胎兒生長(zhǎng)受限孕婦胎盤自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平及其臨床意義

張玉苓，張 珂，許 艇，張 慶

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450014

胎兒生長(zhǎng)受限(fetal growth restriction,FGR)是指女性在妊娠期間,腹中胎兒因各種因素生長(zhǎng)發(fā)育未達(dá)標(biāo)準(zhǔn),胎兒體質(zhì)量低于同孕齡平均體質(zhì)量的第10百分位,或低于同孕齡平均體質(zhì)量的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[1]。FGR增加了圍產(chǎn)期發(fā)病率和死亡率,其中57%不明原因的死亡認(rèn)為與FGR有關(guān)[2]。但目前臨床關(guān)于FGR的病因、病理機(jī)制,多認(rèn)為與母體宮內(nèi)環(huán)境因素異常導(dǎo)致的胎盤功能障礙有關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn),由于胎盤的功能性異常,引起滋養(yǎng)細(xì)胞自噬[4],進(jìn)而導(dǎo)致FGR,但關(guān)于滋養(yǎng)細(xì)胞自噬在FGR中具體的形成和調(diào)控機(jī)制尚無明確的報(bào)道。Beclin-1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 ligh chain 3,LC3)是自噬蛋白中類型代表,其中Beclin-1是自噬前體細(xì)胞膜合成與生長(zhǎng)的最早復(fù)合體,LC3是自噬體膜構(gòu)成的關(guān)鍵蛋白,Beclin-1和 LC3在妊娠期糖尿病患者中有較高的表達(dá),與妊娠期糖尿病患者不良妊娠結(jié)局有關(guān)[5],但Beclin-1和 LC3在FGR中的表達(dá)尚不清楚。鑒于此,本研究旨在探討胎兒FGR孕婦胎盤自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3表達(dá)水平及其臨床意義,探討自噬與FGR發(fā)病的內(nèi)在關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例來源:選取2022年8月至2023年8月于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院因FGR分娩的孕婦胎盤組織40例作為研究對(duì)象,年齡18～38歲;孕次1～3次;孕前體質(zhì)量47～68 kg;孕周37～41周。納入標(biāo)準(zhǔn):符合FGR臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],單胎、孕周明確、足月。排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重肝腎功能損傷和免疫細(xì)胞疾病;胎兒畸形;有FGR家族史和既往史。另選取同期正常分娩的孕婦胎盤組織40例為健康組,健康組病例排除內(nèi)外科疾病和產(chǎn)科并發(fā)癥。此次研究為回顧性研究,經(jīng)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理審批通過,倫理審批號(hào)(2021242)。孕婦及家屬知情同意。

1.1.2 臨床資料收集:根據(jù)本次研究目的收集孕婦臨床資料,記錄入組孕婦年齡、孕次、孕前體質(zhì)量、分娩孕周、胎盤厚度、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量等。

1.1.3 試劑(盒):RNA提取試劑盒(天根生化科技公司);GAPDH引物(寶生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 胎盤樣本的處理:所有入組孕婦均于分娩后留取胎盤組織中央組織2 cm×2 cm×2 cm組織塊,常規(guī)行0.9%氯化鈉注射液進(jìn)行漂洗,后取其中小部分行多聚甲醛灌注取材后固定12 h,蒸餾水沖洗3次后置于乙醇中,行脫水、包埋和切片處理。

1.2.2 RT-qPCR法檢測(cè)胎盤組織中Beclin-1、LC3 mRNA水平:以RNA提取試劑盒進(jìn)行RNA提取,后將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA行qRT-PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因。采用2-ΔΔCt法計(jì)算Beclin-1、LC3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。Beclin-1上游引物5′-AGTGGCGGCTCCTATTC-3′、下游引物5′-GGACACC CAAGCAAGAC-3′;LC3上游引物5′-TTCGCCGACC GCTGTAA-3′、下游引物5′-ATCCGTCTTCATCCTT CTCCT-3′。GAPDH上游引物:5′-AGTGGCAAAGTG GAGATTGTTG-3′;下游引物:5′-CAGTCTTCTGGGTG GCAGTGAT-3′。

1.2.3 免疫組化法檢測(cè)Beclin-1、LC3蛋白表達(dá):石蠟標(biāo)本切片后,甲苯脫蠟-酒精脫蠟-PBS清洗-抗原修復(fù)后,封閉。以細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色為陽性。采用免疫反應(yīng)積分法(IRS)評(píng)價(jià)染色結(jié)果,占比0～<25%、25%～<50%、50%～<75%和≥75%分別為1分～4分。陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分:無染色、淺黃色、黃褐色和棕褐色分別為0分、1分、2分和3分。IRS=陽性細(xì)胞百分比評(píng)分和陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度評(píng)分之積,以IRS≤3分為陰性,>3分為陽性。

1.2.4 觀察指標(biāo):比較FGR組與健康組一般資料、胎盤厚度、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量;比較FGR組與健康組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平和蛋白表達(dá)情況;比較胎盤組織Beclin-1、LC3陽性蛋白表達(dá)在不同資料FGR患者中差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 FGR組與健康組一般資料比較

FGR組與健康組在年齡、孕周等方面比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異(表1)。

表1 FGR組與健康組一般資料比較Table 1 Comparison of general data between FGR group and healthy n=40)

2.2 FGR組與健康組胎盤厚度、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量比較

FGR組與健康組在胎盤厚度、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量方面均有差異(P<0.05)(表2)。

表2 FGR組與健康組胎盤厚度、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量比較

2.3 FGR組與健康組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平比較

FGR組Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平均高于健康組(P<0.001)(圖1)。

FGR. fetal growth restriction; *P<0.001 compared with the healthy group.

2.4 FGR組與健康組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3陽性表達(dá)比較

FGR組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3陽性表達(dá)率均顯著高于健康組(P<0.05)(圖2,表3)。

A.Beclin-1 expression in health group; B.Beclin-1 expression in FGR group; C.LC3 expression in health group; D.LC3 expression in FGR group.

表3 FGR組與健康組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3陽性表達(dá)比較

2.5 FGR孕婦中胎盤組織Beclin-1、LC3蛋白陽性表達(dá)不同臨床資料比較

FGR孕婦中胎盤組織Beclin-1、LC3蛋白表達(dá)陽性率在胎盤厚度、胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量比較上,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);在產(chǎn)后大出血、羊水過多和胎兒窘迫比較上無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

表4 FGR孕婦中胎盤組織Beclin-1、LC3蛋白陽性表達(dá)不同臨床資料比較

3 討論

研究顯示,孕婦在妊娠期營(yíng)養(yǎng)不足,或有妊娠并發(fā)癥,是影響胎兒生長(zhǎng)的危險(xiǎn)因素[7]。本次研究結(jié)果顯示,FGR組胎盤厚度、胎盤質(zhì)量和新生兒體質(zhì)量水平均較低,與既往報(bào)道一致[8]。由于臨床對(duì)于FGR的早期監(jiān)測(cè)指標(biāo)尚無權(quán)威的研究,故有必要尋求可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

本研究發(fā)現(xiàn),FGR組Beclin-1 mRNA、LC3 mRNA水平均較高。Beclin-1蛋白作為酵母自噬基因Atg6的同源基因,Bcl-2結(jié)合部位、螺旋-螺旋結(jié)構(gòu)域和進(jìn)化保守結(jié)構(gòu)域均是其主要功能位點(diǎn)[9]。LC3是酵母菌自噬基因Ap98在哺乳動(dòng)物中的同源物[10]。在自噬體形成過程中,Beclin-1可以引導(dǎo)相關(guān)蛋白定位,同時(shí)依賴Beclin1-PI3KC3復(fù)合體參與形成自噬體,該復(fù)合體中還同時(shí)包括Atg14。自噬體雙層膜結(jié)構(gòu)的形成是Atg14與Beclin-1相互作用的結(jié)果,是自噬形成的關(guān)鍵起始階段。其中LC3是自噬體形成的生物標(biāo)志,Beclin-1則可與其他蛋白結(jié)合共同調(diào)節(jié)自噬體形成[11]。分析本研究結(jié)果變化,可能是由于胎盤自身發(fā)育異常等因素,限制了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝取和轉(zhuǎn)運(yùn),導(dǎo)致胎盤灌注不足,使滋養(yǎng)細(xì)胞及蛻膜細(xì)胞凋亡。正常的自噬可以參與細(xì)胞的增殖分化,而過度自噬會(huì)引發(fā)滋養(yǎng)細(xì)胞的內(nèi)皮功能紊亂,引發(fā)胎盤功能障礙[12]。本次研究發(fā)現(xiàn),FGR組自噬相關(guān)蛋白Beclin-1、LC3陽性表達(dá)率,及不同胎盤厚度、胎盤質(zhì)量、新生兒體質(zhì)量陽性表達(dá)率比較上均有差異。分析其機(jī)制可能是由于Beclin-1、LC3抑制了胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞增殖、侵襲,使胎盤組織被過度激活,誘導(dǎo)并促進(jìn)自噬,以此影響胎盤的發(fā)育及功能,參與FGR疾病進(jìn)展。

綜上所述,FGR孕婦胎盤組織中自噬基因Beclin-1、LC3陽性表達(dá)情況與胎兒發(fā)育水平有關(guān),臨床可以通過Beclin-1、LC3檢測(cè)為評(píng)估FGR提供一定參考。