咪達唑侖減輕氧糖剝奪/復糖復氧誘導的小鼠神經元損傷

陳 濤，陳凌君*，李 媛

1.永州市中心醫院冷水灘院區 麻醉科，湖南 永州 425000；2.海南醫學院第一附屬醫院 麻醉科，海南 海口 570105

缺血性腦血管病主要指腦組織供血中斷或不足引起神經系統疾病[1]。目前,尚無有效治療措施,因此開發有效的藥物用于神經保護具有重要意義。咪達唑侖(midazolam)是γ氨基丁酸受體激動劑,具有抗焦慮、抗驚厥等作用[2]。研究表明咪達唑侖可以促進缺氧復氧誘導的大鼠海馬神經元增殖并降低細胞凋亡,實現對海馬神經元的保護作用[3]。研究表明,CREB/PGC-1α信號通路在細胞代謝過程中扮演著重要角色[4]。研究顯示激活CREB/PGC-1α信號通路減少腦組織線粒體損傷導致的氧化應激,減少氧自由基對機體的進一步損傷[5]。咪達唑侖是否可以調控CREB/PGC-1α信號通路來降低氧糖剝奪/復糖復氧(oxygen glucose deprivation/restoration,OGD/R)誘的神經損傷還不清楚。因此本研究以HT22細胞為研究對象,探究咪達唑侖對OGD/R誘導的HT22細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑

小鼠神經元細胞系HT22(智立中特生物科技有限公司)。

DMEM培養基(上海圻明生物科技有限公司);咪達唑侖(恒瑞醫藥有限公司);CREB抑制劑KG-501(Med Chem Express公司);MTT試劑盒(上海海方生物技術有限公司);Edu試劑(深圳海思安生物技術有限公司);Trizol試劑(廣州威佳科技有限公司);總RNA提取試劑盒(上海卡邁舒生物科技有限公司);蛋白提取試劑盒(鄭州隆之鼎商貿有限公司);TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒(上海瑞楚生物科技有限公司);RT-qPCR試劑盒(北京博邁德生物科技有限公司);胰蛋白酶(北京緣生化科技有限公司);Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α一抗及二抗(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組與處理:將細胞分為對照組,氧糖剝奪4 h后復糖復氧培養24 h為OGD/R組[6],3、6、12 μmol/mL咪達唑侖[3]、12 μmol/mL咪達唑侖+25 μmol/L的KG-501[7]干預OGD/R細胞為咪達唑侖低、中、高劑量組和咪達唑侖高劑量+KG-501組。對照組和OGD/R組不添加藥物處理。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖:收集各處理組HT22細胞接種于96孔板中培養。在培養24 h和48 h時,向每孔中加入MTT溶液,繼續培養4 h,再加入二甲基亞砜,避光震蕩溶解后,用酶標儀檢測各孔吸光值(A490)。

1.2.3 Edu染色檢測細胞增殖:將上述各組HT22細胞以5×104個/孔接種到24孔板中。無菌培養36 h,然后向每孔中加入適量Edu孵育2 h,按照Edu-555細胞增殖檢測試劑盒說明書進行Edu及DAPI染色,隨后以熒光顯微鏡采集各組細胞圖像,采用Image J軟件定量各組Edu陽性細胞數及總細胞數,計算各組細胞增殖率,公式為:增殖率=Edu陽性細胞數/總細胞數×100%。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡:取各組HT22細胞,用PBS清洗,加入500 μL結合緩沖液沉淀細胞并收集,然后加入annexin V-FITC與PI試劑,室溫避光反應15 min,上樣用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.5 ELISA檢測TNF-α、IL-6含量:離心收集各組細胞培養基上清液,按照ELISA試劑盒說明書進行操作檢測相關指標。

1.2.6 試劑盒檢測SOD、CAT、MDA:用裂解液裂解各分組HT22細胞,按照試劑盒說明書檢測相關指標。

1.2.7 RT-qPCR檢測CREBmRNA和PGC-1αmRNA表達水平:收集各分組HT22細胞,提取細胞總RNA,將RNA反轉錄為cDNA,熒光定量PCR擴增cDNA。以GAPDH為內參,使用2-ΔΔCt方法計算CREBmRNA和PGC-1αmRNA的相對表達量。引物:CREBmRNA:正向5′-ATGTGCCCATGTCGGAT TATC-3′;反向:5′-GAGGAAGCGACAAGTGTG-3′;PGC-1αmRNA:正向:5′-CGGCAACCTCTTCAGAA CG-3′;反向:5′-CTCAGTTGGAAGGTACCGCG-3′;GAPDH:正向:5′-CCGCACAGCGACTCGCCTTT-3′;反向:5′-AGACAAGACGACGCCGGTT-3′。

1.2.8 Western blot檢測Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α的蛋白表達量:用蛋白裂解液裂解各處理組HT22細胞并提取細胞總蛋白,檢測細胞中蛋白含量,電泳進行蛋白分離,轉膜,于5%的脫脂奶粉封閉液中封閉;加入Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α(稀釋1∶1 500)一抗4 ℃搖床過夜,洗膜后再分別加入二抗(稀釋1∶5 000)常溫下孵育2 h,加入ECL發光液顯影,用Image-Pro Plus進行定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 咪達唑侖對HT22細胞增殖能力的影響

與對照組相比,OGD/R組細胞A490值(24、48 h),細胞增殖率顯著性降低(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達唑侖低、中、高劑量組細胞A490值(24、48 h),細胞增殖率顯著性升高,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達唑侖高劑量組相比,咪達唑侖高劑量+KG-501組A490值(24、48 h),細胞增殖率顯著性降低(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the midazolam high dose group.

2.2 各分組HT22細胞凋亡率比較

與對照組相比,OGD/R組細胞凋亡率顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達唑侖低、中、高劑量組細胞凋亡率顯著性降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達唑侖高劑量組相比,咪達唑侖高劑量+KG-501組凋亡率顯著性升高(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the midazolam high dose group.

2.3 各分組細胞炎性因子TNF-α、IL-6水平比較

與對照組相比,OGD/R組細胞炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達唑侖低、中、高劑量組細胞炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著性降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達唑侖高劑量組相比,咪達唑侖高劑量+KG-501組細胞炎性因子TNF-α、IL-6水平顯著性升高(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the midazolam high dose group.

2.4 各分組HT22細胞SOD、CAT、MDA水平比較

與對照組相比,OGD/R組細胞SOD、CAT活性顯著性降低,MDA含量顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達唑侖低、中、高劑量組細胞SOD、CAT活性顯著性升高,MDA含量顯著性降低,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達唑侖高劑量組相比,咪達唑侖高劑量+KG-501組細胞SOD、CAT活性顯著性降低,MDA含量顯著性升高(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the Midazolam high dose group.

2.5 各分組HT22細胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達水平比較

與對照組相比,OGD/R組細胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達水平顯著性降低(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達唑侖低、中、高劑量組細胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達水平顯著性升高,呈劑量依賴性(P<0.05);與咪達唑侖高劑量組相比,咪達唑侖高劑量+KG-501組細胞CREB mRNA和PGC-1α mRNA表達水平顯著性降低(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with the control group; #P<0.05 compared with the OGD/R; △P<0.05 compared with the Midazolam high dose group.

2.6 各分組HT22細胞Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α蛋白表達比較

與對照組相比,OGD/R組細胞Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表達水平顯著性降低,Bax蛋白表達顯著性升高(P<0.05);與OGD/R組相比,咪達唑侖低、中、高劑量組細胞Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表達水平顯著性升高,Bax蛋白表達顯著性降低,(P<0.05);與咪達唑侖高劑量組相比,咪達唑侖高劑量+KG-501組細胞Ki-67、Bcl-2、CREB、PGC-1α蛋白表達水平顯著性降低,Bax蛋白表達顯著性升高(P<0.05)(圖6,7)。

A.control; B.OGD/R; C.midazolam low dose group; D.midazolam medium dose group; E.midazolam high-dose group; F.midazolam high dose +KG-501 group.

圖7 不同劑量咪達唑侖處理的HT22細胞Ki-67、Bcl-2、Bax、CREB、PGC-1α蛋白表達比較

3 討論

當大腦缺血缺氧時,腦組織出現代謝功能障礙,誘發神經細胞壞死和凋亡,最后導致神經功能障礙,嚴重者引起死亡,稱之為缺血性卒中,其死亡率約占所有卒中87%[8]。該疾病是由多種病理過程共同作用的結果,研究表明,氧化應激和細胞凋亡在腦組織損傷中發揮重要作用,減小氧化應激和腦組織細胞凋亡成為研究重點[9]。本研究顯示,OGD/R對HT22細胞造成一定損傷。

CREB是一種轉錄因子,參與許多生理過程,如增殖、分化、調節炎癥等。CREB是調節PGC-1α表達的重要轉錄因子,而PGC-1α是一種轉錄共激活劑,可募集核受體或轉錄因子,并調節細胞核和線粒體中下游基因的轉錄。還可獨立對抗ROS的產生,抑制NF-κB的途徑,從而減少炎性的發生[14]。有研究表明腦活素可以激活CREB/PGC-1α信號通路減少神經炎來改善腦缺血損傷[14]。羅氟酞普蘭通過激活CREB/PGC-1α信號通路來降低PD模型中神經細胞的炎性反應和細胞凋亡,從而改善神經細胞功能[15]。本實驗研究結果顯示,OGD/R可抑制HT22細胞中CREB和PGC-1α基因和蛋白表達。咪達唑侖干預可提高CREB和PGC-1α基因和蛋白表達。為驗證該結論,在咪達唑侖干預基礎上,添加KG-501處理,結果發現,KG-501可部分逆轉咪達唑侖對OGD/R誘導HT22細胞的治療作用。提示KG-501可減弱咪達唑侖對神經細胞的保護作用,加重細胞凋亡和損傷。

綜上所述,咪達唑侖可減輕細胞炎性反應和氧化應激,降低細胞凋亡,促進細胞增殖,從而減輕OGD/R誘導的神經細胞損傷。本研究僅在細胞水平進行探究,后續還需進行動物實驗驗證。