基于標準提取物的歐洲越橘提取物質量控制方法及藥效活性關聯研究

李 鎮，李 俊，安若凡，孫 偉，岳中寶，楊 維*，賀瑞坤*

基于標準提取物的歐洲越橘提取物質量控制方法及藥效活性關聯研究

李 鎮1, 2，李 俊2，安若凡2，孫 偉2，岳中寶3，楊 維2*，賀瑞坤3*

1. 大理大學藥學院，云南 大理 671000 2. 中國中醫科學院中藥研究所 中藥鑒定與安全性評估北京市重點實驗室，北京 100007 3. 湯臣倍健股份有限公司營養健康研究院，廣東 廣州 510663

建立對照品非依賴性的20種花青素類成分定量分析方法，并利用該法對市售歐洲越橘提取物進行質量控制，同時篩選出代表性抗氧化活性成分。以歐洲越橘標準對照提取物替代對照品，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜（UPLC-QQQ-MS/MS）聯用技術，建立一種針對20種花青素類成分的定量方法，并利用該法對10批市售歐洲越橘提取物中的花青素類成分含量進行研究。采用DPPH自由基清除法和總抗氧化能力測試法評價不同歐洲越橘提取物的抗氧化能力。方法學驗證結果顯示，20種花青素類成分線性良好，為0.999 4～1.000 0，精密度RSD為0.05%～4.23%，穩定性RSD為0.29%～3.38%，平均加樣回收率為98.1%～102.1%，RSD為0.50%～4.12%。樣品分析結果顯示，不同樣品中部分花青素類成分含量存在顯著差異，其中錦葵素變化最大，RSD為18.23%。歐洲越橘提取物具有較好的DPPH自由基清除能力和總抗氧化能力。其中矢車菊素與DPPH自由基率相關性為0.94，芍藥素-3--半乳糖苷與總抗氧化活性相關性為0.93。二者有望作為歐洲越橘提取物清除DPPH自由基活性和總抗氧化活性的潛在質控成分。基于UPLC-QQQ-MS/MS所建立的對照品非依賴性的歐洲越橘提取物中20種花青素類成分定量分析方法，靈敏度高，準確性好，方法簡單，適用于歐洲越橘提取物中20種花青素類成分的含量測定，為中藥對照提取物替代單體對照品在中藥質量控制中的應用提供了數據支撐，為中藥材質量控制研究提供新的研究思路。

歐洲越橘；對照提取物；UPLC-QQQ-MS/MS；抗氧化能力；質量控制；花青素；矢車菊素-3--葡萄糖苷；芍藥素- 3--葡萄糖苷；飛燕草素3--半乳糖苷；錦葵素；矢車菊素；芍藥素-3--半乳糖苷

歐洲越橘L.是杜鵑花科（Ericaceae）的一種落葉灌木，原產于歐洲北部和中部的山區，也廣泛分布在意大利阿爾卑斯山和亞平寧山脈。越橘提取物含有豐富的花青素，具有緩解眼疲勞，保護肝臟、心腦血管，抗癌等作用，已被廣泛應用于保健食品、藥品等領域[1-2]。

花青素是歐洲越橘提取物的主要活性成分，其中常見的花青素類成分多達20種[3]。花青素結構中含有多個酚羥基，這一特點為其提供了強大的抗氧化活性基礎。由于花青素性質不穩定，且部分單體成分的提取分離難度大，加之儲存、運輸條件高，導致部分花青素對照品價格過高。越橘對照提取物是指經過特定工藝制備得到的含有多種主要成分或指標性成分的標準物質，具有易制備、性質穩定、價格低廉等特點[3]。同時歐洲藥典（EP 10.0）中對越橘對照提取物的提取方法、性狀、所含花青素種類、含量、干燥失重、總灰分等指標進行了嚴格控制。因此，本研究擬以越橘對照提取物替代對照品，對市售越橘提取物進行定量研究。

目前，花青素類成分常用的檢測方法有紫外分光光度法、薄層色譜法、高效液相-紫外分光光度法（HPLC-UV）等[4-5]。相較于以上方法，液質聯用技術具有選擇性強、靈敏度高、分離能力好等優點[6-7]。因此，本研究擬以歐洲越橘標準對照提取物代替對照品，采用超高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜（UPLC-QQQ-MS/MS）聯用技術，建立一種針對20種花青素類成分的定量方法，并利用該法對10批市售歐洲越橘提取物中的花青素類成分含量進行研究。對不同歐洲越橘提取物的抗氧化能力進行評價，并篩選歐洲越橘提取物清除DPPH自由基活性和總抗氧化活性的潛在質控成分。本研究有望為歐洲越橘花青素類成分的質量控制提供新方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Spectra Max I3X型多功能酶標儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；Agilent G6470型三重四極桿質譜儀、Agilent 1290型超高效液相色譜儀，美國安捷倫有限公司；臺式DK-3450 Mini型高速離心機，丹麥Labogene公司；Mettler Toledo ME155DU型十萬分之一級電子分析天平，賽多利斯科學儀器北京有限公司；移液器，大龍興創實驗儀器（北京）股份公司；舒美KQ-500DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Blue Pard型恒溫振蕩器，上海一恒科學儀器有限公司。

1.2 材料

10批市售歐洲越橘提取物分別購自湯臣倍健股份有限公司（批號20S0303003，編號S1）、寧波綠之健藥業有限公司（批號20221202/10962、20230102/10962、20230202/10962，編號S2～S4）、楊凌萃健生物工程技術有限公司（批號20221203、20230402、20230701，編號S5～S7）、桂林萊茵生物科技股份有限公司（批號23021302，編號S8）和諾黛然股份有限公司（批號118190120、118181018，編號S9、S10）。標準越橘對照提取物，批號ZEP-Y0001788-C1A，購自上海甄準生物科技有限公司。

對照品矢車菊素-3--葡萄糖苷（C11，批號CFN92046）、芍藥素-3--葡萄糖苷（C14，批號CFN92046）和飛燕草素3--半乳糖苷（C15，批號CFN92037），Chem Faces?，質量分數≥98%，均購于武漢天植生物技術有限公司。

1,1-二苯基-2-苦苯肼（DPPH），批號300267，購自Sigma公司；水溶性維生素E（Trolox），批號C14735198，質量分數≥99%，購自上海麥克林生化科技有限公司；總抗氧化能力檢測試劑盒（T-AOC），批號BC1315，購自北京索萊寶科技有限公司；甲醇、甲酸，質譜級，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；屈臣氏蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

2 方法與結果

2.1 液質聯用條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse Plus C18柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫35 ℃；流動相為0.5%甲酸水溶液（A）和含0.5%甲酸的98%乙腈水溶液（B）；洗脫梯度為0～10 min，5%～10% B；10～25 min，10%～25% B；25～30 min，25%～95% B；30～33 min，95%～5% B；體積流量0.3 mL/min；進樣量3 μL。

2.1.2 質譜條件 使用電噴霧離子源（ESI源），正離子模式，鞘氣溫度250 ℃。鞘氣體積流量11 L/min，噴嘴電壓500 V，霧化器壓力310.28 kPa。毛細管電壓：正電壓4 000 V；干燥氣溫度300 ℃；干燥氣體積流量5 L/min；各路氣體均為氮氣。數據采集模式為多反應監測模式。各定量成分的質譜參數見表1。

表1 20種花青素類成分的質譜信息

2.2 樣品制備

2.2.1 越橘提取物制備 精確稱取越橘提取物1 mg（精確至0.01 mg），加入1 mL 40%甲醇水溶液，超聲提取5 min，12 000 r/min離心5 min，取上清，用40%甲醇水稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜，制成100 μg/mL的供試品溶液。

2.2.2 標準越橘對照提取物制備 精確稱取越橘提取物1 mg（精確至0.01 mg），加入1 mL 40%甲醇水溶液（料液比1∶1），超聲提取5 min，12 000 r/min離心（離心半徑5 cm）5 min，取上清，制備成1 mg/mL的儲備液。用40%甲醇水稀釋將儲備溶液依次稀釋成500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6 μg/mL的對照提取物溶液。

2.2.3 混合越橘提取物制備 取6種不同來源的越橘提取物，制成混合越橘提取物，按照“2.2.1”項下的方法制備混合越橘提取物溶液。

2.2.4 對照品溶液制備 精確稱取C11、C14和C15各1 mg，加入40%甲醇水溶液，制備成1 mg/mL的對照品儲備液。精密吸取3種對照品溶液，混合，用40%甲醇水稀釋將儲備溶液依次稀釋成含C11（8 μg/mL）、C14（8 μg/mL）和C15（8 μg/mL）的混合對照品溶液，依次稀釋得一系列混合對照品溶液，分別為4、2、1、0.5 μg/mL。

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”和“2.2.4”項下不同質量濃度的標準越橘對照提取物溶液和對照品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項下的方法進行分析，記錄花青素的峰面積響應值。以溶液質量濃度為橫坐標（），峰面積響應值為縱坐標（），用最小二乘法進行線性回歸，得回歸方程。

基于標準越橘對照提取物的回歸方程分別為C1＝5.840 1－2.569，＝0.999 9；C2＝4.974 6＋49.224，＝0.999 8；C3＝1.873＋5.454，＝1.000 0；C4＝3.429－8.500，＝0.999 7；C5＝1.063 5＋0.528 7，＝0.999 7；C6＝9 303.8＋166 970.0，＝0.999 6；C7＝1 912.0＋23 430.0，＝0.999 6；C8＝7 578.2＋125 615.0，＝0.999 6；C9＝3 759.6＋64 990.0，＝0.999 7；C10＝ 11 182.0＋44 570.0，＝0.999 9；C11＝11 511.0＋121 451.0，＝0.999 7；C12＝4 490.3－ 5 913.0，＝0.999 7；C13＝2 691.1＋26 678.0，＝0.999 6；C14＝7 535.9＋266 948.0，＝0.999 5；C15＝9 450.3＋55 708.0，＝0.999 6；C16＝9 618.7＋49 714.0，＝0.999 6；C17＝5 108.5＋44 329.0，＝0.999 6；C18＝9 399.1＋103 213.0，＝0.999 5；C19＝3 767.7＋47 512.0，＝0.999 7；C20＝12 926.0＋76 915.0，＝0.999 7；C1～C20的線性范圍均為15.6～500.0 μg/mL。

基于對照品溶液的回歸方程分別為C11＝ 2 280 466.4＋82 554.0，＝0.999 8；C14＝ 1 374 443.9＋74 505.0，＝0.999 5；C15＝ 1 404 172.2＋52 319.0，＝0.999 5；C11、C14、C15的線性范圍均為0.5～8.0 μg/mL。

2.3.2 精密度考察 按“2.2.1”項下方法制備標準越橘對照提取物溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”項的色譜條件和質譜條件連續進樣6次，詳細記錄20種花青素的峰面積響應值，并計算各成分峰面積的RSD值。結果（表2）顯示20種花青素峰面積的RSD值在0.05%～4.23%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 按“2.2.3”項下的方法制備混合越橘提取物溶液，并將其放置在4 ℃保存。分別于0、2、4、6、8、12、24 h，按“2.1.1”和“2.1.2”項下的方法對20種成分進行測定，詳細記錄各成分峰面積響應值，計算RSD值，結果（表2）顯示RSD值為0.29%～3.38%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.3.4 重復性試驗 按“2.2.3”項下的方法平行制備6份混合越橘提取物溶液，按照“2.1.1”和“2.1.2”項下色譜條件和質譜條件對6份提取物溶液進行檢測，獲取20種花青素的峰面積響應值，并計算各成分質量分數的RSD值。結果（表2）顯示RSD值在1.02%～4.03%，表明該方法重復性良好。

表2 20種花青素類成分的精密度、穩定性、重復性和加樣回收率試驗結果(對照提取物法)

2.3.5 加樣回收率試驗 精確稱取“2.2.3”項下越橘提取物0.5 mg，分別加入越橘對照提取物約1.250、0.500、0.156 mg，加入1 mL 40%甲醇水溶液，超聲提取5 min，12 000 r/min離心（離心半徑5 cm）5 min，取上清，用40%甲醇水稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜。按照“2.1.1”和“2.1.2”項下的方法測定，記錄花青素峰面積，計算平均加樣回收率和RSD。結果（表2）顯示RSD均小于5.00%，表明該方法加樣回收率良好。

精密吸取3種對照品儲備液適量，混合，用40%甲醇水稀釋，配制成含C11（40 μg/mL）、C14（40 μg/mL）和C15（40 μg/mL）的混合對照品溶液（QC-高），用甲醇依次稀釋，制備成含C11（20 μg/mL）、C14（20 μg/mL）和C15（20 μg/mL）的中質量濃度質控溶液（QC-中），以及含C11（10 μg/mL）、C14（10 μg/mL）和C15（10 μg/mL）的低質量濃度質控溶液（QC-低）。先測定混合越橘提取物中C11、C14、C15含量后，精確稱混合越橘提取物0.5 mg，分別加入1 mL QC-高、QC-中和QC-低（每組平行6份），超聲提取5 min，12 000 r/min離心（離心半徑5 cm）5 min，取上清，用40%甲醇水稀釋10倍，過0.22 μm微孔濾膜。按照“2.1.1”和“2.1.2”項下的方法測定，記錄花青素峰面積，計算平均加樣回收率和RSD。結果（表3）顯示RSD均小于5.00%，表明該方法加樣回收率良好。

2.4 花青素類成分含量測定

2.4.1 樣品中20種花青素類成分的含量測定 取待測樣品，按照“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”和“2.1.2”項下方法測定。進行3次平行實驗，記錄峰面積根據隨行標準曲線計算供試品溶液中各成分質量濃度，按照下式計算樣品中各成分含量。

表3 3種花青素類成分的加樣回收率結果(對照品法)

被測成分相對于對照越橘提取物中該成分的量＝(標準曲線上計算出的各化合物濃度×所用提取溶劑體積×稀釋倍數)/所取樣品質量

采用建立的對照品非依賴性花青素類UPLC-QQQ-MS/MS定量方法，對10批市售歐洲越橘提取物中的花青素類成分含量進行研究。正離子模式下的提取離子流色譜圖見圖1。按照“2.4”項下公式計算被測成分相對于對照越橘提取物中該成分的量，結果表明不同產家中化合物C1、C4、C6、C10、C13、C14、C16～C18和C20含量差異相對較小（RSD＜5.00%），而其余化合物含量波動較大，其中化合物C5的含量差異最為明顯（RSD為18.23%）。結果詳見表4。

2.4.2 20種花青素類成分的相關性分析 相關性分析是指對2個或多個具備相關性的變量元素進行分析，從而衡量2個變量因素的相關性密切程度（0＜||≤0.3為微弱相關，0.3＜||≤0.5為低度相關，0.5＜||≤0.8為顯著相關，0.8＜||≤1.0為極顯著相關）。為了解花青素之間的相關性密切程度，用SPSS 22.0軟件對20種花青素類成分含量進行相關性分析，應用Graphpad Prism軟件對數據進行繪圖展示。結果如圖2所示。結果表明，矢車菊素與C6（＝0.87，＜0.01）、芍藥素與C7（＝0.86，＜0.01）、飛燕草素與C16（＝0.95，＜0.01）、飛燕草素與C15（＝0.91，＜0.01）、矮牽牛素與C17（＝0.90，＜0.01）呈極顯著相關。此外，C11與飛燕草素（＝?0.67，＜0.05）、C16（＝?0.55，＜0.05）、C8（＝?0.68，＜0.05）呈顯著負相關。此外，C10與C13（＝?0.62，＜0.05）、錦葵素與C18（＝?0.60，＜0.05）也呈顯著負相關。

圖1 越橘標準提取物(A) 和越橘提取物(S1, B) 中20種花青素類成分(C1～C20) 的MRM色譜圖

表4 10批越橘提取物樣品中20種花青素類成分相對于對照越橘提取物中該成分的量

圖2 20種花青素類成分的相關性分析

2.5 體外抗氧化活性檢測

2.5.1 DPPH自由基清除活性的測定 DPPH自由基清除能力測定參考文獻方法[8]。

（1）標準曲線繪制：精確稱取10.012 mg的水溶性維生素E（Trolox）對照品粉末，加入無水乙醇溶解200 mL，配制成200 μmol/L的Trolox母液。隨后將母液稀釋為20、40、60、100、140、160、180 μmol/L的Trolox標準梯度液。準確吸取0.9 mL不同濃度的Trolox對照品溶液于不同離心管中，隨后加入0.9 mL 100 μmol/L的DPPH乙醇溶液，混勻后在室溫下黑暗靜置30 min。在517 nm波長下測定吸光度值（1），同樣的方法檢測Trolox對照品與25%甲醇溶劑的吸光度值（2），以及25%甲醇溶劑與100 μmol/L DPPH溶液混合后的吸光度值（3），利用以下公式計算DPPH自由基的清除率。

清除率＝1－(1－2)/3

根據Trolox濃度（）和DPPH自由基清除率（）繪制標準曲線，得回歸方程為＝0.005 6－0.031 1，＝0.999 0，線性范圍為20～180 μmol/L。依據上述標準曲線，得到樣品的DPPH清除能力，單位為每克樣品干質量的μmol Trolox當量（Trolox μmol/g DW）。

（2）樣品的DPPH自由基清除率：分別取“2.2.1”項下制備的越橘提取物溶液和100 μmol/L DPPH溶液各0.9 mL，充分混合，室溫避光靜置30 min后，于517 nm處測定其吸光度（）值，每個樣品重復3次。DPPH自由基清除率公式同上。

對10批越橘提取物清除DPPH自由基活性研究，結果如表5所示，在質量濃度為0.1 mg/mL下，所有越橘提取物的DPPH自由基清除率均高于90%。樣品S1的DPPH自由基清除率最高，為96.7%，該樣品在質量濃度0.1 mg/mL時與178.26 Trolox μmol/g DW的清除率相當；樣品S10的清除率最低，為91.4%，該樣品在質量濃度0.1 mg/mL時與168.80 Trolox μmol/g DW的清除率相當。

表5 不同批次越橘提取物的DPPH自由基清除率和總抗氧化能力檢測結果(, n = 3)

2.5.2 總抗氧化活性測定

（1）標準曲線繪制：精確稱取FeSO4·7H2O 10 mg。加入0.9 mL蒸餾水，20 μL濃硫酸，配制成40 μmol/mL FeSO4標準溶液母液。將母液用蒸餾水稀釋為100.0、50.0、25.0、12.5、62.5、3.125 μmol/L的標準梯度液。根據總抗氧化能力試劑盒說明書，分別取500 μL標準溶液（蒸餾水作空白）加入500 μL工作液，充分混勻，反應10 min，測定593 nm下的，計算Δ標準＝標準－空白，此時Fe2+終濃度為50.0、25.0、12.5、6.25、3.125、1.562 5 μmol/L。根據Fe2+終濃度（，μmol/L）和Δ標準（），建立標準曲線，得回歸方程為＝5.118 6－0.000 7，＝0.999 8，線性范圍為1.562 5～50.0 μmol/L。

（2）樣品總抗氧化活性測定：根據總抗氧化能力試劑盒說明書，分別取“2.2.1”項下制備的越橘提取物溶液30 μL，蒸餾水90 μL及混合工作液900 μL充分混勻，室溫準確反應10 min，隨后于593 nm波長處測定值。將值代入標準曲線，得到達到同樣吸光度變化值（Δ）所需的標準液離子濃度（μmol/mL）。根據以下公式計算樣品總抗氧化能力（μmol/g）。

總抗氧化能力（μmol/g）＝×反總÷(樣÷樣總×)＝34×÷

樣總為加入提取液體積，1 mL；反總為反應總體積，1.02 mL；樣為反應中樣品體積，0.03 mL；為標準液離子濃度；為樣品質量

越橘提取物總抗氧化能力的結果如表5所示，其中，樣品S1的總抗氧化能力最高，為4.92 μmol/g，樣品S10的總抗氧化能力最低，為3.65 μmol/g。與DPPH自由基清除率實驗結果一致。

2.5.3 20種花青素類成分抗氧化活性的相關性分析 20個花青素類成分與抗氧化活性的相關性見表6。矢車菊素、C15與DPPH自由基清除率相關性均大于0.90，其中矢車菊素最高，為0.94。錦葵素、C10及C11相關性≤0.30。C9、C13與總抗氧化能力相關性均大于0.90，其中C13最高，為0.93。錦葵素和C10相關性≤0.30。

表6 20種花青素類成分與DPPH自由基清除率和總抗氧化能力的相關性

3 討論

3.1 標準對照提取物在含量測定中的優勢

對照品在被測物質含量測定過程中能夠起到至關重要的作用。但是，實際操作中常常面臨的問題是對照品價格較高或者較難獲得，這些因素無形中增加了科研的難度和阻力[9]。而利用標準對照提取物進行含量測定，相較于單體化合物最大的優勢在于其能夠同時對多個化合物進行含量測定，且標準對照提取物更穩定、易獲取，價格便宜，能夠解決部分單體化合物穩定性差、制備要求嚴苛、制備成本高、運輸保存難等問題[10-13]。歐洲越橘的標準對照提取物在《歐洲藥典》10.0中有記載，從定義、含量、生產過程、特征及鑒別5個方面對其進行了限制，質量可控。目前，《中國藥典》2020年版收載的對照提取物有23種，集中在揮發油、脂肪酸、皂苷類成分[14]，且這些對照提取物主要被用于定性鑒別，而在含量測定項目中應用較少。

3.2 檢測方法的選擇

目前，常見的花青素類成分含量測定方法有分光光度法、高效液相色譜紫外分光光度法及薄層色譜法等[15-16]。分光光度法雖然簡單常用，但不具備分離能力，不能同時對多個成分進行定量，且結果受到溶劑選擇、樣品顏色和雜質的影響，容易引入誤差；薄層色譜法快速，較多用于定性研究，具有分離能力，但分離能力不佳。綜合考慮本研究采用同時兼具液相色譜的高分離能力和質譜的高靈敏度等優點的LC-MS聯用法[6,17]。三重四極桿質譜（QQQ）的多反應監測模式（MRM）具有極高的靈敏度，可對樣品中的微量成分精確定量，結果準確可靠，是中藥定量分析中的有效手段[18-19]，因此，本實驗利用UPLC-QQQ-MS/MS建立越橘中20種花青素類成分的定量分析方法。

3.3 不同批次越橘提取物中花青素含量測定

通過對10批市售提取物含量測定結果可以看出，化合物C2、C3、C5、C7～C9、C11、C12、C15和C19在各樣品中含量波動較大（RSD＞5.00%），其中以C5差異最為顯著，RSD值為18.23%，而C1、C4、C6、C10、C13、C14、C16～C18和C20的含量波動相對較小（RSD＜5.00%）。此外，除S9和S10 2批樣品以外，其余8批樣品中化合物C4、C8、C16和C18的含量均高于越橘對照提取物，造成這種差異的原因可能是由于不同廠家生產工藝差異或材料來源不同等，導致越橘提取物中花青素含量波動較大。因此對越橘提取物中花青素類成分含量的控制顯得尤為重要。

本實驗對花青素類成分含量進行相關性分析，結果顯示矢車菊素與C6、芍藥素與C7、飛燕草素與C15及C16、矮牽牛素與C17呈極顯著相關，可能是因為在花青素合成通路中，花青素是各類花青苷合成的前體，在類黃酮-3-葡糖基轉移酶的作用下花青素實現糖基化變成較為穩定的花青苷，因此，它們的含量變化緊密相關。此外，C11與飛燕草素、C16、C8呈顯著負相關。可能是因為在花青素合成過程中，二氫黃酮醇在類黃酮3′-羥化酶、類黃酮3′,5′-羥化酶作用下分別生成二氫槲皮素和二氫楊梅黃酮，二者在二氫黃酮醇還原酶和花青素合成酶的作用下分別生成矢車菊素和飛燕草素[20]，矢車菊素、飛燕草素及二者糖苷皆由二氫黃酮醇分化而來，因此它們可能存在競爭關系，這一原因可能導致了它們呈負相關。

3.4 抗氧化活性的研究

目前，關于花青素抗氧化機制的研究已經取得了顯著進展。研究者認為花青素的抗氧化活性受到分子結構的影響，苷元、糖基、甲基和酰化酸的類型、糖基化、甲基化和酰化的位置和程度對其抗氧化能力均有影響。此外，花青素的質量分數也是影響抗氧化活性的重要因素[21]。本研究發現，在20種花青素類成分與抗氧化活性相關性研究中矢車菊素與DPPH自由基清除能力呈極顯著相關，C13與總抗氧化能力呈極顯著相關，建議將二者作為抗氧化活性的標志性成分，便于對后續花青素抗氧化活性的研究。

4 結論

歐洲越橘作為重要的“功能性食品”擁有悠久的食用史，隨著現代科學技術的發展及人民生活水平的提高，越橘提取物因其豐富的花青素含量而備受關注。本研究以《歐洲藥典》中的越橘標準提取物代替對照品，基于UPLC-QQQ-MS/MS建立了同時測定歐洲越橘提取物中20種花青素的定量方法，該方法穩定性高，精密度好，重復性強能夠準確測定越橘中花青素的含量。

同時定量結果表明，來自不同產家樣品中花青素含量差異，這可能是由于花青素本身不穩定或者生產工藝、材料來源等原因導致。此外抗氧化活性實驗表明，矢車菊素有望作為歐洲越橘提取物清除DPPH自由基活性的質控成分，而C13有望作為總抗氧化活性的質控成分。本研究為歐洲越橘花青素類成分的質量控制提供了新方法。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Schantz M, Mohn C, Baum M,. Antioxidative efficiency of an anthocyanin rich bilberry extract in the human colon tumor cell lines Caco-2 and HT-29 [J]., 2010, 1(1): 25-33.

[2] Colak N, Torun H, Gruz J,. Bog bilberry phenolics, antioxidant capacity and nutrient profile [J]., 2016, 201: 339-349.

[3] 毛丹, 馮睿, 程益清, 等. 越橘提取物中花色苷及游離花青素的測定[J]. 食品與藥品, 2021, 23(4): 306-310.

[4] Chandra A, Rana J, Li Y. Separation, identification, quantification, and method validation of anthocyanins in botanical supplement raw materials by HPLC and HPLC-MS [J]., 2001, 49(8): 3515-3521.

[5] Flamini R, D T. The anthocyanin content in berries of the hybrid grape cultivars Clinton and Isabella [J]., 2000, 2(39): 79.

[6] 張黎媛. 液質聯用技術在中藥質量控制中的應用[J]. 世界中醫藥, 2018, 2(13): 513-516.

[7] 高漸聯, 周霖, 王肖輝, 等. 基于液質聯用結合網絡藥理學的復方傷痛膠囊中5種藥效成分定量及作用機制研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(6): 1793-1803.

[8] Brand-Williams W, Cuvelier M E, Berset C. Use of a free radical method to evaluate antioxidant activity [J]., 1995, 28(1): 25-30.

[9] 吳婉瑩, 果德安. 中藥整體質量控制標準體系構建的思路與方法[J]. 中國中藥雜志, 2014, 39(3): 351-356.

[10] 朱星宇, 趙根華, 高倩倩, 等. 對照提取物法測定補骨脂飲片中7種成分含量[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2017, 23(15): 85-91.

[11] 張鑫, 張苗苗, 王云霞, 等. 對照提取物法測定銀杏葉制劑中總黃酮醇苷的含量[J]. 中南藥學, 2016, 14(8): 867-870.

[12] 陳沛, 金紅宇, 孫磊, 等. 對照提取物在中藥整體質量控制中的應用[J]. 藥物分析雜志, 2016, 36(2): 185-195.

[13] 劉剛, 劉金梅, 穆開朗, 等. 2-異丁基蘋果酸葡萄糖氧基芐酯類對照提取物在白及質量控制中的應用研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(4): 1260-1266.

[14] 中國藥典[S]. 四部. 2020: 433.

[15] 劉芳芳, 向成鋼, 張宏, 等. 高效液相色譜法與pH示差法測定紫莢豌豆花青素含量的比較[J]. 食品科技, 2022, 47(1): 298-303.

[16] 李夏. 葡萄中花青素含量的測定與分析[J]. 糧食流通技術, 2022, 15(28): 179-182.

[17] 劉榮霞, 果德安, 葉敏, 等. 液質聯用技術(LC/MS)在中藥現代研究中的應用[J]. 世界科學技術—中醫藥現代化, 2005, 7(5): 33-40.

[18] 李俊, 米要磊, 王思嘉, 等. 基于UPLC-QQQ-MS/MS的工業大麻中6種大麻素類成分定量研究[J]. 中草藥, 2022, 53(4): 1163-1172.

[19] 劉祥東, 梁瓊麟, 羅國安, 等. 液質聯用技術在醫藥領域中的應用[J]. 藥物分析雜志, 2005, 25(1): 110-116.

[20] 賈趙東, 馬佩勇, 邊小峰, 等. 植物花青素合成代謝途徑及其分子調控[J]. 西北植物學報, 2014, 34(7): 1496-1506.

[21] 李煦, 白雪晴, 劉長霞, 等. 天然花青素的抗氧化機制及功能活性研究進展[J]. 食品安全質量檢測學報, 2021, 12(20): 8163-8171.

Quality control method and pharmacological activity correlation study ofextract based on reference extract

LI Zhen1, 2, LI Jun2, AN Ruofan2, SUN Wei2, YUE Zhongbao3, YANG Wei2, HE Ruikun3

1. College of Pharmaceutical Science, Dali University, Dali 671000, China 2. Key Laboratory of Beijing for Identification and Safety Evaluation of Chinese Medicine, Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100007, China 3. Institute of Nutrition & Health, BYHEATH Co., Ltd., Guangzhou 510663, China

To establish a method for the quantitative analysis of 20 anthocyanin components based on the reference extract of Ouzhouyueju () and to utilize the method for the quality control of commercializedmacrocarpon extracts, and screen out a representative antioxidant active ingredient.An ultra-performance liquid chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometry (UPLC-QQQ-MS/MS) method was developed for the quantification of 20 anthocyanin components using reference extract ofmacrocarpon as the standard, and the method was utilized to investigate 10 batches of commercially availablemacrocarpon extracts. The antioxidant capacity of differentextracts was evaluated using the DPPH free radical scavenging method and the total antioxidant test.A UPLC-QQQ-MS/MS method was developed for the quantitative analysis of 20 anthocyanin compounds in the extract ofwith reference extract. Methodological validation demonstrated good linearity (: 0.999 4—1.000 0), precision RSD (0.05%—4.23%), stability (0.29%—3.38%), and average recovery rate (98.1%—102.1%) of the 20 anthocyanin components. The results of the sample analysis showed that there were significant differences in the content of some components in different samples, with the greatest variation being malvidin with an RSD of 18.23%.extract has better DPPH radical scavenging and total antioxidant capacity. Cyanidin and peonidin-3--galactoside could be potential quality control components for assessing the DPPH radical scavenging and total antioxidant activity ofextracts, respectively.A quantitative analysis method of 20 anthocyanin components inextract was established in this study based on UPLC-QQQ-MS/MS. The method is sensitive, accurate, simple, and suitable for the determination of the content of 20 anthocyanin components in theextract, which provides data support for the application of the reference extract of traditional Chinese medicine to replace the single standard in the quality control of traditional Chinese medicine. The method provides a new research idea for the quality control study of traditional Chinese medicine.

L.; reference extract; UPLC-QQQ-MS/MS; antioxidant capacity; quality control; anthocyanins; cyanidin-3--glucoside; peonidin 3--glucoside; delphinidin-3--galactoside; malvidin; cyanidin; peonidin-3--galactoside

R283.6

A

0253 - 2670(2024)08 - 2561 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2024.08.007

2023-09-26

中央級公益性科研院所基本業務費專項資金資助（ZZ13-YQ-45）；中國中醫科學院科技創新工程項目（CI2021A04902）；中央級公益性科研院所基本業務費專項資金資助（ZXKT18015）

李 鎮（1996—），男，彝族，碩士研究生，從事藥動學研究。E-mail: lizhen77649@126.com

通信作者：楊 維，副研究員，從事藥動學研究。E-mail: wyang@icmm.ac.cn

賀瑞坤，從事天然產物功效研究及保健食品開發。E-mail: herk@by-health.com

[責任編輯 鄭禮勝]