蓬莪術醋制前后改善斑馬魚急性肝損傷的作用機制研究

林麗婷，王繼森，高天慧，朱宗萍，羅益蓉，卿 瑩，郭亭君，陳元惠，廖 婉*

蓬莪術醋制前后改善斑馬魚急性肝損傷的作用機制研究

林麗婷1，王繼森2#，高天慧1，朱宗萍1，羅益蓉1，卿 瑩1，郭亭君1，陳元惠1，廖 婉1*

1. 成都中醫藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137 2. 成都市藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局中藥材質量監測評價重點實驗室，四川 成都 610045

基于核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）和轉化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）/Smad3信號通路探討醋制前后蓬莪術改善硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）誘導斑馬魚急性肝損傷的作用機制。以醋制前后的蓬莪術為研究對象，建立TAA誘導斑馬魚急性肝損傷模型，將醋制前后蓬莪術水煎液分別設置高、中、低劑量（8、4、2 mg/mL）組，以異甘草酸鎂為陽性對照藥物組，斑馬魚培養水為對照組，給藥72 h后觀察斑馬魚幼魚肝臟形態，通過蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝組織病理變化；采用試劑盒檢測斑馬魚幼魚中丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）活性及谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）水平；利用qRT-PCR檢測斑馬魚幼魚、白細胞介素-10（interleukin-10，）、和基因表達；Western blotting測定斑馬魚幼魚Nrf2/HO-1和TGF-β/Smad3信號通路相關蛋白表達。醋制前后蓬莪術對TAA導致的肝組織細胞形態損傷具有保護作用。生化結果表明，與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液組ALT、AST活性及GSH水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），MDA水平均顯著降低（＜0.001）。qRT-PCR結果表明，與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液組、、mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），醋蓬莪術水煎液高劑量組mRNA表達水平顯著降低（＜0.001）；其中，與等劑量蓬莪術組相比，醋蓬莪術高劑量組顯著抑制、的mRNA表達（＜0.05、0.001），且醋蓬莪術具有促進和mRNA表達的趨勢，但沒有顯著性差異。Western blotting結果表明，與模型組比較，蓬莪術水煎液高、中劑量組和醋蓬莪術水煎液各劑量組Nrf2蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），蓬莪術高劑量組和醋蓬莪術各劑量組Smad3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），蓬莪術水煎液高劑量組和醋蓬莪術水煎液高、中劑量組TGF-β蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）；其中，與等劑量蓬莪術組相比，醋蓬莪術各劑量組Nrf2蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），且醋蓬莪術具有抑制Smad3和TGF-β蛋白表達的趨勢，但沒有顯著性差異。醋制前后的蓬莪術可以不同程度地改善TAA誘發的急性肝損傷，其作用機制可能與調控Nrf2/HO-1和TGF-β/Smad3信號通路有關。

蓬莪術；急性肝損傷；核因子E2相關因子2/血紅素加氧酶-1通路；轉化生長因子-β/Smad3信號通路；姜黃素；呋喃二烯

蓬莪術是《中國藥典》2020年版中莪術的主要來源之一，為姜科植物Val.的干燥根莖[1]。蓬莪術性溫，味辛、苦，歸肝、脾經，具有行氣破血、消積止痛的功效，被譽為“破血消癥要藥”。中醫臨床上常用于治療癥痕痞塊、瘀血經閉。現代藥理學研究表明，蓬莪術具有抗肝炎、抗腫瘤、抗氧化等藥理作用[2]。蓬莪術醋制品也為中醫臨床的常用藥物，清《本經逢原》載：“莪術，入肝經藥醋炒”[3-4]。醋制后蓬莪術主入肝經血分，能增強散瘀止痛的作用。課題組前期發現蓬莪術能通過影響肝組織轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smads通路延緩肝病進程，醋制后對刀豆球蛋白A所致小鼠肝損傷的保護作用比生品強[5]。醋制后蓬莪術能夠更好地調控Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88）/核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路而發揮抗炎作用，進而改善肝損傷癥狀[6]。

急性肝損傷（acute liver injury，ALI）是指短時間內由多種原因如自身免疫、酒精、病毒及化學物質等原因引發肝細胞受損的一種疾病，以細胞壞死、炎癥和氧化損傷為特征，嚴重情況下可迅速發展成危及生命的急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）[7]。硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA）是一種經典的肝臟有毒化合物，可通過引發氧化應激和炎癥反應導致器官受損，被廣泛應用于構建肝損傷實驗模型[8]。研究表明，TAA可導致斑馬魚的ALI，具有與哺乳動物模型相似的病理特征，存在著脂肪變性-纖維化-凋亡的過程[9]。因此，本研究采用模式生物斑馬魚，建立TAA誘導的ALI模型，探究醋制前后蓬莪術水煎液對肝損傷的保護作用，基于核因子E2相關因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/血紅素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）信號通路和TGF-β/Smad3信號通路探討醋制前后蓬莪術水煎液對肝損傷的改善作用機制，為蓬莪術在臨床上防治ALI提供科學依據。

1 材料

1.1 動物

AB系野生型斑馬魚，購自國家斑馬魚資源中心，于成都中醫藥大學西南特色中藥資源國家重點實驗室斑馬魚實驗平臺飼養。在28 ℃、光照14 h/黑暗10 h的環境下，將成熟的健康雌性和雄性AB系野生型斑馬魚分別放養，每天喂2次豐年蝦。實驗前1晚，將健康的AB斑馬魚成魚，按雌雄1∶2的比例放入底部有篩網的交配缸內，用透明隔板隔開，次日清晨移除隔板，產卵1 h內觀察產卵量并收集魚卵。

1.2 藥材

蓬莪術飲片（批號1903041）購自四川成都荷花池中藥材專業市場，經成都中醫藥大學裴瑾教授鑒定為姜科植物蓬莪術Val.的干燥根莖。醋蓬莪術飲片采用課題組前期專利方法進行炮制（專利號ZL201310400255.2）：取蓬莪術飲片，按10︰3的比例加入9°米醋，攪拌均勻后悶潤2 h，煮干醋液后，于120 ℃干燥30 min，取出放涼，干燥即得。

1.3 藥品與試劑

二甲苯（批號2022051901）、無水乙醇（批號2022070501）購自成都市科隆化學品有限公司；蘇木素-伊紅（HE）染液套裝（批號DH0020）購自Leagene公司；中性樹膠（批號10004160）購自國藥集團化學試劑有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號140122005）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號140222005）購自Mindray公司；谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒（批號AK06HXZ06586）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（批號AK038P4L0488）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；Animal Total RNA Isolation Kit（批號RE-03014）購自成都福際生物技術有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒（批號G2003-50T）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；β-actin抗體（批號AF7018）購自美國Affinity公司；Nrf2抗體（批號YT3189）購自美國ImmunoWay公司；Smad3抗體（批號ET1607-41）、TGF-β抗體（批號HA721143）購自成都華江生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗兔二抗（批號70-GAR0072）、HRP標記的山羊抗小鼠二抗（批號70-GAM0072）購自杭州聯科生物技術股份有限公司；異甘草酸鎂注射液（批號20211101204）購自南京正大天晴制藥有限公司。

1.4 儀器

HM325型切片機（美國Thermo Fisher Scientific公司）；Stepone plus型熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；SLAN-96S型全自動醫用PCR分析系統（上海宏石醫療科技有限公司）；D3024型臺式高速微量離心機、D3024R型臺式高速冷凍離心機（美國賽洛捷克SCILOGEX公司）；ChemiScope 6100型化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 醋制前后蓬莪術水煎液的制備

取蓬莪術、醋蓬莪術飲片，分別加15倍量去離子水，浸泡30 min，煎煮2次，每次30 min，趁熱濾過，合并2次水煎液，50 ℃減壓濃縮，即得醋制前后蓬莪術水煎液。根據《中國藥典》2020年版含量測定的方法，經高效液相色譜儀分別測定，蓬莪術水煎液中姜黃素的質量濃度為1.366 mg/mL，呋喃二烯的質量濃度為0.024 mg/mL；醋蓬莪術水煎液中姜黃素的質量濃度為11.907 mg/mL，呋喃二烯的質量濃度為0.018 mg/mL。

2.2 動物分組、造模與給藥

在斑馬魚發育至受精后72 h（72 h post fertilization，72 hpf），挑選發育正常的斑馬魚幼魚，隨機分為對照組、模型組、異甘草酸鎂（5 mg/mL）組及蓬莪術水煎液高、中、低劑量（8、4、2 mg/mL）組和醋蓬莪術水煎液高、中、低劑量（8、4、2 mg/mL）組。移入12孔板的樣孔中，每孔10條幼魚，每組設置3個復孔。對照組加入2 mL斑馬魚培養水，模型組加入2 mL TAA（8 mmol/L），各給藥組加入1 mL TAA（8 mmol/L）和1 mL相應藥物，連續3 d于同一時刻給藥，初次給藥體積為2 mL，此后每天換液一半，以保持藥量和水質的新鮮。

2.3 斑馬魚肝臟表型觀察

給藥后72 h（72 h post exposure，72 hpe），收集各組斑馬魚幼魚，首先使用三卡因麻醉3 min，然后固定于羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC-Na）中。調整斑馬魚姿勢為側臥位，在體式顯微鏡下采集圖像，觀察斑馬魚肝臟表型。

2.4 HE染色法觀察肝臟病理情況

斑馬魚幼魚的新鮮組織經多聚甲醛固定24 h后，進行脫水、包埋，制作3 μm石蠟切片，HE染色后在光學顯微鏡下觀察肝臟組織結構，隨機選取視野進行拍照記錄。

2.5 斑馬魚幼魚中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的測定

取斑馬魚幼魚，提取蛋白，用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，按照試劑盒說明書測定ALT、AST活性及GSH、MDA水平。

2.6 qRT-PCR法測定斑馬魚幼魚中Nrf2、白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、Smad3、Smad7mRNA表達

取斑馬魚幼魚，提取總RNA，用逆轉錄試劑盒合成cDNA，將反應得到的cDNA作為模板進行目的基因擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性10 min，循環1次，95 ℃變性10 s，60 ℃退火延伸30 s，循環40次。使用PCR儀自帶軟件進行熒光定量分析，依據t值計算2???Ct，以β-actin為內參基因計算mRNA的相對表達量。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.7 Western blotting測定斑馬魚幼魚中Nrf2、Smad3和TGF-β蛋白表達

取斑馬魚幼魚，提取總蛋白，使用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，每次5 min，加入二抗，室溫孵育1 h，洗膜3次，每次5 min。采用ECL化學發光成像系統采集圖像，用凝膠成像儀自帶分析軟件分析條帶灰度值。

2.8 統計學分析

3 結果

3.1 斑馬魚肝臟表型觀察結果

如圖1所示，異甘草酸鎂組斑馬魚肝臟形狀均勻，顏色為淺黃褐色；模型組斑馬魚肝臟外觀呈褐色，外觀粗糙。醋制前后蓬莪術水煎液治療可緩解上述病理特征。視覺觀察結果顯示，醋制前后蓬莪術水煎液各給藥組之間沒有顯著的差異。

3.2 斑馬魚肝組織HE染色結果

如圖2所示，對照組斑馬魚整體結構未見明顯異常，肝臟肝細胞核清晰，胞質較豐富，排列較規則。模型組斑馬魚肝臟出現少量的空泡變性，細胞質中呈現大小不一的圓形空泡，大量肝細胞胞質疏松。與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液治療后上述病理損傷均明顯減輕。說明醋制前后蓬莪術水煎液對TAA導致的肝組織細胞形態損傷具有保護作用。

圖1 斑馬魚肝臟表型圖 (×100)

3.3 蓬莪術醋制前后對TAA誘導的斑馬魚幼魚中ALT、AST活性及GSH、MDA水平的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組斑馬魚幼魚中ALT、AST活性及GSH水平顯著降低（＜0.001），MDA水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液組ALT、AST活性及GSH水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），MDA水平顯著降低（＜0.001）。其中，與等劑量蓬莪術水煎液組相比，醋蓬莪術水煎液高劑量組ALT活性顯著降低（＜0.001），醋蓬莪術水煎液各劑量組AST活性顯著降低（＜0.001），醋蓬莪術水煎液高、中劑量組GSH水平顯著升高（＜0.01、0.001），醋蓬莪術水煎液中、低劑量組MDA水平顯著降低（＜0.01、0.001）。表明蓬莪術醋制后能更好地通過緩解氧化應激達到改善TAA誘導肝損傷的目的。

圖2 斑馬魚肝組織HE染色結果(×400)

3.4 蓬莪術醋制前后對TAA誘導的斑馬魚幼魚中Nrf2、IL-10、Smad3、Smad7mRNA表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組斑馬魚幼魚中、、mRNA表達水平顯著降低（＜0.001），mRNA表達水平顯著升高（＜0.001）；與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液高、中劑量組、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），蓬莪術水煎液高、中劑量組和醋蓬莪術水煎液高劑量組mRNA表達水平顯著升高（＜0.05、0.01、0.001），醋蓬莪術水煎液高劑量組mRNA表達水平顯著降低（＜0.001）。其中，與等劑量蓬莪術組相比，醋蓬莪術水煎液高劑量組顯著抑制、的mRNA表達（＜0.05、0.001），且醋蓬莪術水煎液具有促進和mRNA表達的趨勢，但沒有顯著性差異。

陽性-異甘草酸鎂；與對照組比較：***P＜0.001；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與蓬莪術相同劑量組比較：▲P＜0.05 ▲▲P＜0.01 ▲▲▲P＜0.001，下圖同。

3.5 蓬莪術醋制前后對TAA誘導的斑馬魚幼魚中Nrf2、Smad3、TGF-β蛋白表達的影響

如圖5所示，與對照組比較，模型組斑馬魚幼魚中Smad3和TGF-β蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），Nrf2蛋白水平顯著降低（＜0.001）；與模型組比較，蓬莪術水煎液高、中劑量組和醋蓬莪術水煎液各劑量組Nrf2蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），蓬莪術水煎液高劑量組和醋蓬莪術水煎液各劑量組Smad3蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001），蓬莪術水煎液高劑量組和醋蓬莪術水煎液高、中劑量組TGF-β蛋白表達水平顯著降低（＜0.05、0.01、0.001）。其中，與等劑量蓬莪術水煎液組相比，醋蓬莪術各劑量組Nrf2蛋白表達水平顯著升高（＜0.001），且醋蓬莪術具有抑制Smad3和TGF-β蛋白表達的趨勢，但沒有顯著性差異。結果表明，醋制前后蓬莪術水煎液可通過調節Nrf2/ HO-1信號通路和TGF-β/Smad3信號通路對TAA誘導的斑馬魚急性肝損傷發揮潛在的保護作用。

圖4 蓬莪術醋制前后對TAA誘導的斑馬魚幼魚中Nrf2、IL-10、Smad3、Smad7mRNA表達的影響(, n = 3)

圖5 蓬莪術醋制前后對TAA誘導的斑馬魚幼魚中Nrf2、Smad3、TGF-β蛋白表達的影響(, n = 3)

4 討論

斑馬魚作為一種新興模式生物，具有多種獨特的優勢，在藥理學和毒理學研究中應用廣泛。斑馬魚具有發育周期短、繁殖能力強、高通量化和快速篩選等特點，遺傳學分析表明斑馬魚的基因組與人類超過87%的同源性，其基因信號傳導通路和代謝通路也與人類高度保守性[10]。此外，斑馬魚肝臟有許多和哺乳動物類似的反應，如對外源化學物質的防御機制相當，以及脂類和糖原儲存。斑馬魚幼魚通體透明，可以直接活體觀察其器官的發育和功能。因此相對于其他模式動物，斑馬魚在建立肝損傷模型方面具備較為顯著的優勢[9]。周楚瑩等[11]采用二乙基亞硝胺構建斑馬魚藥物性肝纖維化模型，發現牛大力水提物對藥物性肝纖維化損傷的保護作用是通過抑制肝細胞凋亡、減少膠原纖維沉積實現的。崔佳琦等[12]通過構建斑馬魚興奮期醉酒模型、醉酒模型及酒精性肝損傷模型，結果表明各劑量茯苓-葛根-枳椇子混合藥粉均有不同程度的預防醉酒作用、解酒作用及肝損傷保護作用。孟瑞媛等[10]通過構建黃曲霉毒素B1誘導的斑馬魚肝損傷模型，結果表明姜黃素通過調節與脂肪合成、抗氧化和能量代謝相關的通路，起到了修復肝損傷的作用。課題組前期采用flk1-EGFP轉基因斑馬魚研究姜黃抗血管生成的作用[13]。因此，本研究采用了新型模式斑馬魚探究蓬莪術醋制前后對肝損傷的緩解作用。

ALT和AST是反映肝損傷的標志性酶，ALT主要位于肝細胞細胞質中，AST在肝細胞線粒體中含量最高，常用于肝臟疾病的診斷[14]。本研究中，TAA誘導的斑馬魚幼魚肝損傷后，模型組ALT和AST活性均顯著低于對照組。在TAA引起肝損傷后，肝細胞合成ALT和AST的能力降低[15]。從整個動物模型的角度來看，斑馬魚幼魚的ALT和AST活性也降低了，因此組織勻漿中ALT和AST的總活性可能會降低。GSH是平衡氧化與抗氧化中重要的抗氧化酶，可以清除細胞內氧自由基，反映機體抗氧化能力；MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，可以提示機體內過量產生活性氧的程度[16]。本研究中，醋制前后的蓬莪術治療后，GSH水平均不同程度的升高，MDA水平均不同程度的降低，呈劑量相關性。表明抑制氧化應激可能是醋制前后蓬莪術改善斑馬魚幼魚肝損傷的途徑之一。

氧化應激和炎癥反應在介導急性肝損傷的發生和發展過程中有至關重要的作用，抑制氧化應激和炎癥被認為是治療肝損傷的重要策略[17]。Nrf2是一種內源性調控因子，被活性氧和抗氧化劑等多種元素激活后進入細胞核，與抗氧化反應元件（antioxident response element，ARE）結合，進而調節體內多種抗氧化酶的表達，發揮抗氧化功能。HO-1是Nrf2信號的下游靶基因，能夠通過降解亞鐵血紅素生成一氧化氮等產物參與氧化應激損傷等病理生理過程，Nrf2/HO-1通路對機體抵抗氧化應激損傷具有積極的正向作用[18]。qRT-PCR和Western blotting結果顯示，與對照組比較，模型組mRNA和蛋白表達量減少可能是由于在TAA誘導氧化損傷情況下，肝細胞需要持續地合成足夠的Nrf2去應對氧化應激，而肝臟的損傷使Nrf2合成不足，從而出現了mRNA和蛋白表達量減少的情況。與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液組mRNA和蛋白表達量升高，表明醋制前后蓬莪術水煎液組可能通過促進Nrf2的合成來提高其基礎水平，從而減輕TAA誘導的肝臟損傷，并逐漸降低機體的氧化應激水平，使其恢復正常。

TGF-β具有特定的自分泌和旁分泌作用，能介導白細胞群體內炎癥細胞的活化、遷移和增殖的調節，是調節組織炎癥和修復的重要細胞因子[19]。Smad3是一種膜受體激活的Smad，參與TGF-β/活化素信號途徑。許多研究已經證實，TGF-β/Smads信號傳導途徑是TGF-β發揮生物學作用的主要機制。TGF-β的異常表達不僅促進肝癌細胞的增殖、遷移，而且與病毒性肝炎、肝功能衰竭以及其他慢性肝病等多種肝臟疾病相關[20]。qRT-PCR和Western blotting結果顯示，與模型組比較，醋制前后蓬莪術水煎液能顯著下調mRNA表達水平，降低Smad3和TGF-β的蛋白表達量，提示醋制前后蓬莪術水煎液可抑制TGF-β表達，降低激活的Smad的表達，抑制肝細胞內TGF-β/Smads信號通路，從而發揮對ALI的保護作用。

課題組前期采用質譜法發現蓬莪術醋制前后的主要差異成分是沒食子酸、阿魏酸、莪術醇、常春藤素[21]。研究發現沒食子酸對于肝臟損傷具有保護作用，其機制可能與增強抗氧化損傷能力、降低炎癥因子水平有關[22]。阿魏酸糖酯能夠激活Nrf2抗氧化信號通路，促進Nrf2/Kelch樣ECH相關蛋白1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1）-ARE抗氧化信號通路下游相關抗氧化酶的表達，從而有效保護大鼠免受AAPH誘導的氧化損傷[23]。莪術醇可以下調TGF-β1和Smad2/3蛋白和基因的表達，從而阻止TGF-β1/Smad信號通路的活動達到抗肝纖維化的作用[24]。常春藤素對肝臟損傷有顯著的抑制效果，還能減少肝臟氧化應激，同時對小鼠的體質量也有明顯的抑制作用[25]。這些差異性的成分可能是蓬莪術醋制前后藥效變化的物質基礎，將進一步研究這些單體成分對斑馬魚肝損傷的保護作用。

本研究基于Nrf2/HO-1信號通路和TGF-β/ Smad3信號通路探究醋制前后蓬莪術水煎液對TAA誘導ALI斑馬魚的保護作用機制。結果表明，醋制前后蓬莪術水煎液均可改善TAA誘導的ALI斑馬魚幼魚的一般生理狀態及肝臟損傷程度，調控Nrf2/HO-1信號通路和TGF-β/Smad3信號通路，改善肝臟氧化應激和炎性反應發揮作用。研究發現與蓬莪術相比，醋蓬莪術調節TGF-β/Smad3信號通路水平更具有降低的趨勢，說明蓬莪術醋制后抗炎的效果更好。本研究初步闡明蓬莪術“醋制入肝”的炮制機制，為蓬莪術的臨床應用提供實驗依據，同時為蓬莪術防治ALI提供了理論依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of raw and vinegar-processedon improving acute liver injury in zebrafish

LIN Liting1, WANG Jisen2, GAO Tianhui1, ZHU Zongping1, LUO Yirong1, QING Ying1, GUO Tingjun1, CHEN Yuanhui1, LIAO Wan1

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Key Laboratory of Quality Monitoring and Evaluation of Chinese Medicinal Materials, National Medical Products Administration, Chengdu Institute for Drug Control, Chengdu 610045, China

To investigate the mechanism of raw and vinegar-processedon improving thioacetamide (TAA)-induced acute liver injury in zebrafish based on nuclear factor-erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)/heme oxygenase-1 (HO-1) and transforming growth factor-β (TGF-β)/Smad3 signaling pathway.The raw and vinegar-processedwere studied and the TAA-induced acute liver injury model of zebrafish was established. High-, medium- and low-doses (8, 4, 2 mg/mL) of raw and vinegar-processedwater decoctionwere set. Magnesium isoglycyrrhizinate was used as positive control group, and zebrafish culture water was used as normal control group. The liver morphology of zebrafish larvae was observed 72 h after administration, and the pathological changes of liver tissue were observed by hematoxylin-eosin (HE) staining. Alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST) activities and glutathione (GSH), malondialdehyde (MDA) levels in zebrafish larvae were detected by kit; qRT-PCR was used to detect, interleukin-10 (),andgene expressions in zebrafish larvae; Western blotting was used to determine the expressions of Nrf2/HO-1 and TGF-β/Smad3 signaling pathway related proteins in zebrafish larvae.Raw and vinegar-processedwater decoction had protective effect on the morphological injury of liver cells caused by TAA. Biochemical results showed that compared with model group, ALT, AST activities and GSH level in raw and vinegar-processedwater decoction group were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), MDA level was significantly decreased (< 0.001). The results of qRT-PCR showed that compared with model group, the mRNA expression levels of,andin raw and vinegar-processedgroup water decoction were significantly increased (< 0.05, 0.01, 0.001), while the mRNA expression levels ofin vinegar-processedgroup were significantly decreased (< 0.001). Compared with the same dose ofgroup, vinegar-processedhigh-dose group significantly inhibited the mRNA expression ofand(< 0.05, 0.001), and the vinegar-processedshowed a tendency to promoteandmRNA expression, but there was no significant difference. Western blotting results showed that compared with model group, the expression level of Nrf2 protein in the high-dose and medium-dose groups ofand the dosage groups of vinegar-processedwere significantly increased (< 0.001). The expression level of Smad3 protein in high-doseand the dosage groups of vinegar-processedwas significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001). The expression level of TGF-β protein in high-doseand high-, medium-dose groups of vinegar-processedwas significantly decreased (< 0.05, 0.01, 0.001). Among them, the Nrf2 protein level of the dosage groups of vinegar-processedwas significantly higher than that of the same dose ofgroup (< 0.001), and vinegar-processedshowed a tendency to inhibit the expression of Smad3 and TGF-β, but there was no significant difference.The raw and vinegar-processedcan improve TAA-induced acute liver injury to varying degrees, and the mechanism of action may be related to the regulation of Nrf2/HO-1 and TGF-β/Smad3 signaling pathways.

Val.;acute liver injury; nuclear factor-erythroid 2-related factor 2/ heme oxygenase-1 pathway; transforming growth factor-β/Smad3 signaling pathway;curcumin; furanodiene

R285.5

A

0253 - 2670(2024)08 - 2611 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.012

2023-11-26

國家自然科學基金面上項目（82274099）；四川省自然科學基金面上項目（24NSFSC1101）；成都市科技局國合項目（2022-GH02-00033-HZ）

林麗婷，女，碩士研究生，研究方向為中藥制劑新技術、新劑型和炮制研究。Tel: 15928086785 E-mail: 1069590640@qq.com

王繼森，男，副主任中藥師，碩士，從事藥品檢驗研究工作。E-mail: 93230623@qq.com

通信作者：廖 婉，女，博士，教授，碩士生導師，主要從事中藥炮制工藝與機制、中藥藥劑研究。E-mail: liaowan@cdutcm.edu.cn

[責任編輯 李亞楠]