殼寡糖上調SRBI核心巖藻糖基化修飾水平減弱小鼠動脈粥樣硬化斑塊形成

陳林木，黃云秀

中山市人民醫院 1.藥學部；2.檢驗醫學中心，廣東 中山 528403

殼寡糖(chitosan oligosaccharides,COS)由殼聚糖降解得到,分子量較小,克服了殼聚糖在人體中溶解度小的缺點[1]。前期研究發現COS能減少動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)斑塊的形成。例如下調人肝癌細胞系HepG2的前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶基因表達來增強脂滴形成[2],增強肝臟低密度脂蛋白受體、清道夫受體B類成員1(scavenger receptor class B type Ⅰ protein,SRBI)及巨噬細胞三磷酸腺苷結合盒轉運體A1表達[3]等。

糖基轉移酶在AS形成的多個階段發生變化。既往研究表明AS形成的中后期,轉錄因子HNF1α進入細胞核的減少導致巖藻糖基轉移酶8(fucosyltransferase 8,Fut8)翻譯水平降低[4],Fut8表達下調時抑制黏著斑激酶磷酸化,導致下游的F-肌動蛋白的聚合被抑制,使得泡沫細胞遷移出斑塊能力下降[5]。SRBI含有11個潛在的N鏈糖基化位點,其中兩個位點(Asn-108和Asn-173)的突變改變了其表達和功能[6]。這表明N-鏈糖基化可以影響SRBI在細胞內的脂質轉運活性。先前的研究已經證實COS通過影響SRBI的表達而減弱AS的形成,那么SRBI的糖基化修飾水平的改變是否是COS作用的靶點之一呢?

本研究擬利用動物和細胞實驗觀察SRBI糖基化修飾位點在COS影響泡沫細胞脂質外排中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細胞:SPF級ApoE-/-小鼠40只,約6周齡,體質量18～25 g(北京華富康生物科技有限公司)。小鼠巨噬細胞系Raw264.7(中科院上海細胞庫)。

1.1.2 主要試劑:殼寡糖(中國科學院大連化學物理研究所提供,聚合度2～8,脫乙酰度>88%,平均分子量<1 000 Da);高脂飼料(江蘇美迪森生物醫藥有限公司);裂解液(北京康為世紀生物科技有限公司);油紅O染色液(北京索萊寶科技有限公司);ELISA試劑盒(上海江萊生物科技有限公司);RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司);SYBR Premix Ex TaqTMⅠ PCR定量試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司);反轉錄試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司);膽固醇酯外流試劑盒(Abcam公司);游離膽固醇酯測定試劑盒(北京普利萊基因技術有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動脈粥樣硬化模型的建立:小鼠飼養在晝夜交替的照明條件下,進食和飲水不受限制。隨機分為對照組(n=20, control group)和殼寡糖組(n=20, COS group)。對照組飼喂高脂飼料12周,COS組飼喂高脂飼料和殼寡糖(每天灌胃,500 mg/kg)12周[7]。記錄實驗期間的兩組小鼠體質量、攝食量等基本信息。實驗結束后,處死小鼠,采集小鼠血清和臟器。樣品保存在-80 ℃冰箱中或用4%多聚甲醛溶液固定。本方案經中山市人民醫院倫理委員會批準(批準號:K2020-19)。

1.2.2 器官功能指標和血清脂質水平的檢測:采用戊巴比妥腹腔注射麻醉ApoE-/-小鼠。經眼眶采血后離心分離血清。兩組小鼠的總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein-cholesterol,LDL-C),甘油三酯(triglyceride,TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-cholesterol,HDL-C)、載脂蛋白A-Ⅰ(apolipoprotein A-I,ApoA1)、載脂蛋白B100(apolipoprotein B100,ApoB100)、血糖(glucose,Glu)、谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase,AST)、谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)均采用實驗室全自動生化分析儀檢測。

1.2.3 酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測血清蛋白表達:ELISA的操作步驟按照試劑供應商的說明書進行。

1.2.4 Western blot檢測蛋白質表達:各組隨機選取3只小鼠的主動脈組織(約30 mg),用裂解液300 mL提取總蛋白質。用BCA蛋白質測定試劑盒測定樣品的蛋白質濃度。后續步驟參考文獻[8]。

1.2.5 RT-qPCR檢測mRNA表達水平:采用超純RNA試劑盒提取組織總RNA。PrimeScriptTMRT試劑盒反轉錄總RNA(1 μg)。iCycleriQ用于SYBR Premix Ex TaqTMⅡ實時PCR檢測系統。詳細的RT-qPCR程序參考論文[8]。使用以下引物擴增目的基因:SRBI: 5′-GGCTGCTGTTTG CTGCG-3′(F)和5′-GCTGCTTGATGAGGGAGGG-3′(R); β-actin:5′-AAGACCTCTATGCCAAC AC-3′(F)和5′-CTGCTTGCTGATCCACAT -3′(R)。

1.2.6 熒光法測定膽固醇含量:使用膽固醇外排試劑盒評估膽固醇外排情況,參考制造商的方案和先前研究[9]。膽固醇流出率(%)=[上清液熒光強度/(上清液熒光強度+細胞沉淀熒光強度]×100%。

1.2.7 酶法檢測血清總膽固醇和游離膽固醇:膽固醇酯測定詳細的實驗程序按照已發表文章[10]。膽固醇酯(cholesteryl ester,CE)=總膽固醇(total cholesterol,TC)-游離膽固醇(free cholesterol, FC)。

1.2.8 凝集素芯片檢測凝集素水平:小鼠主動脈樣品送到上海華盈生物有限公司進行實驗。根據Raybiotech的標準操作程序,使用Raybiotech試劑盒進行實驗。

1.2.9 液相色譜-串聯質譜技術檢測兩組血清糖蛋白變化:小鼠血清樣品送到北京百派泰克生物科技有限公司進行實驗。主要實驗步驟如下:BCA蛋白提取和蛋白濃縮;瓊脂糖結合小扁豆凝集素(lens culinaris agglutinin,LCA)下拉試驗;胰蛋白酶消化蛋白質;納米液相色譜-串聯質譜聯用技術分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 COS對小鼠基礎數據的影響

COS可以顯著降低小鼠體質量和食物攝入量(P<0.05)。給藥后,COS組小鼠肝臟質量明顯低于對照組(P<0.01)(表1)。COS對臟器功能指標(AST、ALT、ALP、BUN、Cr、Glu、CK、LDH)無明顯影響。

表1 COS對小鼠基礎數據的影響Table 1 Effects of COS on basic data in n=20)

2.2 COS減弱AS斑塊的形成

COS治療后, TC(圖1A)、LDL-C(圖1C)水平明顯降低(P<0.05),TG(圖1B)、HDL-C(圖1D)、ApoA1(圖1E)、ApoB100(圖1F)水平變化不明顯。COS組內膜厚度比對照組明顯變薄(P<0.05)(圖1G),油紅O染色結果顯示,COS組主動脈瓣脂質沉積明顯減少(P<0.05)(圖1H)。

A-F.comparison of serum TC, TG, LDL-C, HDL-C, ApoA1 and ApoB100 levels between two groups of mice; G.comparison of aortic intima thickness between the two groups(×40); H.comparison of aortic fat deposition between two groups of mice(×40); TC.total cholesterol; TG.triglyceride; LDL-C.low density lipoprotein-cholesterol; HDL-C.high density lipoprotein-cholesterol; ApoA1.apolipoprotein A-I; ApoB100.apolipoprotein B100;*P<0.05 compared with control group.

2.3 COS促進核心巖藻糖基化的表達

采用凝集素芯片法檢測COS處理后主動脈組織中凝集素的變化(圖2A)。多種凝集素發生顯著變化,如橙黃網胞盤菌凝集素(aleuria aurantia lectin,AAL)、大蒜凝集素(allium sativum lectin,ASA)(圖2B)。ELISA結果顯示,AAL(示總巖藻糖基化)和LCA (示核心巖藻糖基化)的表達明顯上調(圖2C和D)(P<0.05),而翅莢百脈根凝集素(lotus tetragonolobus lectin,LTL)(示α1,3/4-巖藻糖基化)的表達無明顯變化(圖2E)。懷槐凝集素Ⅰ(maa-ckia amurensis lectin Ⅰ,MAL Ⅰ)(示α 2,3 -唾液酰化)的表達明顯下調(圖2F)(P<0.05),而黑松凝集素(sambucus nigra lectin,SNA)(示α 2,6 -唾液酰化)的表達沒有明顯變化(圖2G)。ELISA結果也顯示Fut8蛋白含量明顯上調(P<0.05)(圖2H)。

A.schematic diagram of lectin chip; B.heat map results of lectin chip; C-H.the expression of AAL, LCA, LTL,MAL Ⅰ, SNA and Fut8 were detected by ELISA in the two groups; AAL.aleuria aurantia lectin; LCA.lens culinaris agglutinin; LTL.lotus tetragonolobus lectin; MAL Ⅰ.maackia amurensis lectin I; SNA.sambucus nigra lectin; *P<0.05 compared with control group.

2.4 SRBI作為LCA結合蛋白在COS組的表達顯著降低

在高爾基網或內質網中,糖基轉移酶將糖鏈添加到下游靶蛋白上從而影響其功能。從COS組和對照組中各隨機抽取4個樣本行LCA pull-down和Western blot實驗。結果顯示,分子量位于80～90 ku之間的蛋白在兩組間有明顯差異。對該部分條帶進行質譜分析,共鑒定出389個蛋白和4 556個多肽。在相互作用蛋白的篩選過程中,以P<0.05和fold changes ≥ 5為篩選標準。篩選到beta-2-glycoprotein 1(圖3A)、serum amyloid A-2 protein(圖3B)、sathepsin G (圖3C)、scavenger receptor class B member 1(SRB1)(圖3D)共4個相互作用蛋白。已有研究證實,清道夫受體B類成員1(SRBI)是一種重要的脂質外排受體,與泡沫細胞的形成密切相關。COS組主動脈SRBI蛋白(圖3E)和mRNA表達量(圖3F)顯著上調(P<0.05)。

A-D.relative expression levels of serum beta-2-glycoprotein, serum amyloid A-2 protein,serum cathepsin G, scavenger receptor class B member 1 in two groups; E.protein expression of scavenger receptor class B member 1 in aorta in two groups; F.mRNA expression in aorta of scavenger receptor class B member 1 in two groups; *P<0.05 compared with control group.

2.5 SRBI糖基化修飾減弱了COS促進膽固醇外排的作用

SRBI是一種重要的膽固醇外排受體,因此,從脂質外排角度探討COS的作用。300 μg/mL COS處理RAW264.7細胞24 h,細胞活力明顯下降(P<0.05)(圖4A)。200 μg/mL COS處理RAW264.7細胞48 h,細胞活力明顯下降(P<0.05)(圖4B)。因此,200 μg/mL COS處理細胞 24 h為后續處理條件。膽固醇酯流出實驗表明,50 μg/mL ox-LDL處理RAW264.7細胞24 h導致膽固醇酯外流明顯減少(P<0.05)。同步添加COS后升高了膽固醇流出比例,且隨濃度的增加而增加(圖4C)。細胞內游離膽固醇酯測定結果顯示,50 μg/mL ox-LDL處理RAW264.7細胞24 h 后,細胞內CE/TC明顯升高。200 μg/mL COS可使CE/TC降低至50%以下(圖4D)。為驗證SRBI作用, 通過siRNA敲低SRBI的表達(圖4E)。SRBI表達降低會抑制COS的促膽固醇外排作用(圖4F),導致細胞內游離膽固醇酯(cholesterol ester,CE)的比例顯著增加(P<0.05)(圖4G)。進一步探討SRBI糖基化對其功能的影響,構建了SRBI N108糖基化突變載體并轉染細胞。通過IP實驗沉淀SRBI后,Western blot實驗顯示LCA和AAL的表達水平明顯降低(P<0.05)(圖4H)。當突變的SRBI和COS共同處理細胞時,膽固醇流出減弱(圖4I),細胞內游離膽固醇酯的比例顯著增加(P<0.05)(圖4J)。

A.effects of different concentrations of COS on cell viability; B.effects of different COS treat-time on cell viability; C.effect of COS on cholesterol efflux of RAW264.7 cells; D.effects of COS on CE/TC of RAW264.7 cells; E.expression of SRBI after siRNA interference was verified by Western blot; F.effect of SRBI interference on cholesterol efflux of RAW264.7 cells; G.effects of SRBI interference on CE/TC of RAW264.7 cells; H.glycosylation level of mutant SRBI was detected by Western blot;I.effect of mutated SRBI on cholesterol efflux in RAW264.7 cells; J.effect of mutated SRBI on CE/TC in RAW264.7 cells;*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with ox-LDL group.

3 討論

殼寡糖是殼聚糖的部分水解產物,它保留了殼聚糖的可生物降解性、相容性和無毒性等特點。由于分子量小,其水溶性和抗氧化性能優于殼聚糖[1]。許多研究表明,COS可以顯著緩解動脈粥樣硬化的發生和發展。本文實驗結果顯示COS能顯著降低TC和LDL-C,說明COS主要通過降低膽固醇抑制ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化的形成。然而沒有觀察到兩組小鼠間HDL-C的變化,這與以往報道殼寡糖能夠升高大鼠血漿中HDL-C的實驗結果不同[11]。這種差異可能與脂蛋白組成和代謝的復雜性以及物種不同有關。

糖基化修飾是蛋白質翻譯后修飾的重要方法之一[12]。在AS早期,當血液中的單核細胞粘附在內皮細胞上并進一步穿透TNF-α誘導的內皮損傷時,COS可通過O-氨基葡萄糖轉移酶與n-乙酰基連接,調節EA hy926細胞中白介素-6和白介素-8的表達[13]。在AS形成的中后期,形成的泡沫細胞的運動能力明顯減弱,停留在斑塊內,引起炎性反應擴大[14]。本文實驗表明COS處理后血清中幾種凝集素發生了變化,包括AAL、LCA和MAL I等。基于前期實驗基礎,本研究重點關注Fut8和對應凝集素LCA的在COS影響斑塊形成中的重要作用。結合以往文獻,后續實驗將進一步探討其他凝集素和相應的糖基轉移酶在該過程中的作用。

SRBI是一種重要的脂質外排受體,與三磷酸腺苷結合盒轉運體 A1、三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G1共同介導細胞內脂質平衡。實驗表明,SRBI在COS處理后顯著上調,是一種LCA凝集素結合蛋白。雖然COS處理后SRBI的表達大幅增加,但膽固醇流出水平和細胞內膽固醇酯水平仍未恢復到空白對照組水平,這可能與白細胞分化抗原36表達部分增加有關。另外,siRNA降低SRBI表達后,COS的作用明顯減弱,說明SRBI是COS發揮抗AS作用的必要因素之一。通過構建SRBI糖基化位點突變載體,本研究發現SRBI糖基化修飾單位點突變對膽固醇流出的影響低于SRBI表達的變化。由于存在多個可能的糖基化修飾位點,雖然選擇了對其功能影響最大的位點,但其他位點仍然發揮了作用。后續的實驗將進行多位點突變實驗,觀察糖基化修飾對SRBI功能的完整機制。

綜上所述,本研究結果表明,用中等濃度的COS治療ApoE-/-小鼠,可以顯著減弱AS斑塊的形成。SRBI表達和糖基化水平的升高可能是脂質外排的重要機制之一。