羧胺三唑乳清酸鹽對人胰腺癌細胞系增殖及脂肪酸合成代謝的影響

郭泓江，徐也婷，張迪雅，仇佳星，王鈺鋮，鞠 瑞，郭 磊

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 藥理學系，北京 100005

胰腺癌(pancreatic cancer, PC)是全球癌死亡的主要原因,根據美國癌協會發布數據,胰腺癌5年生存率僅有12%,并且其發病率仍以每年1%的速度增加,預計2040年將成為美國癌死亡的第2大原因[1-2]。中國國家癌中心2023年報告顯示,胰腺癌位居中國癌致死率第6位,其中胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)是最常見的胰腺癌類型。手術切除是胰腺癌最有效的治療手段,但由于起病隱匿,缺乏早期篩查方法,多數患者被診斷為晚期或轉移性疾病,無法進行手術切除,因此幾乎所有患者都需接受輔助化學治療[3]。然而耐藥性的出現嚴重限制了化學治療有效性。快速增殖的癌細胞需要足夠的脂肪酸來支持膜和信號分子的生物合成,脂質代謝功能對于PDAC進展及耐藥表型產生尤為重要。因此,探索干預脂質代謝的新方法對突破胰腺癌治療有重要意義。

羧胺三唑(carboxyamidotriazole,CAI)是一種非細胞毒類小分子化合物,通過抑制腫瘤細胞線粒體電子傳遞鏈復合物Ⅰ阻斷氧化呼吸,在多種癌模型中具有顯著的抗腫瘤活性[4]。近年來,不斷有證據發現CAI具有代謝調節劑的作用,通過激發腫瘤細胞谷氨酰胺代謝依賴性,使得CAI聯合谷氨酰胺代謝抑制劑策略在腫瘤治療中取得顯著療效[5]。其乳清酸鹽形式羧胺三唑乳清酸鹽(carboxyamidotriazole-orotate, CTO)可進一步降低口服毒性并提高生物利用度。在缺氧或營養匱乏的微環境中,腫瘤細胞將改變其代謝模式以維持增殖,其中谷氨酰胺可以作為替代碳源,通過還原羧化作用優先供應脂肪酸的生成[6]。然而,CTO對胰腺癌細胞脂肪酸代謝的影響尚不明確。本研究旨在探索CTO對不同化療敏感性胰腺癌細胞增殖的影響,并初步探究CTO誘導胰腺癌細胞脂質合成代謝重編程的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系:人胰腺癌細胞系AsPC-1、PANC-1、MiaPaCa-2(國家生物醫學實驗細胞資源庫)、人胰腺癌細胞吉西他濱(gemcitabine, GEM)耐藥株AsPC-1/GEM(武漢普諾賽生命科技有限公司,以下簡稱AR細胞)。

1.1.2 藥品與試劑:羧胺三唑乳清酸鹽(MCE公司);DMEM高糖培養基、0.25%胰蛋白酶(國家生物醫學實驗細胞資源庫);XF Long Chain Fatty Acid Oxidation Stress Test Kit(Agilent 公司);DMSO(JiSiEnBei公司);甲醇(國藥集團化學試劑有限公司);青霉素-鏈霉素混合液,胎牛血清、磺酰羅丹明B(sulfoehodamine,SRB)細胞增殖和毒性檢測試劑盒、BCA蛋白質定量檢測試劑盒(翌圣生物科技有限公司);RIPA裂解液、PMSF(北京索萊寶科技有限公司);總RNA提取試劑、Evo M-MLV 反轉錄試劑預混液(湖南艾科瑞生物工程有限公司);PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(Thermo Fisher公司);兔抗ACC、p-ACC、AMPK、p-AMPK抗體(CST公司);兔抗c-Myc抗體(Proteintech公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的分組及處理:AsPC-1、PANC-1、MiaPaCa-2、AR細胞在含有10%FBS的DMEM高糖培養基中培養。取對數增殖期的細胞,分組為:對照組(control組);給藥組(CTO組),用DMSO將CTO配置為20 mmol/L母液,后用DMEM培養基稀釋為20 μmol/L工作液處理細胞。

1.2.2 細胞增殖實驗:使用sulforhodamine B (SRB)法檢測細胞存活情況。SRB實驗按照標準程序進行,將細胞以每孔1×104個細胞接種于96孔板中,分組,給藥組以20 μmol/L CTO培養48及72 h,每孔加入200 μL DMEM培養。隨后按SRB檢測試劑盒說明書進行固定及染色。在515 nm波長處測量吸光度,并依據吸光度計算細胞活率。計算公式為細胞活率=(Asample-Ablk)/(Acon-Ablk)×100%。

1.2.3 RT-qPCR檢測胰腺癌細胞系中脂肪酸合成關鍵基因mRNA轉錄水平:取對數生長期的各株胰腺癌細胞按照每皿1×106個細胞接種于6 cm培養皿中,過夜貼壁后給藥,48 h后使用Trizol提取總RNA,反轉錄為cDNA后使用SYBR Green Master Mix在CFX96 Touch Real Time PCR系統進行檢測。所有樣品均單獨歸一化為β-actin。引物序列如表1所示。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.2.4 Western blot檢測細胞AMPK/ACC通路相關蛋白表達:取對數增殖期的各株胰腺癌細胞按照每皿5×105個細胞接種于6 cm培養皿中,過夜貼壁后給藥,48 h后提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度后取30 μg蛋白進行上樣、電泳、轉膜反應,加入一抗AMPK、p-AMPK、ACC、p-ACC、c-Myc抗體及內參抗體β-actin(1∶1 000),4 ℃孵育過夜,然后與HRP標記的山羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育2 h。使用增強型化學發光液顯影,用Image J軟件分析吸光度值。

1.2.5 靶向代謝組學分析:接種4×106個AsPC-1/GEM細胞于10 cm培養皿中。給藥培養48 h后收樣,樣品置干冰上,按照每1×106個細胞加入40 μL預冷的80%(v/v)甲醇水直接萃取代謝物,并用細胞刮刀刮下,轉至離心管,然后在15 000 r/min,4 ℃下離心30 min。重復上述離心過程2次后,將50 μL上清液轉移至新的潔凈液相小瓶中,用于后續的液相-質譜分析。對對照組和CTO組進行差異代謝物分析[log2(fold change)≥1]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 CTO顯著降低胰腺癌細胞系的生存率

與對照組相比,AsPC-1、AR、PANC-1、MiaPaCa-2四株人胰腺癌細胞在20 μmol/L CTO作用48 h及72 h后,細胞生存率顯著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖1)。

A.survival rate of AsPC-1,AR,PANC-1 and MiaPaCa-2 cells after being treated with CTO for 48 hours; B.survival rate of AsPC-1,AR,PANC-1 and MiaPaCa-2 cells after being treated with CTO for 72 hours; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control.

2.2 CTO降低AR細胞中脂肪酸代謝物的含量

與對照組相比,AR細胞CTO給藥組有26個脂肪酸代謝物產生顯著變化,其中22個代謝物質的含量顯著減少(P<0.05)。各組AR細胞脂肪酸代謝組學聚類熱圖見圖2。

The bottom showed the numbers of the samples in the control group and the CTO group, from left to right, there were 4 control groups and 4 CTO groups; the right side represented the name of 26 lipid metabolites with significant differences(P<0.05), the color of the thermal aggregation graph indicated the amount of metabolites in the sample, where the expression level from red to blue gradually decreased; the cluster tree was located on the left side of the picture, and 26 lipid metabolites were clustered.

2.3 CTO對AMPK/ACC通路的影響

與對照組相比,4株胰腺癌細胞在CTO作用后腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)、乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxy-lase, ACC)蛋白表達均顯著降低,而p-AMPK、p-ACC蛋白表達顯著增加(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖3)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control.

2.4 CTO下調胰腺癌細胞中脂肪酸合成關鍵基因的轉錄水平

與對照組相比,CTO給藥組的4株胰腺癌細胞內脂肪酸合成關鍵基因SREBF1、FASN、ACACA、ACLY的mRNA水平均顯著降低(P<0.05,P<0.01,P<0.001)(圖4)。

*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control.

2.5 CTO抑制胰腺癌細胞中c-Myc的表達

與對照組相比,CTO給藥組4株胰腺癌細胞中c-Myc蛋白表達均顯著降低(P<0.05,P<0.01)(圖5)。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control.

3 討論

“代謝重編程”是腫瘤的標志之一,在腫瘤微環境中,腫瘤細胞會啟動特定的能量代謝途徑,以滿足增殖的需求[7]。胰腺癌具有廣泛的代謝異質性,改善代謝不僅影響胰腺癌細胞的存活,靶向代謝特征進行干預可能是一種行之有效的治療耐藥的方式[8]。 脂質代謝是腫瘤代謝重編程的重要途徑, 脂肪酸是細胞能量儲存、信號分子生成和膜增殖所必需的物質[9]。腫瘤的高脂肪酸氧化水平可以代償性增加細胞ATP和NADPH,與化療耐藥密切相關[10]。因此,脂肪酸代謝從多個方面影響癌細胞的生物學性質。

腫瘤細胞傾向于增加內源性脂質的從頭合成,這種異常的脂肪酸和膽固醇的生物合成為腫瘤細胞高度增殖和不斷適應不利微環境(如缺氧和營養匱乏)提供了持續的養料。乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)是脂肪酸合成途徑的限速酶,主要由ACACA基因編碼,同時是 AMPK 的下游調控因子。AMPK 可通過將 ACC磷酸化而使得ACC 活性喪失,進而控制脂肪酸的生成,對下游脂肪酸代謝產生重要影響[11]。在三羧酸循環過程中,細胞通過ATP檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase, ACLY)催化檸檬酸產生乙酰輔酶A,后者經由ACC催化生成丙二酰輔酶A,然后通過脂肪酸合成酶(fatty acid synthase, FASN)進一步合成細胞增殖所需的各種脂肪酸。FASN也是脂肪酸合成的關鍵酶之一,其過表達通常與癌進展緊密相關[12]。

前期研究證明,羧胺三唑可通過抑制細胞線粒體呼吸,減少細胞ATP的產生,影響能量感應分子AMPK的活性和表達,進而誘發腫瘤細胞的代謝重編程[4]。本研究旨在進一步探索CTO對多株胰腺癌的抗腫瘤作用,并探究其調控腫瘤細胞脂肪酸合成的機制,為尋找新的靶向代謝療法及聯合用藥策略提供理論基礎。

本研究證實,無論是否為化療藥敏感或耐藥的胰腺癌細胞,CTO均發揮顯著抑制其增殖的作用;CTO作為代謝調節劑,通過抑制癌基因c-Myc蛋白表達,調控AMPK/ACC通路,下調脂肪酸合成路徑的基因表達,進而抑制細胞脂肪酸合成能力。這種作用可能是CTO抑制PDAC細胞增殖的重要機制之一。膽固醇調節元件結合蛋白(sterol regulatory element-binding proteins,SREBPs)是脂類代謝物合成的主要轉錄調控因子,通過調控FASN以及ACC等基因表達調節脂肪酸的合成。癌基因c-Myc可SREBPs協同調節脂質生成,從而影響腫瘤細胞的增殖[13-14]。本研究初步證實CTO可以下調4株人胰腺癌細胞中c-Myc的蛋白表達,同時證明CTO顯著下調細胞內SREBF1等脂肪酸合成相關基因的轉錄水平,但是對于CTO調控c-Myc表達的機制以及c-Myc下游調控位點的探討仍然較淺,將在日后進一步完善CTO對胰腺癌細胞c-Myc調控與脂肪酸代謝之間關聯的機制探索。