木犀草素、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A和黃芪皂苷Ⅰ單用及聯(lián)用對(duì)人肝星狀細(xì)胞株LX-2增殖、活化的影響*

陸倩, 張金娟, 蔣先慧, 國(guó)小利, 廖尚高,3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550025; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心/貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴州 貴陽(yáng) 550004)

肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是各種急慢性肝損傷引起的以炎癥反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)在肝臟中過(guò)度累積為主要損傷修復(fù)特點(diǎn)的病理過(guò)程[1],是各種慢性肝病向肝硬化乃至肝癌發(fā)展的中間環(huán)節(jié)[2]。HF的逆轉(zhuǎn)可有效降低肝癌的發(fā)生率[3],但目前臨床尚無(wú)有效的抗HF藥物[4]。故尋找安全有效的HF治療方法及藥物成為臨床急需解決的重要問(wèn)題。HF的發(fā)展是多基因、多步驟作用的過(guò)程,中藥可從多途徑、多靶點(diǎn)發(fā)揮作用,在抗HF方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[5-6]。與此同時(shí),中醫(yī)中藥有著完備的理論體系和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn),故從中藥資源寶庫(kù)中尋找抗HF藥物不失為一種有效途徑。韋凌霞等[7]收集臨床治療HF的含當(dāng)歸中藥復(fù)方,并對(duì)頻數(shù)>10的中藥進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析,發(fā)現(xiàn)丹參、當(dāng)歸、黃芪累計(jì)頻次最高且聚為一類;此外,丹參、當(dāng)歸和黃芪存在于多種治療HF的復(fù)方中,且占比較大,如扶肝化纖湯、復(fù)原化纖湯等[8]。課題組前期通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)丹參、當(dāng)歸和黃芪的抗HF成分及其作用機(jī)制進(jìn)行分析,結(jié)果顯示木犀草素(luteolin, Lut)、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A(levistilide a, Lev)及黃芪皂苷Ⅰ(astragaloside Ⅰ, Ast)分別為丹參、當(dāng)歸和黃芪中的潛在核心抗HF活性成分;進(jìn)一步對(duì)Lut、Lev及Ast的潛在抗HF靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析,發(fā)現(xiàn)3者既存在相同的抗HF靶點(diǎn)及通路,也存在不同的靶點(diǎn)及通路,并且均與促纖維化因子(transforming growth factor-β1,TGF-β1)相關(guān);故而推測(cè)Lut、Lev及Ast 3個(gè)核心活性成分聯(lián)用可能會(huì)產(chǎn)生協(xié)同抗HF作用。LX-2細(xì)胞是永生化的人肝星狀細(xì)胞系,因其高轉(zhuǎn)染性和在無(wú)血清培養(yǎng)基中的高生存能力被廣泛用于體外HF的研究[9]。本研究擬考察Lut、Lev及Ast單用及聯(lián)用對(duì)LX-2細(xì)胞增殖、活化的影響,以期為L(zhǎng)ut、Lev和Ast聯(lián)用治療HF提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人肝星狀細(xì)胞株LX-2,(廣州吉尼歐有限公司),Lut、Lev和Ase(成都埃法),DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco),0.25%胰蛋白酶(武漢賽維爾),胎牛血清(加拿大維森特),二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、噻唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)試劑(北京索萊寶),α-smooth actin(α-SMA,南京巴傲得),TGF-β1(武漢愛(ài)博泰克),甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH;上海優(yōu)寧維)。

1.2 主要儀器

MS105DC型梅特勒-托利多十萬(wàn)分之一天平(北京賽多利斯),2001HY-6003型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoFisher Scientific),酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Tek),SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備),DYY-6C型電泳儀(北京六一),TS-8型轉(zhuǎn)移脫色搖床(海門其林貝爾)。

1.3 研究方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) LX-2細(xì)胞使用含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM高糖培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)傳代培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3.2Lut、Lev及Ast對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞增殖的影響及聯(lián)用比例確定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞,以3 500個(gè)/孔接種于96孔板中,細(xì)胞培養(yǎng)24 h,吸棄培養(yǎng)液,加入不含胎牛血清的DMEM饑餓12 h。之后將細(xì)胞分為Con組(完全培養(yǎng)基)、TGF-β1組(10.00 μg/L TGF-β1)、SB431542不同劑量組(10.00 μg/L的TGF-β1分別加6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的SB431542)、Lut不同劑量組(10.00 μg/L TGF-β1分別加6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的Lut)、Lev不同劑量組(10.00 μg/L TGF-β1分別加6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的Lev)、Ast不同劑量組(10.00 μg/L TGF-β1分別加6.25、12.50、25.00、50.00、100.00 μmol/L的Ast),每組6個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞按各自藥物和劑量加藥后培養(yǎng)48 h,吸棄培養(yǎng)液,加入5 g/L MTT溶液20 μL,繼續(xù)孵育4 h,棄盡孔中溶液,每孔加入 DMSO 100 μL,搖床振蕩10 min。以只加完全培養(yǎng)基的孔作為調(diào)零孔,在酶標(biāo)儀上測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(optical density, OD)。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率:細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(ODTGFβ1組-OD實(shí)驗(yàn)組)/(ODTGFβ1組-OD調(diào)零孔)]×100%。使用Graph Pad Prism 8.0.1軟件計(jì)算IC50,以Lut、Lev和Ast的IC50比值作為聯(lián)用的比例。

1.3.3Lut、Lev及Ast聯(lián)用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖的影響 按照“1.3.2”所述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將細(xì)胞分為Con組(完全培養(yǎng)基)、TGF-β1組、SB431542組、聯(lián)用組為10.00 μg/L TGF-β1分別與Lut+Lev、Lut+Ast、Lev+Ast、Lut+Lev+Ast的組合(Lut∶Lev∶Ast=1∶1∶10,以Lut為基準(zhǔn),將濃度設(shè)為0.94、1.88、3.75、7.50、15.00、30.00、60.00 μmol/L)。按照“1.3.2”所述方法測(cè)定OD并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。

1.3.4Lut、Lev及Ast聯(lián)用類型的分析 將Lut、Lev和Ast聯(lián)用比例、濃度及對(duì)應(yīng)的細(xì)胞增殖抑制率輸入到CalcuSyn軟件中,計(jì)算CI值,以CI值分析Lut、Lev和Ast聯(lián)用類型,CI>1為拮抗作用,CI<1為協(xié)同作用,CI=1為加和作用。

1.3.5Western blot檢測(cè)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中α-SMA蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h,吸棄培養(yǎng)液,加入不含胎牛血清的DMEM饑餓12 h。之后將細(xì)胞分為Con組(完全培養(yǎng)基)、TGF-β1組(10.00 μg/L TGF-β1)、SB431542組(10.00 μg/L TGF-β1加15.00 μmol/L的SB431542)、Lut組(10.00 μg/L TGF-β1加15.00 μmol/L的Lut)、Lev組(10.00 μg/L TGF-β1加15.00 μmol/L的Lev)、Ast組(10.00 μg/L TGF-β1與150.00 μmol/L的Ast)、聯(lián)用組(10.00 μg/L TGF-β1分別與Lut+Lev、Lut+Ast、Lev+Ast、Lut+Lev+Ast組合)。各組細(xì)胞按各自藥物和劑量加藥后培養(yǎng)48 h,經(jīng)細(xì)胞蛋白裂解液裂解,BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量。SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳,常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)膜、封閉后,一抗4 ℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜(10.00 min/次、×3次),加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(二抗)室溫孵育2 h,洗膜。用ECL發(fā)光試劑盒顯影,采用Image J軟件分析。以GAPDH灰度值進(jìn)行校正,計(jì)算α-SMA蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3.6Western blot檢測(cè)LX-2細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LX-2細(xì)胞,以2×105個(gè)/孔接種于6孔板中。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,分為Con組(完全培養(yǎng)基)、SB431542組(30.00 μmol/L)、Lut組(30.00 μmol/L)、Lev組(30.00 μmol/L)、Ast組(300.00 μmol/L)、聯(lián)用組為(Lut+Lev、Lut+Ast、Lev+Ast、Lut+Lev+Ast組合)。按照“1.3.5”所述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn),計(jì)算TGF-β1蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Lut、Lev及Ast對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞增殖的影響及聯(lián)用比例確定

與Con組比較,TGF-β1組細(xì)胞增殖明顯(P<0.01);與TGF-β1組比較,各給藥組對(duì)細(xì)胞增殖具有顯著的抑制作用(P<0.01);且抑制率都隨濃度的增加而升高,具有濃度依賴性。Lut、Lev及Ast的IC50分別為38.60、34.40及303.80 μmol/L,確定Lut、Lev及Ast聯(lián)用摩爾比為1∶1∶10。不同劑量藥物組細(xì)胞存活率見(jiàn)圖1。

注：A～D分別為不同濃度SB431542、Lut、Lev及Ast組LX-2細(xì)胞存活率;(1)與Con組比較,P<0.01;(2)與TGF-β1組比較,P<0.01。

2.2 Lut、Lev及Ast聯(lián)用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖的影響

各藥物聯(lián)用組細(xì)胞增殖抑制率如圖2所示。Lut+Lev+Ast組在0.94～60.00 μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率高于Lut+Lev、Lut+Ast和Lev+Ast組;Lut+Lev組在0.94～15.00 μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率低于Lut+Ast組,在15.00～60.00 μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率高于Lut+Ast組;Lev+Ast組在0.94～60.00 μmol/L范圍內(nèi)細(xì)胞增殖抑制率高于Lut+Lev和Lut+Ast組。

圖2 Lut、Lev和Ast聯(lián)用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effect of Lut, Lev and Ast on the proliferation of TGF-β1-induced LX-2 cells

2.3 Lut、Lev和Ast聯(lián)用類型的分析

結(jié)果顯示,Lev+Ast組在細(xì)胞增殖抑制率>40%時(shí)的CI<1,Lut+Ast、Lut+Lev組在不同細(xì)胞增殖抑制率下CI≥1,3者聯(lián)用組在細(xì)胞增殖抑制率>15%時(shí)CI<1,表明Lut、Lev和Ast聯(lián)用在細(xì)胞增殖抑制率>15%時(shí)具有協(xié)同增效作用;初步確定3者聯(lián)合使用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞的增殖具有協(xié)同抑制作用。Lut、Lev和Ast聯(lián)用的CI見(jiàn)圖3。

注：Fa為細(xì)胞增殖抑制率,CI為聯(lián)合指數(shù)。

2.4 α-SMA蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞中α-SMA蛋白表達(dá)結(jié)果如圖4所示,與Con組比較,TGF-β1組α-SMA蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與TGF-β1組相比,各給藥組的α-SMA蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01);其中3者聯(lián)用組的α-SMA蛋白表達(dá)較其他組均降低更顯著(P<0.05),提示Lut、Lev及Ast聯(lián)用可抑制LX-2細(xì)胞的活化。

注：A 為L(zhǎng)ut、Lev、Ast單用及聯(lián)用時(shí)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中α-SMA蛋白條帶圖,B為相對(duì)表達(dá)量;(1)與Con組比較,P<0.01;與TGF-β1組比較,(2)P<0.05,(3)P<0.01。

2.5 TGF-β1蛋白表達(dá)

各組細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)結(jié)果如圖5所示,與Con組比較,各給藥組TGF-β1蛋白表達(dá)均降低(P<0.05),3者聯(lián)用組細(xì)胞中TGF-β1蛋白表達(dá)較其他給藥組降低更顯著(P<0.01);提示Lut、Lev和Ast聯(lián)用對(duì)LX-2細(xì)胞增殖、活化的協(xié)同抑制作用可能與下調(diào)TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)。

注：A 為L(zhǎng)ut、Lev、Ast單用及聯(lián)用時(shí)LX-2細(xì)胞中TGF-β1蛋白條帶圖,B為相對(duì)表達(dá)量;與Con組比較(1)P<0.01,(2)P<0.05。

3 討論

肝組織ECM的異常沉積會(huì)導(dǎo)致肝正常的結(jié)構(gòu)和功能被破壞,是HF病理過(guò)程中的特征性改變[10-11]。在生理情況下,ECM的合成與降解是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程,由肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞等多種細(xì)胞調(diào)控,其中肝星狀細(xì)胞被認(rèn)為是ECM的主要來(lái)源[12]。正常肝組織中的肝星狀細(xì)胞處于靜息狀態(tài),是儲(chǔ)存維生素A和類視黃醇的主要細(xì)胞;當(dāng)肝臟受損時(shí),靜息的肝星狀細(xì)胞被激活,迅速增殖產(chǎn)生大量ECM,打破原有的合成與降解平衡,從而引起肝組織結(jié)構(gòu)重建進(jìn)而促進(jìn)HF的發(fā)生[13]。TGF-β1是迄今為止作用最強(qiáng)的促纖維化細(xì)胞因子之一,在纖維化進(jìn)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[14];體外實(shí)驗(yàn)常用TGF-β1誘導(dǎo)LX-2細(xì)胞使其活化,建立HF細(xì)胞模型從而開(kāi)展實(shí)驗(yàn)研究[15-16]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法考察了Lut、Lev和Ast單用及聯(lián)用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果顯示,3者單用及聯(lián)用均能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞的增殖,且聯(lián)用作用更為突出,并呈濃度依賴。

目前,用于評(píng)估藥物聯(lián)用類型的方法主要有Chou-Talalay組合指數(shù)法、等效線圖分析和曲線位移分析等[17];其中Chou-Talalay組合指數(shù)法是根據(jù)中效方程計(jì)算單用及聯(lián)合用藥在各種抑制率時(shí)的中效濃度,能夠在給定的抑制率水平下對(duì)藥物聯(lián)用影響療效的合理性提供量化指標(biāo)[18],該方法應(yīng)用最為廣泛。為了消除計(jì)算過(guò)程中的主觀評(píng)價(jià)和實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)自動(dòng)分析,該方法被整合到軟件程序(CalcuSyn)中,現(xiàn)在廣泛用于生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的研究;CalcuSyn軟件通常建議以IC50或半數(shù)有效量(half maximal effective dose, ED50)為恒定比例進(jìn)行聯(lián)合用藥[19]。為了探討Lut、Lev和Ast聯(lián)用是否具有協(xié)同作用,本研究采用CalcuSyn軟件進(jìn)行分析,通過(guò)Graph Pad Prism8.0.1軟件計(jì)算IC50,以IC50作為藥物聯(lián)合的恒定比例進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示,3者聯(lián)用在細(xì)胞增殖抑制率大于15%時(shí)CI<1,證實(shí)Lut、Lev和Ast聯(lián)用對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞的增殖具有協(xié)同增效的抑制作用。α-SMA在肝星狀細(xì)胞被激活時(shí)表達(dá)上調(diào),被認(rèn)為是肝星狀細(xì)胞激活的標(biāo)志,其表達(dá)水平與肝臟的纖維化程度呈正相關(guān)[20-21]。本實(shí)驗(yàn)研究顯示,Lut、Lev和Ast聯(lián)用能夠顯著下調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞中α-SMA 蛋白的表達(dá),提示3者聯(lián)用能抑制肝星狀細(xì)胞的激活。TGF-β1/Smad信號(hào)通路是介導(dǎo)肝星狀細(xì)胞激活、促進(jìn)肝星狀細(xì)胞增殖和產(chǎn)生ECM的主要信號(hào)通路,在HF的進(jìn)程中發(fā)揮著較為關(guān)鍵的作用,阻斷TGF-β1/Smad信號(hào)通路,對(duì)HF的治療有重要意義[22]。本研究結(jié)果顯示,Lut、Lev和Ast聯(lián)用能夠顯著下調(diào)LX-2細(xì)胞中TGF-β1蛋白的表達(dá),提示3者聯(lián)用抑制LX-2細(xì)胞增殖、活化的協(xié)同增效的作用可能與下調(diào)肝星狀細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)。

綜上所述,Lut、Lev和Ast單用及聯(lián)用均能抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞的增殖、活化,其中3者聯(lián)用抑制作用最強(qiáng),且具有協(xié)同增效的作用,這種抑制作用可能與下調(diào)肝星狀細(xì)胞TGF-β1蛋白表達(dá)有關(guān)。本研究為L(zhǎng)ut、Lev和Ast聯(lián)用治療HF提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。