間充質(zhì)干細胞外泌體在腎移植術(shù)后口腔潰瘍防治中的效果觀察

吳正敏,鄭春燕,許藝蓮

腎移植術(shù)后好發(fā)口腔潰瘍,主要因機體免疫力低下、術(shù)后免疫抑制劑大劑量使用所致,出現(xiàn)口腔潰爛、局部腫痛等癥狀,導(dǎo)致患者進食困難、生活質(zhì)量下降,影響術(shù)后營養(yǎng)攝取,不利于術(shù)后恢復(fù)[1]?？谇粷兺ǔ?～2周可自愈,該過程經(jīng)歷患處炎癥反應(yīng)、肉芽組織增生、修復(fù)上皮等一系列復(fù)雜的生物學過程;而由于腎移植術(shù)后特殊的病理生理狀態(tài),使得此類患者口腔潰瘍不易自愈[2]。臨床處理中多采取生理鹽水清洗、清淡飲食等方式干預(yù)。間充質(zhì)干細胞是具有多向分化潛能的成體干細胞,可發(fā)揮分泌細胞因子、調(diào)節(jié)免疫、促進血管形成等生物功能,在非小細胞肺癌、肌腱損傷等多種疾病與損傷的治療中作用顯著[3-4]。臨床處理過程中發(fā)現(xiàn),含漱間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)上清液有利于促進口腔潰瘍愈合[5]。本研究系統(tǒng)調(diào)查分析我院近期腎移植術(shù)后患者口腔潰瘍的發(fā)生情況,并觀察采用間充質(zhì)干細胞外泌體治療效果,現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

1 資料與方法

1.1 基線資料及分組

選取我院2021年10月—2022年4月收治的100例腎移植術(shù)后患者,其中男71例,女29例;年齡38～61(50.68±4.97)歲;體質(zhì)量指數(shù)20～27(23.79±1.13)kg/m2;原發(fā)病:慢性腎小球腎炎84例,高血壓腎病7例,糖尿病腎病6例,過敏性紫癜腎炎3例;有口腔潰瘍史38例?？谇粷冊\斷標準:口腔黏膜、口唇、咽部不同程度紅腫、糜爛、疼痛、潰瘍。納入標準:首次腎移植;移植腎功能正常;1個月內(nèi)無其他感染性疾病;免疫抑制劑方案為他克莫司+嗎替麥考酚酯+甲潑尼龍;無其他口腔疾患。排除標準:伴有自身免疫功能缺陷;腎移植術(shù)前有長期免疫抑制劑用藥史;有肝、肺、心等重要臟器重大手術(shù)史;治療依從性差,無法配合本研究干預(yù);嚴重營養(yǎng)不良;精神異常。統(tǒng)計術(shù)后口腔潰瘍發(fā)生情況,將發(fā)生口腔潰瘍患者根據(jù)干預(yù)方式的不同分為觀察組和對照組。本研究征得我院醫(yī)學倫理委員會同意(LW2021622),患者均知情同意并簽屬知情同意書。

1.2 干預(yù)方法

對照組每日3餐后用生理鹽水做口腔護理,清潔口腔潰瘍處,連續(xù)干預(yù)7 d。觀察組在對照組基礎(chǔ)上給予間充質(zhì)干細胞外泌體噴霧劑,于生理鹽水清理后噴至潰瘍處,連續(xù)干預(yù)7 d。間充質(zhì)干細胞外泌體制劑制備:于無菌狀態(tài)下取臍帶組織,PBS(1%雙抗:青霉素和鏈霉素)洗滌,剔除組織內(nèi)靜動脈血管,剝離華通膠,EB病毒、人類免疫缺陷病毒、乙型肝炎病毒、巨細胞病毒檢測合格后,剪碎至1 mm3獲取樣品;貼壁培養(yǎng),置于α-MEM培養(yǎng)基(15 mL,10%胎牛血清),于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)12～15 d,棄細胞上清液,PBS洗滌(1%雙抗),加入胰蛋白酶10 mL至液體變?yōu)榘咨?再加入α-MEM培養(yǎng)基(15 mL,10%胎牛血清),離心(1 000 r/min,5 min),接種至無血清α-MEM培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)(接種密度1.6×106/mL),于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)72 h,再次細胞傳代處理,收集上清液;離心(2 000 r/min,10 min)并除菌過濾,獲取間充質(zhì)干細胞外泌體溶液,經(jīng)BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測溶液中外泌體濃度為0.1 mg/mL;制備成制劑,-80 ℃凍存。

1.3 觀察指標

1)統(tǒng)計納入腎移植術(shù)后患者的口腔潰瘍發(fā)生情況。

2)干預(yù)7 d后比較2組治療效果。干預(yù)3 d內(nèi)疼痛消除,潰瘍完全愈合,為顯效;干預(yù)4～6 d疼痛消除,潰瘍完全愈合,為有效;未達上述標準為無效[6]。將顯效、有效計入總有效。

3)比較2組口腔潰瘍病情及恢復(fù)情況,包括進食恢復(fù)時間、疼痛消失時間、潰瘍愈合時間。

4)比較2組治療前及治療3、7 d后口腔pH值,唾液免疫球蛋白[分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、溶菌酶(Lys)、免疫球蛋白G(IgG)]水平。口腔pH值采用pH試紙檢測,浸潤唾液10 s后取出獲取pH值。唾液采集:采集前30 min漱口,舌尖抵住上顎或下顎齒根,向橢圓形漏斗中吐入唾液,直至唾液達2 mL填充線高;采用雙抗夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測唾液sIgA、IgG水平,采用平板打孔測定法檢測Lys水平。

5)比較2組治療前及治療3、7 d后血清白細胞介素-6(IL-6)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、前列腺素E2(PGE2)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。采集空腹靜脈血4 mL,離心(3 500 r/min,10 min)取血清,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測。

6)比較2組治療前及治療3、7 d后病情評分。a.采用疼痛視覺模擬評分法(VAS)評分評估口腔疼痛程度,計分0～10分,0分表示無疼痛,10分表示劇烈疼痛,分值越高表示疼痛程度越劇烈;b.采用口腔評估指南(OAG)評分評估口腔潰瘍癥狀嚴重程度,該量表采用1～3分3級評分制,共8個條目,總分8～24分,分值越高說明口腔潰瘍癥狀越嚴重;c.采用口腔健康影響程度量表(OHIP-14)評估口腔健康狀態(tài),該量表包括7個條目,采用0～4分5級評分法,總分0～56分,分值越低提示口腔健康狀態(tài)越好。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 腎移植術(shù)后口腔潰瘍發(fā)生情況

100例腎移植術(shù)后患者中有40例發(fā)生口腔潰瘍,60例未發(fā)生口腔潰瘍。

2.2 治療效果比較

將40例腎移植術(shù)后發(fā)生口腔潰瘍患者根據(jù)治療方法不同分成觀察組20例和對照組20例,2組性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)、術(shù)后潰瘍發(fā)生時間、單個潰瘍面直徑、潰瘍數(shù)量比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05),見表1。觀察組總有效率為95.00%高于對照組的65.00%(P<0.05),見表2。

表1 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者一般資料比較

表2 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者治療效果比較[例(%)]

2.3 口腔潰瘍病情及恢復(fù)情況比較

觀察組進食恢復(fù)時間、疼痛消失時間、潰瘍愈合時間均短于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表3。

表3 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者及恢復(fù)情況比較

2.4 治療前后口腔pH值、唾液免疫球蛋白比較

治療3、7 d后2組口腔pH值、唾液sIgA水平均較治療前升高,唾液Lys、IgG水平均較治療前降低,且治療7 d后口腔pH值、唾液sIgA水平均較治療3 d后升高,唾液Lys、IgG水平較治療3 d后降低(P<0.05);治療3、7 d后觀察組口腔pH值、唾液sIgA水平高于對照組,唾液Lys、IgG水平低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表4。

表4 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者治療前后口腔pH值、唾液免疫球蛋白比較

2.5 治療前后血清炎性因子比較

治療3、7 d后2組血清IL-6、TGF-β、PGE2、TNF-α水平均較治療前下降,且治療7 d后各項血清炎性因子均較治療3 d后下降(P<0.05);治療3、7 d后觀察組血清IL-6、TGF-β、PGE2、TNF-α水平均低于對照組(P<0.01)。見表5。

表5 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者治療前后血清炎性因子比較

2.6 治療前后病情評分比較

治療3、7 d后2組OAG評分、VAS評分、OHIP-14評分均較治療前下降,且治療7 d后各病情評分均較治療3 d后下降(P<0.05);治療3、7 d后觀察組OAG評分、VAS評分、OHIP-14評分均低于對照組(P<0.05,P<0.01)。見表6、表7。

表6 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者治療前后OAG、VAS評分比較分)

表7 2組腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者治療前后OHIP-14評分比較分)

3 討論

腎移植術(shù)后由于大量應(yīng)用免疫抑制劑、廣譜抗生素,加之原發(fā)病進展過程中微量元素缺乏、激素水平改變、免疫力降低、飲食等因素,使得口腔潰瘍發(fā)生率較高且不易治愈,但查閱文獻發(fā)現(xiàn),臨床研究中尚缺乏確切的統(tǒng)計數(shù)據(jù)[7]。本研究統(tǒng)計顯示,100例腎移植術(shù)后患者中有40例發(fā)生口腔潰瘍,可見探究腎移植術(shù)后口腔潰瘍的有效干預(yù)方法意義重大?，F(xiàn)階段對于口腔潰瘍主要以對癥治療、減輕疼痛為原則,促進潰瘍愈合。由于腎移植術(shù)后口腔潰瘍不僅導(dǎo)致患者口腔局部疼痛,且影響患者正常進食,可能繼發(fā)營養(yǎng)不良,影響患者術(shù)后恢復(fù)。而此類患者給予免疫抑制、抗炎治療必不可少,為口腔潰瘍的臨床干預(yù)帶來困難。

經(jīng)病理學分析,口腔潰瘍發(fā)生后黏膜固有層中膠原纖維水腫、玻璃樣變性斷裂、彎曲紊亂或均質(zhì)化,甚者膠原纖維破壞、消失[8-9]。外泌體是包裹有核酸、蛋白質(zhì)的脂質(zhì)雙分子層小囊泡,作為細胞間通訊的重要介質(zhì)可攜帶間充質(zhì)干細胞的胞內(nèi)蛋白、mRNAs、膜蛋白,進而發(fā)揮多種病理生理功能,促進血管生成、抑制免疫細胞活性等[10-13]。本研究顯示,觀察組總有效率高于對照組,且進食恢復(fù)、疼痛消失、潰瘍愈合時間均有所縮短,提示間充質(zhì)干細胞外泌體治療腎移植術(shù)后口腔潰瘍效果較好。毛水紅等[14]研究表明,臍帶間充質(zhì)干細胞有利于重度糖尿病足潰瘍患者創(chuàng)面愈合。sIgA屬局部抗菌免疫球蛋白,其水平在病原菌侵入時下降,可反映口腔感染情況;唾液中IgG在口腔黏膜受損時升高;Lys具有抗感染、免疫調(diào)節(jié)功能[15-16]。腎移植術(shù)后患者口腔內(nèi)環(huán)境偏酸,本研究顯示治療3、7 d后觀察組口腔pH值、唾液sIgA水平高于對照組,唾液Lys、IgG水平低于對照組。GUAN等[17]報道顯示,骨髓間充質(zhì)干細胞可增加唾液與唾液蛋白分泌,間充質(zhì)干細胞可改善動物模型放射性口腔潰瘍的微觀、宏觀形態(tài)。

本研究結(jié)果顯示,治療3、7 d后干預(yù)組血清IL-6、TGF-β、PGE2、TNF-α水平及OAG評分、VAS評分、OHIP-14評分均低于對照組,表明在生理鹽水常規(guī)護理基礎(chǔ)上應(yīng)用間充質(zhì)干細胞外泌體可明顯緩解腎移植術(shù)后患者口腔潰瘍疼痛感,減輕口腔潰瘍炎癥反應(yīng),提高治療效果。生理鹽水沖洗潰瘍處可起到清潔口腔、緩解局部疼痛、促進愈合等作用,但口腔潰瘍表面常覆蓋著炎性分泌物,單純生理鹽水無法達到消炎抑菌作用[18]。而間充質(zhì)干細胞外泌體能通過旁分泌作用介導(dǎo)干細胞80%的治療作用,使外泌體攜帶的蛋白質(zhì)等納米顆粒被受體細胞內(nèi)吞,參與細胞間通訊,誘導(dǎo)CD4+CD25+FOXP3+調(diào)節(jié)性T細胞增殖,促進組織修復(fù)[19-20]。此外,間充質(zhì)干細胞外泌體含有成纖維細胞生長因子、TGF、血管內(nèi)皮生長因子等有促血管生成作用的效應(yīng)分子,激活核因子-κB信號通路,調(diào)節(jié)血管生成,進而促進創(chuàng)面肉芽組織修復(fù),改善患者口腔健康[21]。

綜上,腎移植術(shù)后易發(fā)生口腔潰瘍,腎移植術(shù)后口腔潰瘍患者應(yīng)用間充質(zhì)干細胞外泌體干預(yù)效果較好,可有效縮短患者潰瘍愈合時間,緩解炎癥反應(yīng),減輕潰瘍疼痛,促進患者口腔健康。