家兔心肌不同缺血時(shí)間與再灌注的形態(tài)學(xué)變化研究

高蓉 徐雯 曹佳濤 趙丹丹

【摘要】 目的 探討家兔心肌不同缺血時(shí)間點(diǎn)和再灌注后的形態(tài)學(xué)變化規(guī)律。方法 采用結(jié)扎家兔心臟冠狀動(dòng)脈左室支建立急性缺血再灌注模型，應(yīng)用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色法、蘇木素-堿性品紅-苦味酸（hematoxylin-basic fuchsin-picric，HBFP）染色法，以觀察不同缺血時(shí)間與再灌注后心肌細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果 HE染色，心肌缺血10 min未見(jiàn)明顯變化，缺血6 h后見(jiàn)核碎裂、核溶解，缺血12 h后見(jiàn)大片壞死；HBFP染色，心肌缺血10 min見(jiàn)點(diǎn)狀紅色陽(yáng)性著色，隨著缺血時(shí)間增加陽(yáng)性著色范圍及形態(tài)顯示更清晰。急性心肌缺血20 min出現(xiàn)收縮帶壞死，缺血6 h內(nèi)收縮帶壞死分級(jí)逐漸加重，6 h后收縮帶呈小灶狀出現(xiàn)在大片壞死周邊，分級(jí)減輕。心肌缺血再灌注后，心肌損傷加重，缺血時(shí)間越長(zhǎng)，再灌注心肌的損傷越重。結(jié)論 HBFP染色在急性心肌缺血早期可顯示細(xì)胞形態(tài)的變化且更易于觀察，心肌細(xì)胞收縮帶壞死的分級(jí)和分型可反映心肌缺血的程度，缺血時(shí)間和再灌注時(shí)間決定了心肌的損傷程度，其中缺血時(shí)間更為重要。

【關(guān)鍵詞】 心肌缺血；再灌注；HE染色；HBFP染色

文章編號(hào)：1672-1721（2024）01-0001-04 ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? ? 中國(guó)圖書(shū)分類號(hào)：R54

心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI）對(duì)缺血后心功能的恢復(fù)有著嚴(yán)重的影響，其中，缺血時(shí)間與再灌注時(shí)間是關(guān)鍵因素，心肌的形態(tài)學(xué)變化更能直觀地反映出缺血、再灌注損傷的程度及其范圍。

收縮帶壞死（contraction band necrosis，CBN）是橫紋肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)的一種與肌纖維長(zhǎng)軸垂直的強(qiáng)著色條帶狀結(jié)構(gòu)，若在心肌細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)，是心肌急性缺血的形態(tài)學(xué)特征，也是心肌細(xì)胞死亡的一個(gè)標(biāo)記[1]。本研究通過(guò)結(jié)扎家兔冠狀動(dòng)脈左室支建立急性心肌缺血再灌注模型，分別在不同缺血時(shí)間點(diǎn)與再灌注后觀察家兔心肌形態(tài)學(xué)和CBN變化，探討其發(fā)展規(guī)律，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年家兔80只，體質(zhì)量2.3～3.0 kg，雌雄不限，購(gòu)自蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（甘）2019-0002]，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 缺血/再灌注模型建立

選取健康成年家兔，檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)肢體Ⅱ?qū)?lián)心電圖，剔除心電異常家兔。沿著家兔左側(cè)3肋—4肋間走向依次切開(kāi)皮膚（3～4 cm）、皮下組織，鈍性分離肋間肌入胸，用擴(kuò)胸器撐開(kāi)，輕提并小心剪開(kāi)心包，暴露心臟。

缺血模型：在左心耳緣下5～10 mm內(nèi)（左室支起點(diǎn)與心尖連線的中點(diǎn)位置）結(jié)扎左室支。心電圖兩相鄰導(dǎo)聯(lián)ST段弓背上抬（＞0.2 mV）且30 min內(nèi)不回落或結(jié)扎線下肉眼觀局部心肌變紫紅色且有節(jié)段性運(yùn)動(dòng)不良，提示結(jié)扎成功。

缺血再灌注模型：在左心耳緣下5～10 mm內(nèi)連同軟膠管一同結(jié)扎左室支，判斷標(biāo)準(zhǔn)同上，到達(dá)預(yù)定時(shí)間點(diǎn)拔出軟膠管可實(shí)現(xiàn)缺血區(qū)域心肌復(fù)流。當(dāng)心肌局部組織反應(yīng)性充血，心電圖抬高的ST段下降1/2以上時(shí)，標(biāo)志著再灌注成功。

假手術(shù)組開(kāi)胸后左室室支動(dòng)脈僅穿線不結(jié)扎。

1.2.2 取材

實(shí)驗(yàn)后，各組家兔注射空氣處死，迅速摘除心臟，置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的甲醛中固定48 h。取材從心尖至結(jié)扎線下垂直長(zhǎng)軸橫向片層狀切開(kāi)，每片厚度1.5～2.0 cm，固定后常規(guī)脫水，石蠟包埋制片。

1.2.3 組織學(xué)染色技術(shù)與方法

HE染色：使用蘇木素和伊紅進(jìn)行常規(guī)染色。

HBFP染色：根據(jù)試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行染色。

1.3 圖像分析

采用MoticEasyscan數(shù)碼掃描系統(tǒng)觀測(cè)HE染色和HBFP染色切片，記錄壞死形態(tài)、區(qū)域以及CBN累及心肌纖維的層數(shù)，根據(jù)收縮帶壞死程度和類型對(duì)其進(jìn)行分級(jí)和分類。切片鏡下放大倍數(shù)為10×20。

1.3.1 CBN分級(jí)

在200倍鏡下，根據(jù)CBN出現(xiàn)的部位、形態(tài)特征和累及心肌纖維層數(shù)，將壞死程度分為4個(gè)等級(jí)[2]：無(wú)收縮帶壞死（-）；單個(gè)局部出現(xiàn)收縮帶壞死，呈局灶性，累及2～5層心肌纖維為（+）；心肌出現(xiàn)多灶性收縮帶壞死，每一部位累及5～10層心肌纖維為（++）；心肌出現(xiàn)片狀收縮帶壞死，有的融合呈大片狀，累及心肌纖維十幾層甚至幾十層者為（+++）。

1.3.2 CBN分類

根據(jù)光鏡及電鏡下CBN的形態(tài)特點(diǎn)，宋良文等[3]將其分為4種類型：節(jié)段型，收縮帶的寬度不小于長(zhǎng)度的1/2，也可等于或超過(guò)長(zhǎng)度；條帶型，收縮帶的寬度小于長(zhǎng)度的1/2，呈條狀或帶狀；枝條型，呈彎曲細(xì)條狀，多有分支；碎片型，收縮帶斷裂并分離，呈不規(guī)則碎片狀。

2 結(jié)果

2.1 假手術(shù)組HE染色及HBFP染色結(jié)果

假手術(shù)組家兔心肌細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，胞漿染色均勻，肌纖維排列整齊，未見(jiàn)CBN。心肌細(xì)胞在HBFP染色下胞漿呈明黃色，核呈藍(lán)色，未見(jiàn)陽(yáng)性著色，見(jiàn)圖1。

2.2 心肌缺血不同時(shí)間點(diǎn)HE染色和HBFP染色結(jié)果

家兔心肌急性缺血不同時(shí)間點(diǎn)染色結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3 急性缺血不同時(shí)間點(diǎn)家兔心肌收縮帶壞死染色

結(jié)果

家兔心肌4種CBN分類的HE染色和HBFP染色結(jié)果見(jiàn)圖2。結(jié)扎家兔冠狀動(dòng)脈20 min即可見(jiàn)CBN，為節(jié)段型；隨著缺血時(shí)間的延長(zhǎng)CBN程度加重，30 min、40 min可見(jiàn)節(jié)段型和條帶型，1 h后出現(xiàn)枝條型，6 h后壞死區(qū)域逐漸清晰，壞死周邊可見(jiàn)碎片型CBN，12 h大片凝固性壞死，可見(jiàn)少量的碎片型CBN，具體內(nèi)容見(jiàn)表2。

2.4 缺血和再灌注后的心肌形態(tài)學(xué)觀察

家兔心肌缺血和再灌注后與單獨(dú)的缺血相比，陽(yáng)性著色范圍加重，CBN類型在缺血20 min再灌注后可見(jiàn)節(jié)段型和條帶型，缺血30 min再灌注后可見(jiàn)枝條型CBN，缺血40 min再灌注后可見(jiàn)碎片型CBN，具體見(jiàn)表3。

3 討論

心肌缺血和再灌注損傷形態(tài)學(xué)改變?cè)缙诓幻黠@，主要是細(xì)胞漿的變化。本研究通過(guò)連續(xù)多點(diǎn)觀測(cè)HBFP染色的心肌細(xì)胞形態(tài)和CBN變化，發(fā)現(xiàn)HBFP染色更易于區(qū)分缺血心肌細(xì)胞，CBN的范圍和類型與心肌缺血的時(shí)間密切相關(guān)。

3.1 染色

心肌早期缺血的形態(tài)學(xué)特征主要為肌漿染色性質(zhì)異常、形態(tài)改變。在HE染色鏡下表現(xiàn)為肌原纖維不清、橫紋消失、形態(tài)不規(guī)則的顆粒、團(tuán)塊和收縮帶，核無(wú)明顯改變或僅有輕微濃縮[4-5]。而HE染色在心肌胞漿的染色區(qū)分度不高，對(duì)于判斷早期心肌細(xì)胞的損傷有一定的困難。本研究中使用HE染色證實(shí)了這一點(diǎn)，在心肌缺血早期僅可見(jiàn)嗜酸性增強(qiáng)和空泡變性。

HBFP染色法是最早應(yīng)用于顯示缺血心肌的退行性染色方法，可使缺血心肌細(xì)胞著紅色，正常心肌染為明黃色。以往研究[6]發(fā)現(xiàn)，家兔心肌缺血15 min時(shí)，HBFP染色可明確顯示缺血心肌細(xì)胞。本研究發(fā)現(xiàn)，HBFP染色10 min時(shí)在缺血區(qū)左心室心內(nèi)膜下及乳頭肌處見(jiàn)小灶狀心肌細(xì)胞陽(yáng)性著色。HBFP染色陽(yáng)性區(qū)域與HE染色中嗜酸性增強(qiáng)區(qū)域一致，紅色缺血心肌與正常黃色心肌更易于區(qū)分，尤其是對(duì)于早期的缺血心肌變化。

3.2 收縮壞死帶

收縮帶是一種特殊的組織學(xué)形式，它是過(guò)度收縮的肌原纖維碎裂成嗜酸性帶的結(jié)果，可能從幾個(gè)收縮帶到肌原纖維的全部顆粒狀破壞[7]。宋良文[3]將CBN分為4種類型，即節(jié)段型、條帶型、枝條型、碎片型。這4種分型一般隨心肌缺血時(shí)間的延長(zhǎng)而依次出現(xiàn)或同時(shí)出現(xiàn)2種形態(tài)，無(wú)嚴(yán)格界限，常混合存在，是心肌缺血逐漸發(fā)展為壞死的形態(tài)學(xué)證據(jù)[8-9]。

本研究分析發(fā)現(xiàn)，節(jié)段型主要見(jiàn)于缺血1 h內(nèi)，缺血6 h由于肌纖維損傷較重而不能攣縮形成收縮帶，易形成凝固性壞死，此時(shí)在壞死區(qū)周圍可見(jiàn)碎片型CBN。再灌注后，CBN出現(xiàn)時(shí)間提早，缺血20 min再灌注后可見(jiàn)節(jié)段型和條帶型，缺血30 min再灌注后可見(jiàn)枝條型CBN，缺血40 min再灌注后可見(jiàn)碎片型CBN。

綜上，HBFP染色更易于區(qū)分缺血心肌細(xì)胞，尤其是對(duì)于缺血非常早期的心肌染色更具優(yōu)勢(shì)。CBN是早期心肌缺血的一個(gè)明確特征，CBN的范圍和類型與心肌缺血的時(shí)間和再灌注有密切關(guān)系，可根據(jù)CBN的范圍和類型推測(cè)心肌的缺血時(shí)間。心肌缺血或再灌注后其CBN程度和類型出現(xiàn)得更早，主要?dú)w因于再灌注的最初幾分鐘心肌細(xì)胞鈣超載，加速了質(zhì)膜完整性的喪失[10]。

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（編輯：郭曉添）