紅花籽粕對小鼠的急性毒性及抗潰瘍性結腸炎作用研究

戚 曼，王文萱，付向磊，姜 超，張 亮，MD HASAN ALI，李 劍，楚生輝*，劉 敏*

紅花籽粕對小鼠的急性毒性及抗潰瘍性結腸炎作用研究

戚 曼1，王文萱1，付向磊1，姜 超1，張 亮1，MD HASAN ALI1，李 劍2，楚生輝1*，劉 敏1*

1. 石河子大學藥學院 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室，新疆 石河子 832003 2. 華東理工大學藥學院 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200000

評價紅花籽粕（紅花的種子經過壓榨提取紅花籽油后的副產品）對小鼠的急性毒性及抗潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）作用。C57BL/6小鼠ig不同劑量的紅花籽粕，7 d后計算臟器指數，采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察肝、脾、腎組織病理變化，測定血清中肝功能、腎功能及血脂水平，以評價紅花籽粕的急性毒性。建立葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導的UC小鼠模型，每天記錄小鼠體質量，測定疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分、結腸長度以及臟器指數，采用HE染色和阿利新藍-過碘酸雪夫（AB-PAS）染色評價結腸組織病理學變化，采用qRT-PCR和Western blotting檢測結腸組織中炎癥和黏膜屏障相關因子表達。急性毒性實驗中，與對照組比較，紅花籽粕組小鼠臟器指數、血液生化指標沒有顯著差異，臟器病理切片也未見異常。紅花籽粕對DSS誘導的UC小鼠具有較好的保護作用，可以顯著改善體質量減輕、DAI評分升高、結腸長度縮短等臨床癥狀（＜0.01），減輕結腸組織病理損傷，抑制腸道炎癥細胞的浸潤，保護杯狀細胞，提高緊密連接蛋白和黏蛋白的表達（＜0.05、0.01、0.001），改善腸道屏障完整性。紅花籽粕具有較高的安全性，且對DSS誘導的UC小鼠具有顯著的治療作用。

紅花籽粕；急性毒性；潰瘍性結腸炎；炎癥；腸道屏障

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是指以結直腸黏膜連續性、彌漫性炎癥改變為特征的慢性非特異性炎癥性腸病[1]。病理改變以結腸潰瘍糜爛為主，具有彌散性、淺表性、連續性的特點，病程漫長，伴反復發作[2]。UC病因和發病機制非常復雜，尚不清楚，導致目前臨床上的治療手段有限，主要依靠氨基水楊酸類、糖皮質激素、免疫抑制劑和生物抑制劑等，其中5-氨基水楊酸（5-aminosalicylic acid，5-ASA）是一種經典的抗炎劑，可以調節白細胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-10等炎性細胞因子之間的平衡[3-4]，是輕中度UC患者的首選治療藥物[5]，然而長期使用這些藥物會產生嚴重的不良反應[6]。近年來，臨床應用中藥治療潰瘍性結腸炎越來越廣泛[7-8]。紅花籽粕是菊科植物紅花L.的種子經過壓榨提取紅花籽油后的副產品[9]。紅花是新疆特有的經濟作物之一，每年紅花籽粕的產量超過萬噸，這些紅花籽粕可以用于食品、醫藥和飼料[10]?，F有研究表明，紅花籽粕具有抗氧化、消炎抑菌、改善糖尿病和骨質疏松等生物活性[11-14]，但如果能夠發現紅花籽粕新的生物活性，從中找到具有活性的組分或單體，將為紅花籽粕的進一步開發和利用奠定良好的基礎。檢索國內外文獻，尚未發現紅花籽粕對UC相關研究的報道。本研究以葡聚糖硫酸鈉（dextran sulphate sodium，DSS）誘導的UC小鼠為模型，探討紅花籽粕對DSS誘導的UC小鼠的治療作用并對其急性毒性進行考察，為將紅花籽粕用于臨床防治UC的輔助性治療提供實驗依據。

1 材料

1.1 藥材

紅花籽采自新疆建設兵團第九師161團（塔城地區裕民縣）無刺紅花，經石河子大學藥學院楚生輝副教授鑒定為菊科紅花屬植物紅花L.的干燥成熟果實。

1.2 動物

SPF級C57BL/6小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，購自新疆醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK（新）2023-0001。小鼠飼養于SPF級環境中，溫度20～22 ℃、相對濕度50%～60%、12 h光照/ 12 h黑暗周期。動物實驗經石河子大學醫學倫理委員會批準（批準號A2022-093-01）。

1.3 藥品與試劑

5-ASA（批號C13983588）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；FITC-葡聚糖（平均相對分子質量3 000～5 000，批號0456702411）購自德國Merck公司；DSS（相對分子質量40 000，批號S14049）購自上海源葉生物科技有限公司；緊密連接蛋白1（zona occludens 1，ZO-1）抗體（批號1002002-4）、封閉蛋白（Occludin）抗體（批號1002475-17）購自英國Abcam公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號230040406）購自中杉金橋生物技術公司；10%十二烷基硫酸鈉、1.5 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.8）、1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH 6.8）、蛋白質上樣緩沖液、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、脫脂奶粉（批號分別為1207Z034、20230504、2308001、A2306002、1130L072、6230815001、3230609001）購自北京索萊寶生物科技有限公司；聚山梨酯20（批號CT31191180）購自北京酷來搏科技有限公司；ECL化學發光試劑（批號2120c03）購自江蘇親科生物研究中心有限公司；TransZol Up試劑、EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒、PerfectStart?Green qPCR SuperMix試劑盒（批號分別為P61220、R10208、Q20409）購自北京全式金生物技術有限公司；丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號20230805）、天冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號20230325）、總膽紅素（total bilirubin，TBIL）試劑盒（批號20230422）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）試劑盒（批號20230313）、總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號20230414）、三酰甘油（triglycerides，TG）試劑盒（批號20230414）、肌酐（creatinine，CRE）試劑盒（批號20230327）均購自南京建成生物工程研究所。

1.4 儀器

AR124CN型電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；5418R型低溫離心機（德國Eppendorf公司）；ECLIPSE E100型正置光學顯微鏡（日本Nikon公司）；Cytation 3型酶標儀（美國Bio-Tek公司）；Mini-PROTEANTetra型電泳槽、MiniTransBlotCell型轉印槽、164-5070型恒壓電泳儀電源（美國Bio-Rad公司）；Tanon 5200 Multi型全自動化學發光成像系統（上海天能科技有限公司）；Rotor-Gene Q型qRT-PCR儀（德國QIAGEN公司）；ZD-9556型水平脫色搖床（江蘇盛藍儀器制造有限公司）。

2 方法

2.1 紅花籽粕的制備

取適量的紅花種子，粉碎，于50 ℃低溫真空干燥2 h，按固液比1∶6加入石油醚溶液，進行索氏浸提（75 ℃浸提3 h），濾過，減壓濃縮。收集紅花籽粕，45 ℃低溫烘干3 h，粉碎，40目過篩，粉末用生理鹽水配制成1 g/mL的溶液。采用苯酚-硫酸法測定1 g/mL紅花籽粕溶液中總多糖的含量，檢測波長為490 nm。以葡萄糖標準品質量濃度為橫坐標（），吸光度（）為縱坐標（），線性回歸方程為＝13.396＋0.094 4（2＝0.990 9），計算得出紅花籽粕溶液中總多糖質量分數為24.25%。

2.2 紅花籽粕急性毒性實驗

2.2.1 分組及給藥 取小鼠70只，雌雄各半，適應性飼養1周后，隨機分為對照組和紅花籽粕（0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 g/kg）組，每組10只。給藥前小鼠禁食12 h（自由飲水），于次日上午ig給藥1次，常規飼養，連續觀察7 d，記錄動物的毒性反應和死亡情況。

2.2.2 一般生長狀況觀察 觀察并記錄7 d內各組小鼠體質量變化、毛色光潔度、四肢活動、進食、飲水、分泌物及糞便等情況。記錄各組小鼠有無中毒癥狀出現、中毒反應的起始時間、嚴重程度、持續時間、是否可逆及死亡情況等，出現死亡或瀕死動物及時進行解剖檢查。

2.2.3 體質量測定 實驗期間每天同一時間記錄各組小鼠的體質量。

2.2.4 臟器病理檢查 給藥7 d后，全部動物處死解剖，觀察各臟器（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸）的色澤、體積和質地的變化；取肝臟、脾臟、腎臟稱定質量，計算臟器指數。

臟器指數＝臟器質量/體質量

肝、脾、腎組織用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，然后將組織標本切成8 μm厚的切片。切片用蘇木素-伊紅（HE）染色，顯微鏡觀察各個組織器官的組織結構及細胞形態。

2.2.5 血液檢查 給藥7 d后，全部動物摘眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心10 min后收集血清，檢測血清中ALT、AST活性及TBIL、BUN、TC、TG、CRE水平。

2.3 紅花籽粕對DSS誘導的UC小鼠的保護作用

2.3.1 分組、造模及給藥 小鼠適應性喂養1周后，隨機分為對照組、模型組、5-ASA（100 mg/kg）組和紅花籽粕（5 g/kg）組，每組10只，小鼠單獨編號。對照組自由飲用純凈水，其余小鼠自由飲用3% DSS水溶液，連續7 d，誘導急性UC。造模同時，各給藥組ig相應藥物，對照組和模型組ig等體積的水，1次/d，連續14 d。

2.3.2 疾病活動指數（disease activity index，DAI）評分 每天同一時間記錄小鼠體質量，觀察小鼠糞便性狀和便血情況，根據表1進行DAI評分[15-16]。

DAI＝(體質量變化分數＋便血分數＋大便性狀分數)/3

表1 DAI評分標準

2.3.3 腸道通透性檢測 末次給藥后小鼠禁食12 h，ig FITC-葡聚糖（50 mg/kg），4 h后小鼠ip 1%戊巴比妥鈉（60 mg/kg）麻醉，摘眼球取血，4 ℃、3 000 r/min離心15 min。精確吸取100 μL血清，在避光狀態下添加到黑色熒光酶標板上，每孔加入標準品100 μL，在波長480 nm和520 nm處檢測樣品的熒光強度，通過連續稀釋FITC-葡聚糖產生的標準曲線計算血清中FITC-葡聚糖的水平。

2.3.4 臟器指數測定 小鼠處死后，取肝臟、脾臟、腎臟，稱定質量，計算臟器指數。

2.3.5 結腸組織HE和阿利新藍-過碘酸雪夫（AB-PAS）染色 小鼠處死后，取結腸組織，肉眼觀察大體形態，測量長度后，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，然后將組織標本切成8 μm厚的切片。切片分別用HE和AB-PAS染色，光鏡下觀察結腸炎癥和杯狀細胞情況。組織損傷評分標準見表2，使用Image J軟件進行定量統計。

表2 組織損傷評分標準

2.3.6 qRT-PCR檢測結腸組織、、、、、、、黏蛋白1（mucin-1，）、mRNA表達 取30 mg結腸組織，Trizol法勻漿提取總RNA，使用EasyScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表3。

2.3.7 Western blotting實驗 取50 mg結腸組織，加500 μL裂解液進行勻漿，于冰上裂解30 min，12 000 r/min離心10 min后取上清液，測定蛋白濃度，加熱使蛋白變性。蛋白樣品經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉2 h；分別加入一抗（1∶1000），4 ℃搖床孵育過夜；次日洗膜5次，加入HRP標記的二抗（1∶5 000），室溫孵育2 h，洗膜5次，用ECL化學發光試劑曝光條帶，全自動化學發光成像系統進行成像，通過Image J軟件進行量化。

表3 引物序列

2.4 統計學分析

3 結果

3.1 紅花籽粕的急性毒性

3.1.1 一般生長狀況觀察 各組均未出現小鼠死亡的情況，并且所有小鼠的飲水量、攝食量、尿量及糞便等均正常，皮毛顏色正常、有光澤，四肢活動靈活，活動狀態良好，精神狀態良好，眼、耳、口、鼻處無異常分泌物，無中毒癥狀。

3.1.2 體質量變化 如表4所示，與對照組比較，紅花籽粕各劑量組小鼠體質量均無顯著差異。

表4 各組小鼠體質量變化(, n = 5)

3.1.3 臟器病理檢查 實驗結束，小鼠解剖后肉眼觀察主要臟器（心、肝、脾、肺、腎、胃、腸），胸腔、腹腔漿膜光滑無積液，臟器色澤、大小和質地正常，無明顯肉眼可見病變。對解剖后的主要臟器稱定質量，計算臟器指數，如表5所示，與對照組比較，紅花籽粕各劑量組小鼠的肝臟指數、脾臟指數和腎臟指數均無顯著性差異。組織病理學檢查（圖1）發現，對照組和紅花籽粕各劑量組小鼠的肝臟組織切片肝小葉結構完整、清晰可見，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列且吻合成網，肝竇清晰可見；脾臟組織切片結構未見異常變化，脾竇未見擴張，脾小體大小未見異常變化，紅白髓比例未見異常；腎臟組織切片結構未見異常變化，腎小管上皮細胞排列整齊，結構清晰，未見水腫性變化，腎小球大小、形態正常，未見明顯炎癥細胞浸潤。紅花籽粕各劑量組的病理切片與對照組吻合。

表5 各組小鼠臟器指數變化(, n = 5)

圖1 各組小鼠肝臟、脾臟、腎臟病理變化(HE, ×200)

3.1.4 血液檢查 如表6所示，與對照組比較，紅花籽粕（10 g/kg）組小鼠血清中ALT、AST活性均顯著升高（＜0.05），BUN水平顯著降低（＜0.05）。紅花籽粕各劑量組其余血液生化指標均無顯著差異。上述急性毒性實驗結果表明，紅花籽粕無明顯毒性。

3.2 紅花籽粕對DSS誘導的UC小鼠的保護作用

3.2.1 紅花籽粕對UC小鼠DAI評分和體質量的影響 對照組小鼠活動狀態良好，精神狀態良好，飲水飲食正常，毛發光滑有光澤，糞便呈緊實棕黃色。模型組小鼠在自由飲用3% DSS水溶液3 d后，出現身體蜷縮、活動減少、行動遲緩、精神不振、食欲減弱、毛發凌亂豎立、糞便松散等現象，隨著時間的增加，DAI評分顯著增加，體質量顯著下降（圖2），糞便呈稀水樣鮮紅色，并且出現死亡情況。給予紅花籽粕和5-ASA治療后，上述指標均有所改善，DAI評分顯著降低，體質量顯著升高，且紅花籽粕的改善效果最為顯著。

表6 各組小鼠血液生化指標變化(, n = 5)

與對照組比較：#＜0.05。

#< 0.05control group.

與對照組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01 ###P＜0.001；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同。

3.2.2 紅花籽粕對UC小鼠臟器指數、結腸長度和腸道通透性的影響 對照組小鼠結腸組織腸壁紋理清晰，黏膜表面光滑，形態完整，無紅斑和潰瘍，無黏連；模型組小鼠的結腸組織有明顯的形態損傷，如彌漫性出血點、紅斑、潰瘍、黏連、水腫和組織壞死。如圖3所示，與對照組比較，模型組小鼠的臟器指數顯著升高（＜0.01、0.001），結腸長度顯著縮短（＜0.001），腸道通透性顯著升高（＜0.001）。與模型組比較，各給藥組小鼠結腸長度顯著增加（＜0.05、0.01），腸道通透性顯著降低（＜0.01）；紅花籽粕組小鼠的臟器指數顯著降低（＜0.01），5-ASA組臟器指數無顯著變化。

3.2.3 紅花籽粕對UC小鼠結腸組織病理的影響 如圖4所示，HE染色結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠的結腸組織表現出明顯的損傷，如內黏膜損傷、黏膜潰瘍、黏膜充血、明顯的炎癥細胞浸潤、明顯的杯狀細胞丟失、隱窩完整性破壞、肌層水腫，組織學評分顯著升高（＜0.001）。AB-PAS染色結果顯示，與對照組比較，模型組小鼠存在嚴重的杯狀細胞衰竭和杯狀細胞成熟缺陷，黏蛋白消耗，黏液層被破壞，黏液較少。與模型組比較，5-ASA組小鼠的結腸組織損傷得到顯著改善（＜0.05），杯狀細胞消耗情況無顯著性變化；紅花籽粕組小鼠的結腸組織損傷和杯狀細胞消耗情況均得到顯著改善（＜0.05、0.01）。

圖3 紅花籽粕對UC小鼠臟器指數、結腸長度和腸道通透性的影響(, n = 6)

圖4 紅花籽粕對UC小鼠結腸組織病理變化的影響(, n = 6)

3.2.4 紅花籽粕對UC小鼠腸道炎癥的影響 根據結腸組織HE染色結果，推測紅花籽粕緩解DSS誘導的UC療效與抑制炎癥密切相關。如圖5所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中、、基因表達水平顯著升高（＜0.01、0.001），這些促炎因子可以募集中性粒細胞，誘導炎癥發生；同時基因表達水平顯著升高（＜0.001），這與腸黏膜屏障的完整性有關；此外，抗炎因子基因表達水平顯著降低（＜0.001）。與模型組比較，5-ASA和紅花籽粕組小鼠結腸組織中、、、基因表達水平均顯著降低（＜0.01、0.001），基因表達水平顯著升高（＜0.05、0.001），且紅花籽粕的逆轉效果最為顯著，表明紅花籽粕能通過抑制炎癥保護UC小鼠。

圖5 紅花籽粕對UC小鼠結腸組織炎癥因子水平的影響(, n = 6)

3.2.5 紅花籽粕對UC小鼠黏膜屏障功能的影響 如圖6所示，與對照組比較，模型組小鼠結腸組織中ZO-1和Occludin蛋白和基因表達水平均明顯降低（＜0.01、0.001），同時和基因表達水平也明顯降低（＜0.01、0.001）。與模型組比較，紅花籽粕組小鼠結腸組織中ZO-1、Occludin蛋白和基因表達水平均明顯升高（＜0.01、0.001），和基因表達水平也明顯升高（＜0.05、0.01），但5-ASA組以上指標均沒有顯著變化。表明紅花籽粕可以有效改善腸道黏膜的異常受損狀況，恢復上皮結構的完整性。

圖6 紅花籽粕對UC小鼠結腸組織黏膜屏障相關因子表達的影響(, n = 6)

4 討論

本研究對紅花籽粕進行急性毒性考察，各組均未見死亡小鼠，小鼠的生理狀況良好，不同劑量的紅花籽粕組小鼠的臟器指數均無顯著差異，肝臟、脾臟和腎臟的病理切片未見明顯的病變，炎性浸潤可忽略不計，無明顯異常，血清中ALT、AST、TBIL、CRE、BUN、TC和TG指標也未見異常，除了劑量為10 g/kg的紅花籽粕組小鼠的ALT、AST活性和BUN水平與對照組比較具有顯著差異，其余指標無顯著性差異，但根據已有文獻表明，ALT、AST和BUN的改變并不被認為具有毒理學意義[17-18]，因為在肝臟和腎臟指數或組織病理學檢查中均未顯示出相關的損傷，所以ALT、AST和BUN的變化與毒理學效應無關。綜上，急性毒性實驗結果表明紅花籽粕沒有明顯毒性。但其安全性評價還是應該結合長期毒性實驗進行進一步的驗證，以全面保證臨床用藥的安全性。同時本研究證實了紅花籽粕對DSS誘導的UC小鼠的治療作用，紅花籽粕可以改善UC小鼠的一般情況，顯著減緩小鼠體質量下降，降低DAI評分，提高臟器指數，增加結腸長度，降低腸道通透性，并改善了結腸損傷。

炎癥在UC的病理過程中起著重要作用，腸道炎癥會引起環境因素的劇烈爆發，可誘導結腸黏膜損傷，增加腸道通透性[19]。促炎因子和抗炎因子分泌失衡是腸道非特異性炎癥反應的關鍵環節。結腸組織中高水平的IL-6、TNF-α、IL-1β對中性粒細胞具有趨化性，使其激活并釋放炎癥介質，進一步放大炎癥反應，誘發或加重UC[20-23]。IFN-γ可通過影響緊密連接的結構和功能來破壞腸道屏障功能[24]。而IL-10是一種由單核細胞和巨噬細胞產生的抗炎性因子，可抑制中性粒細胞、單核細胞產生促炎性因子[25]。DSS誘導的UC小鼠的結腸組織通常以大量產生和分泌炎癥因子為特征[26]。本研究發現紅花籽粕顯著降低了UC小鼠結腸中促炎因子IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ的水平，顯著升高了抗炎因子IL-10的水平，這與5-ASA的作用相似。這些結果表明，紅花籽粕的抗炎作用至少是其作用機制之一。

UC由多因素共同促成，腸黏膜屏障的損壞是其關鍵病理機制之一，黏液屏障對維持腸道功能和內穩態具有重要作用。腸黏膜屏障是預防有害物質和病原菌的第一道防線，包括化學屏障、生物屏障、免疫屏障、機械屏障，其中機械屏障居于主導地位[27-28]。大量證據表明，腸黏膜屏障功能障礙與UC發病密切相關[29]。緊密連接蛋白是腸黏膜機械屏障的重要組成部分，臨床上，UC患者通常表現為腸黏膜屏障功能障礙和潰瘍型病變形成，造成局部滲漏，降低黏膜緊密連接蛋白（如ZO-1、Occludin等）的表達，腸黏膜通透性隨之增加，最終導致腸上皮屏障損傷加重，進一步加重腸道損傷[30-32]?；瘜W屏障主要由腸黏液層組成，而腸黏液層主要由腸道杯狀細胞、黏蛋白和抗菌蛋白3部分組成。黏蛋白分成分泌型黏蛋白（Muc2）和膜結合型黏蛋白（Muc1），結腸的黏液層形成網格篩，主要以Muc2為主[33-34]。據報道，UC患者的腸黏液厚度明顯減少，基因敲除的小鼠會發生自發性結腸炎[35]。杯狀細胞是分泌黏蛋白的基礎結構，當其受到細菌刺激時，能夠激活相應的信號轉導通路，促進Muc2蛋白的分泌，可將入侵的細菌沖回腸腔內[36]。本研究結果顯示，紅花籽粕顯著逆轉了UC小鼠的腸道通透性增高，修復了腸道屏障保護作用。在此基礎上進一步研究了紅花籽粕是否能調節DSS誘導的UC小鼠的腸道緊密連接蛋白和黏液層。結腸組織AB-PAS染色結果顯示，紅花籽粕可以恢復DSS誘導的杯狀細胞衰竭、成熟缺陷以及黏蛋白消耗，這與qRT-PCR和Western blotting結果一致，在UC小鼠中，緊密連接蛋白（ZO-1和Occludin）和黏蛋白（Muc1和Muc2）的表達顯著下降，表明結腸的黏膜屏障遭到破壞。但在經過紅花籽粕的治療后顯著逆轉了上述指標表達，這些結果充分證明了紅花籽粕對緩解UC的保護機制是通過增強腸道屏障和黏液屏障的功能來實現的。

本研究結果表明紅花籽粕安全無毒，為紅花籽粕的開發利用提供了初步的毒理學基礎，其臨床應用有效性及安全性尚需深入探討。同時本研究發現紅花籽粕對UC具有良好的治療作用，其作用機制可能是緩解炎癥和保護腸道屏障，為臨床應用紅花籽粕提供實驗依據。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 王少鑫, 浦江, 劉超群, 等. 炎癥因子TNF-α、IL-6和IL-4在潰瘍性結腸炎中的表達及臨床意義[J]. 胃腸病學和肝病學雜志, 2015, 24(01): 104-106.

[2] Hindryckx P, Baert F, Hart A,. Clinical trials in ulcerative colitis: A historical perspective [J]., 2015, 9(7): 580-588.

[3] Kim N H, Lee S M, Kim Y N,. Standardized fraction ofalleviates dextran sulfate sodium-induced chronic colitis in C57BL/6 mice via upregulation of FOXP3+regulatory T cells [J]., 2020, 10(10): 1463.

[4] Xiao H Y, Li H L, Wen Y F,.polysaccharides ameliorated ulcerative colitis via inhibiting inflammation and enhancing intestinal epithelial barrier function [J]., 2021, 180: 633-642.

[5] 郭艷娥. 康復新聯合5-ASA對潰瘍性結腸炎大鼠結腸黏膜IFN- γ、IL-4、IL-12表達的影響 [D]. 太原: 山西醫科大學, 2014.

[6] Yoon H, Jangi S, Dulai P S,. Incremental benefit of achieving endoscopic and histologic remission in patients with ulcerative colitis: A systematic review and Meta-analysis [J]., 2020, 159(4): 1262-1275.

[7] 孫欣欣, 都基莎, 孫穎. 半夏瀉心湯治療潰瘍性結腸炎有效性和安全性的Meta分析[J]. 藥物評價研究, 2023, 46(4): 878-884.

[8] 張曦, 徐小婷, MOHAMMED Ismail, 等. 青黛及其有效成分抗潰瘍性結腸炎藥理作用及機制的研究進展[J]. 藥物評價研究, 2022, 45(5): 997-1002.

[9] 沈飛, 夏明. 紅花籽粕的綜合利用[J]. 今日科苑, 2010(16): 171.

[10] 楊玉霞, 吳衛, 鄭有良, 等. 不同品種 (系) 紅花籽粕營養品質分析 [J]. 中國糧油學報, 2008, 23(4): 174-178.

[11] 楊新月. 紅花籽粕和亞麻籽粕木脂素成分的抗骨質疏松和抗炎活性研究 [D]. 呼和浩特: 內蒙古大學, 2023.

[12] 王海亮, ?？←? 南珊珊, 等. 紅花籽粕對紫色色桿菌ATCC12472群體感應抑制作用 [J]. 飼料研究, 2021, 44(19): 85-88.

[13] 田華, 信學雷, 麥提喀斯木·尼扎木丁, 等. 紅花籽粕提取物對糖尿病大鼠的降脂作用 [J]. 解放軍預防醫學雜志, 2016, 34(3): 351-353.

[14] 孫立. 紅花籽粕抗氧化肽的制備及抗氧化活性研究 [D]. 石河子: 石河子大學, 2014.

[15] Zou Q H, Zhang X, Liu X S,.polysaccharide attenuates DSS-induced ulcerative colitis in C57BL/6 mice [J]., 2020, 11(7): 6666-6679.

[16] 呂廷梅, 劉衡, 王希通, 等. 蜚蠊提取物脂質體的制備、表征及其抗潰瘍性結腸炎的療效[J]. 南京中醫藥大學學報, 2023(12): 1211-1223.

[17] Meng J R, Yan Z, Wu Y J,. Preclinical safety evaluation of IFNalpha2a-NGR [J]., 2008, 50(3): 294-302.

[18] Guo X H, Weng L J, Yi L T,. Toxicological safety evaluation in acute and 21-day studies of ethanol extract fromThunb [J]., 2022, 2022: 8518324.

[19] Yang Y F, Wang Y, Zhao L,. Chinese herbal medicines for treating ulcerative colitis via regulating gut microbiota-intestinal immunity axis [J]., 2023, 15(2): 181-200.

[20] Hou C Y, Chen L L, Yang L Z,. An insight into anti-inflammatory effects of natural polysaccharides [J]., 2020, 153: 248-255.

[21] 陳曦, 韓宇鵬, 陳剛, 等. 骨髓單個核細胞移植對潰瘍性結腸炎小鼠miR-21及炎癥因子TNF-α表達的影響 [J]. 中國老年學雜志, 2020, 40(10): 2190-2192.

[22] Fischer S, Rath T, Geppert C I,. Long-term combination therapy with anti-TNF plus vedolizumab induces and maintains remission in therapy-refractory ulcerative colitis [J]., 2017, 112(10): 1621-1623.

[23] Arifa R D, Madeira M F, de Paula T P,. Inflammasome activation is reactive oxygen species dependent and mediates irinotecan-induced mucositis through IL-1β and IL-18 in mice [J]., 2014, 184(7): 2023-2034.

[24] Singh U P, Singh N P, Murphy E A,. Chemokine and cytokine levels in inflammatory bowel disease patients [J]., 2016, 77: 44-49.

[25] 曾曉霞. 不同灸量對慢性潰瘍性結腸炎大鼠血清IL-8、IL-10含量影響的研究[D]. 沈陽: 遼寧中醫藥大學, 2015.

[26] Xu M, Duan X Y, Chen Q Y,. Effect of compound sophorae decoction on dextran sodium sulfate (DSS)-induced colitis in mice by regulating Th17/Treg cell balance [J]., 2019, 109: 2396-2408.

[27] Chen S S, Zhang C, He B H,. The role of lncRNAs in regulating the intestinal mucosal mechanical barrier [J]., 2021, 2021: 2294942.

[28] Xie X X, Geng C, Li X,. Roles of gastrointestinal polypeptides in intestinal barrier regulation [J]., 2022, 151: 170753.

[29] 韋喜生, 劉英香, 鄭曉君. NK細胞聯合紅花多糖對結腸癌細胞的殺傷作用及機制研究 [J]. 中國免疫學雜志, 2020, 36(5): 571-576.

[30] Martini E, Krug S M, Siegmund B,. Mend your fences: The epithelial barrier and its relationship with mucosal immunity in inflammatory bowel disease [J]., 2017, 4(1): 33-46.

[31] Hall C H T, Lee J S, Murphy E M,. Creatine transporter, reduced in colon tissues from patients with inflammatory bowel diseases, regulates energy balance in intestinal epithelial cells, epithelial integrity, and barrier function [J]., 2020, 159(3): 984-998.e1.

[32] 劉偉, 劉又前, 蔣翠花, 等. 基于Notch信號通路研究白頭翁湯對潰瘍性結腸炎小鼠腸黏液屏障的保護作用[J]. 中草藥, 2023, 54(16): 5257-5266.

[33] Bergstrom K, Fu J, Johansson M E,. Core 1- and 3-derived-glycans collectively maintain the colonic mucus barrier and protect against spontaneous colitis in mice [J]., 2017, 10(1): 91-103.

[34] Hoebler C, Gaudier E, De Coppet P,.genes are differently expressed during onset and maintenance of inflammation in dextran sodium sulfate-treated mice [J]., 2006, 51(2): 381-389.

[35] van der Sluis M, de Koning B A, de Bruijn A C,. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that MUC2is critical for colonic protection [J]., 2006, 131(1): 117-129.

[36] Mcguckin M A, Lindén S K, Sutton P,. Mucin dynamics and enteric pathogens [J]., 2011, 9(4): 265-278.

Acute toxicity and anti-ulcerative colitis effect of safflower seed meal in mice

QI Man1, WANG Wenxuan1, FU Xianglei1, JIANG Chao1, ZHANG Liang1, MD HASAN ALI1, LI Jian2, CHU Shenghui1, LIU Min1

1. Key Laboratory of Xinjiang Phytomedicine Resource and Utilization, Ministry of Education, Pharmacy School of Shihezi University, Shihezi 832000, China 2. State Key Laboratory of Bioreactor Engineering, School of Pharmacy, East China University of Science and Technology, Shanghai 200000, China

To evaluate the acute toxicity and anti-ulcerative colitis (UC) effect of safflower seed meal which is the by-product of extracting safflower seed oil from the seeds ofin mice.C57BL/6 mice were ig different doses of safflower seed meal, the organ index was calculated after 7 d, hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe pathological changes in liver, spleen and kidney tissues, liver function, kidney function and blood lipid levels in serum were measured to evaluate the acute toxicity of safflower seed meal. A UC mouse model induced by dextran sulfate sodium (DSS) was established, the body weight of mice was recorded every day, the disease activity index (DAI) score, colon length, and organ index were measured, pathological changes of colon tissue was evaluated by HE staining and Alisin blue periodate Schiff (AB-PAS) staining, the expressions of inflammatory and mucosal barrier related factors in colon tissue were detected by qRT-PCR and Western blotting.In the acute toxicity experiment, there was no significant difference in organ index and blood biochemical indicators between safflower seed meal group mice and control group, and no abnormalities were found in organ pathological sections. Safflower seed meal had a good protective effect on DSS-induced UC mice, which significantly improved clinical symptoms such as reduced body weight, increased DAI score, and shortened colon length (< 0.01), alleviated pathological damage to colon tissue, inhibited the infiltration of intestinal inflammatory cells, protected goblet cells, increased the expressions of tight junction protein and mucin (< 0.05, 0.01, 0.001), and improved intestinal barrier integrity.Safflower seed meal has high safety and significant therapeutic effects on DSS-induced UC mice.

safflower seed meal; acute toxicity; ulcerative colitis; inflammation; intestinal barrier

R285.5

A

0253 - 2670(2024)08 - 2601 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.011

2023-12-03

國家自然科學基金資助項目（82260817）；國家自然科學基金資助項目（82160121）；石河子大學高水平人才研究啟動基金（RCZK202036，RCZK202035）；新疆生產建設兵團指導科技計劃（2022ZD049，2022ZD005）；新疆自治區“天池英才”領軍人才項目

戚 曼，碩士研究生，研究方向為中藥藥理學。E-mail: 3052984093@qq.com

通信作者：劉 敏，副教授，碩士生導師，從事紅花活性成分及產業開發研究。E-mail: liuminshzu@163.com

楚生輝，副教授，碩士生導師，從事民族中藥藥理學研究。E-mail: 53865963@qq.com

[責任編輯 李亞楠]