咖啡因對大鼠成骨細胞活性及DNA甲基化水平的影響*

黃徐, 陳永福, 楊晶晶, 尹從玉, 潘雪莉*

(貴州醫科大學 公共衛生與健康學院 &環境污染與疾病監控教育部重點實驗室, 貴州 貴陽 550025)

咖啡因是一種植物生物堿,常見來源包括咖啡、茶、可樂果及可可豆等[1],是一種中樞神經系統的興奮劑,具有減輕疲勞、提神醒腦的功效。中國是世界上咖啡新興消費國之一,消費量年增長率超過20%,因此咖啡因對健康的影響也受到越來越多的關注[2-5]。有研究報道過量攝入咖啡因,會增加髖部骨折和骨質疏松癥的患病風險[6]。骨代謝終身都在進行,需一系列細胞的參與,主要包括成骨細胞和破骨細胞[7]。成骨細胞來源于骨髓間充質干細胞,能夠特異性分泌多種生物活性物質,促進骨基質形成和骨組織的礦化[8]。研究表明不同劑量的咖啡因會對成骨細胞活力產生不同的影響[9],但具體機制研究較少。DNA甲基化是以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體,使胞嘧啶5位碳原子甲基化為5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)的過程[10]。DNA甲基化受DNA甲基轉移酶(DNA methytransferase,DNMTs)和甲基胞嘧啶雙加氧酶(tet methylcytosine dioxygenase ,TETs)的調控,DNMT1主要參與DNA甲基化模式的維持,而TET2作為調控DNA去甲基化的關鍵酶負責5-mC氧化為5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyl cytosine,5-hmC)[11]。研究發現,DNA甲基化參與成骨細胞生長、成熟和分化[12-13]。有研究報道,小鼠產前攝入咖啡因增加了胎兒腎上腺組織中類固醇生成因子1的甲基化水平,出現不利于小鼠骨骼生長的情況[14];高劑量咖啡因暴露也與人類骨髓間充質干細胞中DNA甲基化的降低存在相關性[15];但咖啡因對成骨細胞整體DNA甲基化和去甲基化的影響未見報道。為此,本研究以大鼠原代成骨細胞作為研究對象,檢測不同濃度咖啡因處理后大鼠成骨細胞活性,觀察DNMT1及TET2蛋白表達、5-mC及5-hmC含量,觀察咖啡因對大鼠成骨細胞整體DNA甲基化和羥甲基化的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1動物及細胞來源 無特定病原體(specific pathogen free, SPF)級健康SD大鼠,購自長沙市天勤生物技術有限公司,動物合格證編號[SCXK(湘)2019-0014];SD大鼠交配獲得新生72 h內乳鼠,取乳鼠顱蓋骨提取原代成骨細胞。本實驗經貴州醫科大學實驗動物倫理委員會批準(批準號N2200376),實驗操作符合貴州醫科大學實驗動物倫理學要求。

1.1.2主要試劑與儀器 咖啡因(上海融禾醫藥科技有限公司),DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶/EDTA消化液(美國Gibco公司),CCK-8細胞增殖試劑盒(大連美侖技術有限公司),堿性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色試劑盒、茜素紅染色液(北京索萊寶科技有限公司),DNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司),ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司),Anti-DNMT1 Rabbit pAb(武漢菲恩生物科技有限公司),Anti-TET2 Rabbit pAb(江蘇親科生物研究中心有限公司),Goat anti-Rabbit IgG(武漢三鷹生物技術有限公司);超凈工作臺(蘇州億達凈化鋼結構工程有限公司),超級酶標儀(美國Thermo Fisher公司),PowerPacTMBasic電泳儀、Mini-Protean Tetra小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot轉印(濕轉)槽、凝膠成像系統ChemiDocTMARS+(美國Bio-Rad公司)。

1.2 研究方法

1.2.1細胞提取及培養 將新出生72 h內的SD大鼠在深麻狀態下頸椎脫臼處死,無菌操作分離出SD大鼠的顱蓋骨,剔除組織,用1×PBS反復沖洗顱蓋骨至白色,將顱蓋骨剪成小骨片;在小骨片中加入0.25%胰蛋白酶液37 ℃消化30 min、1×PBS洗滌、加入Ⅱ型膠原酶液37 ℃消化3 h,消化液用篩網(70 μm)過濾、收集上清液、離心后棄上清液、1×PBS洗滌沉淀,采用含10% FBS DMEM培養基重懸細胞并計數;計數后以1×105個/mL的細胞密度接種于6 cm培養皿中,置于37 ℃、5%CO2培養箱內進行細胞培養,待細胞生長至80%左右進行細胞傳代,并采用差異貼壁法純化成骨細胞;采用第3代成骨細胞進行實驗。

1.2.2大鼠成骨細胞的鑒定 取大鼠第3代成骨細胞以2.5×104個/mL接種于12孔板中,倒置顯微鏡觀察成骨細胞形態和生長情況,定期拍照記錄;培養3 d后,采用改良鈣鈷法對成骨細胞進行ALP染色,待細胞生長至90%左右吸去培養液,1×PBS沖洗、丙酮(4 ℃預冷)固定10 min、1×PBS清洗,加入ALP孵化液37 ℃孵化1 h、加入2%硝酸鈷孵化5 min、1%硫化胺孵化1 min、無水乙醇脫水后在顯微鏡下觀察染色結果;采用茜素紅法對成骨細胞礦化結節染色,接種24 h細胞貼壁后改換礦化培養液,每2 d進行換液,待細胞生長至90%左右后吸去培養液,無菌蒸餾水沖洗細胞、無水乙醇固定20 min、無菌蒸餾水清洗后,加入0.1%茜素紅染液37 ℃孵育30 min、無菌蒸餾水沖洗、晾干,顯微鏡觀察礦化結節的染色結果。

1.2.3分組與成骨細胞代謝活力 取第3代成骨細胞以1×104個/mL接種于96孔培養板中,37 ℃、5%CO2培養箱中貼壁培養48 h;本研究劑量設計參考文獻[16],采用0.00、0.13、0.25、0.50、1.00、2.00及4.00 mmol/L咖啡因分別作用24 h及48 h,通過CCK-8實驗,篩出0.00、0.25、0.50、1.00、2.00 mmo/L咖啡因處理48 h后成骨細胞代謝活力強,最后確定0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因分別處理成骨細胞48 h后得到本次實驗的5個組。按照CCK-8試劑盒說明書檢測細胞代謝活力,酶標儀檢測在450 nm處的吸光度(OD)值,結果計算公式為:細胞活力(%)=(實驗孔OD值-空白孔OD值)/(對照孔OD值-空白孔OD值)×100%。

1.2.4ALP活力和骨鈣素(bone clearing calcium,BGP)含量 取第3代成骨細胞以2.5×104個/mL接種于12孔板中,37 ℃、5%CO2培養箱中貼壁培養48 h,用0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因處理成骨細胞48 h,收集細胞培養液,離心后取上清,按ALP活性測定試劑盒說明書檢測成骨細胞中ALP活力,按BGP的ELISA試劑盒說明書檢測成骨細胞中BGP的含量。

1.2.5DNMT1和TET2蛋白表達 取第3代成骨細胞以1×105個/mL接種于6 cm培養皿,37 ℃、5%CO2培養箱中貼壁培養,待細胞密度達50%時,以0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因處理成骨細胞48 h;棄培養液、1×PBS清洗細胞3次、棄1×PBS并根據細胞的數量加入蛋白裂解液(RIPA∶蛋白酶抑制劑=100∶1)冰上裂解1 h,收集細胞裂解液于EP管中,15 000 r/min離心15 min;BCA蛋白定量試劑盒檢測上清液中蛋白的濃度,加入5×Loading Buffer緩沖液,100 ℃煮沸蛋白10 min變性蛋白,將蛋白樣本加至8%SDS-PAGE凝膠中,60 V電泳30 min,調整電壓為120 V電泳1 h,切下目標蛋白TET2和DNMT1所在部位的凝膠,冰上300 mA恒流分別轉膜 90 min(TET2)和180 min(DNMT1),5%脫脂奶粉封閉2 h,一抗(DNMT1稀釋比例為1∶500、TET2稀釋比例為1∶500、β-actin稀釋比例為1∶2 000)4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育2 h(兔抗比例為1∶10 000),ECL顯影,使用多功能成像儀曝光、采圖,使用Image J軟件進行半定量分析,重復3次。

1.2.65-mC和5-hmC水平 取第3代成骨細胞以1×105個/mL接種于6 cm培養皿,置于37 ℃、5%CO2培養箱中貼壁培養48 h,以0.00、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L咖啡因處理成骨細胞48 h,收集成骨細胞,DNA提取試劑盒提取成骨細胞DNA,按5-mC和5-hmC的ELISA試劑盒說明書檢測成骨細胞DNA中5-mC和5-hmC水平。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 大鼠成骨細胞鑒定

倒置顯微鏡下觀察可見未染色的大鼠成骨細胞充分伸展,呈梭形、三角形或不規則多邊形;ALP染色結果顯示成骨細胞呈現多邊形并有長突起,成骨細胞胞膜及胞漿內顆粒染色呈紫黑色;茜素紅染色結果顯示成骨細胞有大量礦化結節,鈣結節被染成橘紅色。見圖1。

2.2 成骨細胞代謝活力

CCK-8結果如表1所示:與0.00 mmol/L組比較,0.25、0.50 mmol/L咖啡因組大鼠的成骨細胞代謝活力增加,1.00、2.00 mmol/L咖啡因組大鼠的成骨細胞代謝活力降低,差異均有統計學意義(P<0.05),提示低濃度咖啡因促進成骨細胞代謝活力,高濃度咖啡抑制成骨細胞代謝活力,隨劑量的增加對細胞代謝活力的抑制逐漸增強。

表1 不同劑量咖啡因對大鼠成骨細胞代謝活力的影響Tab.1 Effect of different doses of caffeine on the metabolic viability of rat osteoblasts

2.3 成骨細胞ALP活性及BGP含量

結果如表2所示:與0.00 mmol/L組比較,0.50 mmol/L咖啡因組大鼠的成骨細胞中ALP活性和BGP含量升高;2.00 mmol/L咖啡因組大鼠的成骨細胞中ALP活性及BGP含量降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示低濃度咖啡因促進成骨細胞骨標志物的表達,高濃度咖啡抑制成骨細胞骨標志物的表達。

表2 不同劑量咖啡因對大鼠成骨細胞ALP活性及BGP含量的影響Tab.2 Effect of different doses of caffeine on ALP activity and BGP content in rat

2.4 成骨細胞DNMT1、TET2 蛋白表達

Western blot結果顯示:與0.00 mmol/L組比較,0.50 mmol/L咖啡因組大鼠的成骨細胞中DNMT1蛋白表達降低,TET2蛋白表達增加(P<0.05);2.00 mmol/L咖啡因組大鼠的成骨細胞中DNMT1蛋白表達增加,TET2蛋白表達降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示低濃度咖啡因抑制大鼠成骨細胞DNMT1蛋白表達,促進TET2蛋白表達,高濃度咖啡因促進大鼠成骨細胞DNMT1蛋白表達,抑制TET2蛋白表達。見圖2。

注：A為蛋白條帶圖,B為蛋白表達水平;與0.00 mmol/L組比較,(1)P<0.05,(2)P<0.01。

2.5 成骨細胞5-mC及5-hmC含量

ELISA結果如表3所示:與0.00 mmol/L組比較,0.25、0.50 mmol/L咖啡因組大鼠成骨細胞中5-mC含量降低,5-hmC增加,差異均有統計學意義(P<0.05);1.00、2.00 mmol/L咖啡因組大鼠成骨細胞中5-mC增加,5-hmC降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。提示低劑量咖啡因降低大鼠成骨細胞中整體DNA甲基化水平,增加整體DNA羥甲基化水平;高劑量咖啡因增加大鼠成骨細胞中整體DNA甲基化水平,降低整體DNA羥甲基化水平。

表3 不同劑量咖啡因對大鼠成骨細胞5-mC及5-hmC水平的影響Tab.3 Effect of different doses of caffeine on 5-mC and 5-hmC levels in rat

3 討論

現代生活中,咖啡因作為一種常見的神經興奮劑,已被廣泛應用于各個領域,咖啡因與健康的關系密不可分。研究表明,長期大量攝入咖啡因可能對骨的發育和健康產生負面影響[17]。動物實驗證明低劑量咖啡因加快骨轉化,成骨細胞活躍,促進骨代謝;高劑量咖啡因抑制成骨過程,抑制骨代謝[18]。細胞實驗同樣顯示,低劑量的咖啡因可促進成骨細胞的增殖,高劑量的咖啡因則抑制成骨細胞增殖甚至加快成骨細胞的凋亡[19]。本研究發現低劑量咖啡因處理成骨細胞48 h后,成骨細胞代謝活力增強;高劑量咖啡因處理成骨細胞48 h后,成骨細胞代謝活力降低,且隨劑量的增加對細胞代謝活力的抑制逐漸增強。這表明,高劑量的咖啡因可以抑制大鼠成骨細胞的代謝活力,可能影響骨的生長和發育。

ALP是成骨細胞主要功能活性酶,與骨組織的新陳代謝密切相關,是成骨細胞重要的標志物之一。在骨組織新生階段,ALP能促進成骨細胞產生和分泌蛋白質,這些蛋白質沉積在骨基質內,增強其結構和穩定性。不同濃度咖啡因處理成骨細胞48 h后,低劑量的咖啡因升高成骨細胞ALP活性和BGP含量;高劑量的咖啡因降低成骨細胞ALP活性和BGP含量。Su等[20]研究發現在咖啡因刺激下,成骨細胞中ALP和骨保護素表達異常,低劑量咖啡因對成骨細胞活力和ALP活性影響不明顯,高劑量咖啡因可導致成骨細胞活力降低甚至凋亡,可抑制成骨細胞分化、骨礦化和細胞外基質的形成。這一結果與我們的研究結果一致。

DNA 甲基化和羥甲基化為目前表觀遺傳學的重要組成部分,哺乳動物DNA甲基化轉移酶包含DNMT1、DNMT2、DNMT3A、DNMT3B和DNMT3L,其中DNMT1是DNMTs中最重要、目前研究最多的一種,主要參與基因組DNA甲基化模式的維持,被稱作維持甲基化酶[21-22]。DNA去甲基化是整體DNA甲基化動態平衡的重要部分,在DNA主動去甲基化過程中,去甲基化酶TET蛋白占據核心地位,TET蛋白有3種亞型,分別為TET1, TET2和TET3,其中TET2是骨生成的啟動子,直接影響成骨相關基因5-hmC的水平[23-25]。DNA甲基化的動態平衡受到DNA甲基化和去甲基化的影響,進一步檢測不同濃度咖啡因處理大鼠成骨細胞后DNMT1和TET2蛋白的表達及5-mC和5-hmC含量的變化,低劑量咖啡因暴露的大鼠成骨細胞中DNMT1蛋白表達和5-mC含量降低,TET2蛋白表達和5-hmC含量增加;高劑量咖啡因暴露的成骨細胞中DNMT1蛋白表達和5-mC含量增加,TET2蛋白表達和5-hmC含量降低。上述結果顯示低劑量咖啡因可降低成骨細胞整體DNA甲基化水平,增加了整體DNA羥甲基化水平;高劑量咖啡因可增加成骨細胞整體DNA甲基化水平,降低了整體DNA羥甲基化水平。有研究報道,骨組織Runt相關轉錄因子2基因的高甲基化與骨質疏松的發生發展有關[26],我們推測高劑量咖啡因增加整體DNA甲基化水平可能與咖啡因增加骨質疏松患病風險有關,有待于后續深入研究。

綜上,本研究發現低劑量咖啡因促進成骨細胞代謝活力,促進DNA羥甲基化降低整體DNA甲基化水平;高劑量咖啡因抑制成骨細胞代謝活力,抑制DNA羥甲基化增加整體DNA甲基化水平。該研究結果為識別咖啡因對骨組織的危害、以及科學飲用咖啡因相關飲料提供了科學依據。