the experimental results, which could reflect the pharmacodynamic relationship of thedispensing granules samples (ECINS= 10.82—14.11, ECIES= 9.32—12.58; RSDNS= 9.51, RSDES= 10.02). Correlation analysis showed that the better positive correlation between the content of single indicator components and anti-inflammatory potency was chlorogenic acid (= 0.644), followed by cymaroside (= 0.581), suggesting that these two components played a major role in anti-inflammatory activity.This study establishes the quality evaluation method ofdispensing granules based on ECI by taking anti-inflammation as an example. It can be applied to the quality consistency evaluation of multiple batches ofdispensing granules with different standards (NS/ES), and provide scientific reference for the quality evaluation research and application of other Chinese medicine dispensing granules with similar anti-inflammatory effects.

quality evaluation; effect-constituents index; anti-inflammation;; dispensing granules; neochlorogenic acid; chlorogenic acid; cryptochlorogenic acid; secologanic acid; secoxyloganin; cynaroside; isochlorogenic acid B; isochlorogenic acid A; isochlorogenic acid C

R285

A

0253 - 2670(2024)08 - 2630 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.014

2023-11-22

河南省高校科技創新團隊（23IRTSTHN026）；國家自然科學基金面上項目（82173993）；國家中醫管理局中醫藥高質量發展協同創新轉化工程自主立項項目（CXZH03）

賈金浩，研究方向為中藥炮制機制及飲片標準化研究。Tel: (0371)66245342 E-mail: jjh970423@163.com

通信作者：肖小河，男，博士生導師，研究員，主要從事臨床中藥學與安全用藥研究。E-mail: pharmacy302@126.com

唐進法，男，博士，主任藥師，主要從事中藥質量評價與合理用藥研究。E-mail: a0519@163.com

[責任編輯 李亞楠]